Введение к работе
Актуальность исследования
Проблема быстрой и точной диагностики инфекционных болезней имеет чрезвычайно важное значение для современного общества. Многие инфекционные заболевания представляют угрозу для жизни и здоровья не только для конкретного индивидуума, но для всего общества. Быстрое и не контролируемое распространение инфекционных заболеваний может привести к развитию эпидемии или даже пандемии в течение весьма короткого периода времени. В последние годы вспышки короновирусной инфекции, птичьего гриппа, пандемического вируса гриппа H1N1 подтверждают крайне высокую значимость борьбы с инфекционными заболеваниями в современном мире (X.Y. Che et al., 2004; Q. He et al., 2007; А.А. Кущ и др., 2008).
Важнейшей составляющей борьбы с инфекционными заболеваниями является своевременная их диагностика. В настоящее время развиваются два основных подхода в диагностике инфекционных заболеваний. Генетическая диагностика, основанная на выявлении нуклеиновой кислоты возбудителя, и иммунодиагностика, базирующаяся на выявление специфических антигенов и антител, являются взаимодополняющими методическими подходами. Следовательно, крайне важно развивать оба эти направления исследований. Сложность проблемы состоит в том, что в настоящее время известны тысячи опасных инфекционных заболеваний, которые могут поражать сельскохозяйственные растения, домашних животных и человека. Кроме того, постоянно возникают новые, неизвестные инфекционные заболевания. По данных Международного таксономического вирусологического комитета только в последние годы зарегистрировано несколько сотен вновь открытых вирусных агентов. Открытие каждого нового возбудителя требует разработки методов их диагностики, причем эпидемическая значимость некоторых из них требует проведения этих исследований в самые кратчайшие сроки. Проблема усложняется тем, что постоянно возникают лекарственно устойчивые варианты возбудителей, многие вирусные агенты чрезвычайно быстро изменяются. Высокая патогенность многих вирусов также чрезвычайно усложняет экспериментальные работы по созданию новых методов диагностики. Вследствие этого, необходимо постоянное развитие и совершенствование биотехнологической базы для точной и своевременной диагностики инфекционных заболеваний.
Для совершенствования диагностики инфекций используют два основных подхода. Это технологии получения моноклональных антител (МКА) и рекомбинантных антигенов. Гибридомная технология позволяет создать уникальную биотехнологическую базу в виде препаратов МКА для исследования вирусных и бактериальных патогенов, опухолевых маркеров, гормонов, цитокинов, интерлейкинов, прионов, токсинов, аллергенов.
В настоящее время МКА все шире входят в повседневную практику научных лабораторий, активно используются для конструирования и производство высокоспецифичных тест-систем и все шире применяются в практической медицине. Использование рекомбинантных антигенов также позволяет совершенствовать иммунодиагностику, причем важно заметить, оба этих подхода позволяют фактически прекратить использование высокопатогенных инфекционных агентов при производстве тест систем. Другим важнейшим преимуществом данного подхода является возможность стандартизации качества новых иммунодиагностических систем и появление возможности обеспечивать производство иммунодиагностических тест систем необходимыми биологическими компонентами, антителами и антигенами, в течение неопределенно длительного времени.
Высокопатогенные филовирусы Марбург и Эбола чрезвычайно опасны для человека и общества, они могут использоваться с террористическими целями. Эпидемическая важность этих агентов основана на способности этих вирусов распространяться через прямой контакт с биологическими жидкостями и воздушно-капельным путем (О.В. Пьянков, 1993; М.Ю. Луб и др., 1995; E. Johson et al., 1995). В настоящее время в России нет коммерчески доступных ИФА тест-систем для быстрого выявления антител и антигенов филовирусов.
Характерной особенностью филовирусных инфекций является раннее появление вирусных антигенов в тканях, выделениях и сыворотке крови инфицированных животных и заболевших людей (Н.В. Кизимов и др., 1993; Н.В. Мерзликин и др., 1995; A.K. Rowe, 1999; Т.С. Чепурнова и др., 2000). Эта особенность развития заболевания делает высокоэффективными методы иммунологической диагностики, основанные на раннем выявлении вирусных антигенов в биологических жидкостях человека и животных. Препараты очищенных МКА могут служить основой ИФА тест-системы самостоятельно или как подтверждающий тест к ПЦР-диагностике (J.S. Towner et al., 2004).
Вспышка 1999 г. в Волгоградской, Астраханской областях и Краснодарском крае лихорадки Западного Нила (ЛЗН), которая считалась эндемичной для тропических и субтропических стран, привлекла внимание к проблеме диагностики этой инфекции и потребовала быстрейшей ее разработки в нашей стране (Д.К. Львов и др., 2000). Тем более, что позднее появились сообщения о циркуляции вируса Западного Нила (ВЗН) в птицах, комарах и клещах от Белоруссии до Приморского края, в Закавказье, бассейне Каспийского моря, республиках средней Азии, в Сибири (Д.К. Львов, 2000, В.А. Терновой и др., 2004; В.А. Терновой и др., 2006). ВЗН передается теплокровным (людям, лошадям, птицам) через укус комаров, клещей и москитов. В США зафиксированы случаи, когда ЛЗН развивалась у реципиентов после переливания крови (T. Harrington, 2003). ЛЗН особенно опасна для пожилых людей, у которых может развиться миокардит, менингит и менингоэнцефалит, что приводит к 10 %-ной летальности среди заболевших (E. Flatau et al., 1981). События 2010 г. на юге России, где снова возникла большая вспышка лихорадки Западного Нила, подтвердили значимость настоящего исследования и практическое использование разработанных тест систем обеспечило необходимые условия для борьбы с этой инфекцией в России.
Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ), вызываемая вирусом герпеса человека 5 типа (ВГЧ-5) - широко распространенное заболевание повсеместно во всех географических зонах, странах и социально-экономических группах (C.A. Alford et al., 1981). Главной биологической особенностью ВГЧ-5 является его пожизненное персистирование в организме человека и реактивация при снижении иммунитета. Заражение происходит разными путями: воздушно – капельным и при тесном контакте (в том числе и половом) через биологические жидкости, трансплацентарно (от матери к плоду) и интранатально во время родов при прохождении плода через инфицированные родовые пути женщины, при кормлении ребенка грудным молоком (C.A. Alford et al., 1990). Подтверждены факты инфицирования людей при трансплантации органов (почек, печени и костного мозга) (S. Chou, 1986; E. Meijer et al., 2003; R.R. Razonable, 2008). ВГЧ-5 вызывает генерализованную инфекцию у больных СПИД, что является причиной их гибели (G. Nigro et al., 1996). Сложность диагностики связана с проблемами персистирования этого вируса в клетках организма и необходимостью выявления вирусных антигенов именно в инфицированных клетках. В настоящее время присутствие на мембранах периферических лейкоцитов матриксного фосфопротеина pp65 и секреторного р72 ВГЧ-5 принято считать одним из основных критериев острой ЦМВИ. Получение отечественной панели МКА, специфичных к белку рр65, помогло бы улучшить ситуацию с диагностированием острой ЦМВИ у инфицированных людей.
Цель работы: разработка биотехнологической базы для совершенствования иммунодиагностики инфекций, вызываемых вирусами Марбург, Эбола, Западного Нила и герпесом человека 5 типа (цитомегаловирусом).
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Получить представительные коллекции гибридом, продуцирующих моноклональные антитела (МКА), специфичные к белкам филовирусов Марбург и Эбола, вируса Западного Нила (ВЗН) и вируса герпеса человека 5 типа (ВГЧ-5).
-
Исследовать иммунохимические свойства МКА к структурным белкам вирусов Марбург, Эбола, ВЗН и ВГЧ-5 и оценить возможность их использования для конструирования иммунодиагностических тест систем на основе МКА.
-
Сконструировать рекомбинантные плазмиды, кодирующие полноразмерные гены нуклеопротеина вируса Эбола и матриксных белков VP40 вирусов Марбург и Эбола и получить полноразмерные рекомбинантные белки.
-
Исследовать антигенную структуру природных и рекомбинантных белков вирусов Марбург и Эбола с помощью панелей противовирусных поликлональных антител и гибридомных МКА с целью оценки возможности использования рекомбинантных антигенов для разработки иммунодиагностических тест систем.
-
С использованием полученных МКА и рекомбинантных антигенов сконструировать новое поколение иммуноферментных систем для детекции антигенов вирусов Эбола и Марбург в биологических пробах.
-
С использованием МКА, специфичных к белку Е вируса Западного Нила, сконструировать лабораторный вариант экспериментальной ИФА тест-системы для выявления вирусного антигена, оценить его специфичность и чувствительность. Организовать коммерческий выпуск новой тест системы на основе МКА для широкого апробирования на практике.
-
Исследовать возможность использования МКА специфичных к белку рр65 ВГЧ-5 для диагностики острой и персистентной цитомегаловирусной инфекции на культурах клеток.
Научная новизна
Получены оригинальные и представительные коллекции гибридных клеток - продуцентов МКА и панели МКА к антигенам вирусов Марбург, Эбола, ВЗН и ВГЧ-5.
Исследование иммунохимических свойств представительной панели гибридомных МКА показало, что полученные панели МКА к антигенам вирусов Марбург, Эбола, ВЗН и ВГЧ-5 могут быть использованы для научных исследований и для конструирования нового поколения иммунодиагностических тест систем на основе этих антител.
Получены оригинальные рекомбинантные белки гликопротеин (GP), нуклеопротеин (NP), VP40, VP35, VP24 вируса Марбург и белки NP, VP40, VP35 вируса Эбола. Исследование антигенных свойств рекомбинантных белков показало их иммунохимическую полноценность, что позволяет их использовать при конструировании тест систем на эти инфекции.
В результате проведенных исследований, с использованием оригинальных препаратов МКА, а также рекомбинантных антигенов филовирусов, сконструированы новые диагностические лабораторные тест системы для выявления антигенов вирусов Марбург и Эбола. Новизна и приоритет данной разработки подтверждена получением четырех патентов РФ (патенты № 2395575, № 2393220, № 2395576, № 2395577)
Исследование панели вируснейтрализующих МКА к белку Е вируса Западного Нила (LEIV-VLG99-27889-human) позволило обнаружить два вида МКА 9Е2 и 5Н6 пригодных для конструирования иммуноферментной тест системы для детекции антигена в биологических пробах.
Показана способность различных видов МКА, полученных к рекомбинантному белку рр65 ВГЧ-5, выявлять в иммуноблоттинге вирусный белок рр65. Иммуноцитохимическим методом показана способность МКА, специфичных к рекомбинантному белку рр65, выявлять вирусный белок рр65 в монослое клеток Vero, персистентно инфицированных цитомегаловирусом человека.
Практическая ценность работы
С использованием созданных панелей МКА к различным вирусным патогенам, в том числе высокопатогенным вирусам Марбург и Эбола, и набора рекомбинантных белков, созданы новые лабораторные образцы иммунодиагностических наборов. Это наборы для выявления белка VP40 вируса Марбург методом двухцентрового ИФА с использованием двух типов неконкурирующих МКА 7D8 и 7H10; наборы для выявления белка VP35 вируса Марбург при помощи иммуноферментного анализа на основе одного типа МКА 3F9; наборы для выявления нуклеопротеина вируса Эбола методом двухцентрового ИФА с использованием двух типов оригинальных МКА 1В2 (мышиного происхождения) и 7В11 (крысиного происхождения); наборы для выявления белка VP40 вируса Эбола на основе двухцентрового ИФА и двух типов оригинальных МКА 4А2 и 1С1. Каждая из четырех разработанных конструкций тест-системы защищена патентом РФ (№ 2393220, № 2395575, № 2395576, № 2395577).
Сконструированы рекомбинантные плазмиды, кодирующие полноразмерные гены нуклеопротеина вируса Эбола и матриксные белки VP40 вирусов Марбург и Эбола, что позволяет нарабатывать соответствующие рекомбинантные белки филовирусов для практического использования, конструирования различных типов иммунобиологических препаратов. Данные белки могут также использоваться для конструирования вакцин и исследования иммунологии и патогенеза филовирусных инфекций. Важно отметить, что предложенный биотехнологический подход позволяет получать антигены филовирусов без использования лаборатории BSL-4 уровня и высокопатогенных вирусов Марбург и Эбола.
Практическая ценность оригинальной коллекции из 24 мышиных гибридом, секретирующих МКА к вирусу Западного Нила (российский штамм LEIV-VLG99-27889-human) состоит в том, что МКА, секретируемые этими клетками - продуцентами, обладают вируснейтрализующей активностью в отношении различных штаммов ВЗН. Это позволяет использовать данные МКА для конструирования нового поколения иммунотерапевтических препаратов для лечения лихорадки Западного Нила. Это возможность была продемонстрирована в создании нового метода генной терапии лихорадки Западного Нила с использованием гена МКА 9Е2 (А.V. Pereboev et al., 2007).
Разработанная лабораторная тест-система ИФА в формате “сэндвич” на основе пары МКА (9Е2 и 5Н6) позволила создать совместно с ЗАО “Вектор-Бест” экспериментальную тест-систему ИФА “ВектоНил–антиген” для выявления антигена вируса Западного Нила в полевых материалах и организовать ее производство. Данная система успешно производиться более четырех лет и используется в практическом здравоохранении. В настоящее время на основе этих же МКА 9Е2, используемых в качестве “подложки” для антигена, также выпускает тест-система ИФА для выявления специфических антител класса IgG против вируса Западного Нила (“ВектоНил-IgG”) и тест-система ИФА для определения индекса авидности антител класса IgG, специфичных к вирусу Западного Нила (“ВектоНил-IgG-авидность”).
Получены 11 оригинальных мышиных гибридных клеточных линий, продуцирующих МКА, специфичные к рекомбинантному белку рр65 ВГЧ-5. МКА, специфичные к рекомбинантному белку рр65 ВГЧ-5, были успешно использованы для выявления вирусного белка рр65 – маркера острой цитомегаловирусной инфекции. Штамм гибридных клеток животного Mus Musculus L. 5F10, используемый для получения высокоспецифичных МКА 5F10, защищен патентом РФ № 2393219. Одноименные МКА могут стать основой для совершенствования диагностики этой инфекции у человека, что чрезвычайно важно в практическом здравоохранении.
Получение панелей МКА и набора рекомбинантных антигенов в рамках настоящей работы позволяет говорить, что удалось создать биотехнологическую базу для совершенствования иммунодиагностики инфекций, вызываемых вирусами Марбург, Эбола, Западного Нила и герпесом человека 5 типа. Помимо использования этих иммунобиологических препаратов для разработки нового поколения иммунодиагностических тест систем возможно их использование для исследовательских целей. Важно подчеркнуть, что рекомбинантные антигены и МКА представляют собой стандартные препараты, которые могут храниться очень долго. Плазмиды и гибридные клетки могут обеспечивать наработку этих биореагентов в необходимых количествах на протяжение неограниченного времени без использования патогенных и высокопатогенных вирусных агентов.
В представляемой диссертационной работе на защиту выносятся следующие положения:
1. Панель МКА (мышиного происхождения), специфичных к внутренним структурным белкам вириона вируса Марбург (штамм Рорр) - к кофактору вирусной полимеразы (белку VP35) - 3 вида, к нуклеопротеину - 3 вида, к матриксному белку VP40 - 9 видов, для одного вида МКА линейные эпитопы не определяются.
2. Панель МКА (мышиного происхождения), специфичных к внутренним структурным белкам вириона вируса Эбола-Заир (штамм Mayinga) – к белку VP35 (2 вида), к нуклеопротеину (9 видов мышиного происхождения и 1 вид крысиного происхождения), остальные 9 видов МКА специфичны к матриксному белку VP40.
3. Рекомбинантные белки GP, VP24, NP, VP40 и VP35 филовирусов, полученные в экспрессионной системе E.coli, сохранили антигенную структуру, характерную для аналогичных вирусных белков, и в связи с этим, они могут быть успешно использованы для иммунодиагностики филовирусных инфекций.
4. Способ выявления белка VP40 вируса Марбург методом двухцентрового ИФА с использованием двух типов неконкурирующих МКА 7D8 и 7H10.
5. Способ выявления белка VP35 вируса Марбург при помощи иммуноферментного анализа на основе одного типа МКА 3F9, которые можно одновременно использовать как в качестве “захватывающих антиген”, так и в качестве “индикаторных” антител.
6. Способ выявления нуклеопротеина вируса Эбола методом двухцентрового ИФА с использованием двух типов оригинальных МКА 1В2 (мышиного происхождения) и 7В11 (крысиного происхождения).
7. Метод выявления белка VP40 вируса Эбола на основе двухцентрового ИФА и двух типов оригинальных МКА 4А2 и 1С1.
8. Панель из 15-ти МКА (мышиного происхождения), специфичных к российскому штамму вируса Западного Нила (штамм LEIV-VLG99-27889-human). Гибридную клеточную линию 9Е2 и одноименные высокоактивные вируснейтрализующие МКА широкой специфичности против семи штаммов ВЗН. Возможность использования МКА 9Е2 и 5Н6 в тест системе “ВектоНил–антиген”, в тест системе “ВектоНил-IgG” и в тест-системе “ВектоНил-IgG-авидность”.
9. Коллекция из 11-ти оригинальных мышиных гибридных клеточных линий, продуцирующих МКА, специфичные к рекомбинантному белку рр65 вируса герпеса человека 5 типа. МКА, специфичные к рекомбинантному белку рр65 вируса герпеса человека 5 типам способны высокоэффективно выявлять вирусный матриксный белок рр65 - маркер острой цитомегаловирусной инфекции человека в различных типах клеток (в чувствительной L68 и персистентно инфекцированных Vero и RH).
Конкретное участие автора в получении результатов
Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично диссертантом и в соавторстве с д.б.н. И.А. Разумовым, д.б.н. В.Б. Локтевым, к.б.н. А.В. Качко, н.с. А.В. Ивановой, к.б.н. Е.Л. Субботиной, к.б.н. А.В. Перебоевым, д.б.н. А.А. Чепурновым, к.б.н. Е.Ф. Белановым, к.б.н. В.А. Терновым, н.с. А.В. Сорокиным, д.б.н. С.В. Нетесовым, д.м.н. Суслопаровым М.А., зав. лаб. ЗАО “Вектор-Бест” В.В. Распопиным.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: Xth International Congress of Virology, Jerusalem 1996 г.; Russian-german colloquium on filoviruses: the modern state of problem. Koltsovo, Novosibirsk region, Russia. 1997 г.; 6th Biological Medical Defence Conference. Munchen 1999 г.; Inauguration of the Swedish Containment Laboratories. Stocgolm 2000 г.; IX Международная конференция: новые информационные технологии в медицине и экологии. Крым, Гурзуф 2001 г.; VI Международная конференция РФФИ. Результаты фундаментальных исследований для инвестиций. Московская обл., г. Пущино 2001 г.; Digest reports of the IV th ISTС scientific advisory committee seminar on “Basic science in ISTС activities”, Novosibirsk, 2001 г.; II Научная конференция с международным участием. Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. Новосибирск, 2002 г.; Всероссийская научно-практическая конференция “Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке”, Томск, 2006 г.; XIV International Congress of Virology, 2008 г., Istanbul; Научная конференция “Медицинская геномика и протеомика”, 2009 г., Новосибирск; Международная научно-практическая конференция “Современные проблемы инфекционной патологии человека”, г. Минск, Республика Беларусь, 2009 г.
Связь выполненной работы с планом научных исследований
Работа выполнена в ГНЦ ВБ “Вектор” за период 1998-2010 гг. в рамках научных тем, выполняемых по Программе Центра по приоритетному направлению “Изучение структурно - функциональной организации и молекулярной эволюции геномов особо опасных вирусов человека и животных”. Исследования были поддержаны государственной программой “Новейшие методы биоинженерии”, “Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники, подраздел: Защита от патогенов”, контракт № 43.035.11.1529 (рук. д.б.н. А.А. Чепурнов); проектом по государственному контракту № 02.512.11.2004 “Биосенсоры на базе полимерных микрочастиц – жидких микрочипов для иммунодетекции инфекционных заболеваний, в том числе и особо опасных вирусных инфекций” (рук. зав. лаб. ИХКГ СО РАН д.ф.-м.н., профессор В. П. Мальцев); проектом Международного научно-технического центра (МНТЦ) ISNC № 2087 (рук. д.б.н., профессор В.Б. Локтев); проектами Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ) № 97-04-49697-а (рук. д.б.н. И.А. Разумов), № 98-04-49439-а (рук. д.б.н., профессор С.В. Нетесов), № 01-04-49877-а (рук. к.б.н. А.В. Качко), № 01-04-48972–а (рук. д.б.н. И.А. Разумов); №09-0400450 а (рук. д.б.н., профессор В.Б. Локтев); грантом Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ “Научная школа НШ-387.2008.4” (рук. д.б.н., профессор С.В. Нетесов); контрактами, выполняемыми в 2009 г. по заказу ФГУЗ РосНИИПЧИ “Микроб” и ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии в рамках ФЦП “Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 гг.): № 6/ф/09 “Cоздание научно-технической основы для разработки новых методических и инструментальных подходов к индикации возбудителей особо опасных инфекций, с помощью высокочувствительных биосенсоров” (рук. к.б.н. А.П. Агафонов); № 127-Д/1 “Разработка методов получения антигенов и антител для использования в микроэррей технологии (рук. д.б.н., профессор В.Б. Локтев).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 13 статей, входящих в список ВАК, 20 тезисов, получено 7 патентов на изобретение.
Объем и структура работы
Диссертация состоит из введения, главы литературного обзора, главы материалы и методы, 3-х глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и приложений. Работа изложена на 336 cтр., включает 28 таблиц и 53 рисунка. Список литературы состоит из 753 источников, включая 132 отечественных работ.
Похожие диссертации на Получение и применение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека
