Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1 Трансгенные кролики - источники биологически активных рекомбинантных белков и модели болезней человека 12
1.2. Основные способы введения генно-инженерных конструкций в эмбрионы животных 29
1.3. Эффективность интеграции трансгена в геном млекопитающих 49
2. Материалы и методы исследований 55
2.1. Получение кроличьих эмбрионов 55
2.2. Генно-инженерные конструкции использованные в работе 56
2.3. Получение культуральной среды, содержащей ретровирусную конструкции 59
2.4. Микроинъекция генно-инженерных конструкций в зиготы 61
2.5. Культивирование кроличьих эмбрионов in vitro 62
2.6. Трансплантация эмбрионов самкам-реципиентам 63
2.7. Определение интеграции трансгена в геном эмбрионов и рождённого потомства 64
3. Результаты собственных исследований 66
3.1. Изучение факторов, влияющих на эффективность получения потомства кроликов из зигот, микроинъецированных различными генно-инженерными кон струкциями 66
3.1.1 Суперовуляция у крольчих доноров эмбрионов разных пород и разного возраста 67
3.1.2. Приживляемость эмбрионов в организме крольчих-реципиентов в зависимости от числа трансплантированных зигот, микроинъецированных генно-инженерными конструкциями 68
3.1.3. Влияние породы и возраста крольчих-реципиентов на сукрольность и приживляемость эмбрионов 70
3.2. Влияние микроинъекции в перивителлиновое пространство зигот культуральной среды, содержащей генно-инженерную конструкцию, встроенную в ретровирусный вектор, на жизнеспосрбность эмбрионов и интеграцию трансгена
в геном первичных трансгенных кроликов 73
3.2.1. Приживляемость эмбрионов, развившихся из зигот, микроинъеци-рованных генно-инженерной конструкцией aSl-Cn-hG-CSF, встроенной в ретровирусный вектор, и интеграция трансгена в геном рожденных кроликов 74
3.2.2. Передача трансгена потомству первичными трансгенными животными, полученными с использованием генно-инженерной конструкции, встроенной в ретровирусный вектор 76
3.3. Изучение возможности получения трансгенных кроликов при введении ретровирусной конструкции в перивителлиновое пространство яйцеклеток, находящихся на стадии метафазы II 78
3.3.1. Приживляемость эмбрионов при трансплантации крольчихам-донорам извлечённых у них зигот (метод донор-реципиент) 79
3.3.2. Изучение возможности получения трансгенных животных при введении генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, в ещё неоплодотворённые яйцеклетки, извлечённые из яйцеводов крольчих, осеменённых самцом 81
3.4. Влияние микроинъекции в пронуклеусы зигот различных плазмидных генно- инженерных конструкций на жизнеспособность кроличьих эмбрионов и частоту интеграции трансгена в геном рождённого потомства 85
3.4.1. Влияние различных плазмидных генно-инженерных конструкций на жизнеспособность кроличьих эмбрионов и частоту интеграции трансгена на стадии эмбриона 86
3.4.2. Приживляемость эмбрионов, микроинъецированных плазмидными генно-инженерными конструкциями, в организме самок-реципиентов и частота интеграции трансгена в геном рожденного потомства 89
3.5. Влияние микроинъекции в пронуклеусы кроличьих зигот плазмидной генно- инженерной конструкции совместно с рестриктазой на жизнеспособность и интеграцию трансгена в геном эмбрионов 93
3.5.1. Влияние совместной микроинъекции плазмидной генно-инженерной конструкции с рестриктазой Xbal на жизнеспособность кроличьих эмбрионов и частоту интеграции трансгена, определенную на стадии бла-стоцисты 94
4. Обсуждение полученных результатов 98
5. Выводы 118
6. Практические предложения 120
Список литературы 121
- Трансгенные кролики - источники биологически активных рекомбинантных белков и модели болезней человека
- Генно-инженерные конструкции использованные в работе
- Приживляемость эмбрионов в организме крольчих-реципиентов в зависимости от числа трансплантированных зигот, микроинъецированных генно-инженерными конструкциями
Введение к работе
Получение трансгенных животных, продуцирующих с молоком биологически активные вещества лекарственного назначения, считается в настоящее время одним из наиболее быстро окупаемых направлений трансгенной технологии, разработке которого уделяется наибольшее внимание. Принципиальная возможность получения трансгенных животных, продуцирующих с молоком биологически активные вещества белковой природы, обусловлена механизмом тканеспецифической экспрессии трансгена в клетках секреторного эпителия молочной железы, определяемой регуляторными последовательностями генов основных белков молока, используемых в качестве промоторов при создании генно-инженерных конструкций.
Среди биологически активных веществ, имеющих терапевтическое значение, наибольшее внимание исследователей привлекают: колониестимули-рующие факторы, интерлейкины, антитромбин, урокиназа, эритропоэтин, фактор некроза опухолей и другие. Получение белков этого класса с помощью рекомбинантных бактерий в ряде случаев принципиально невозможно из-за неспособности прокариот осуществлять сложные посттрансляционные модификации синтезируемых белков (гликозилирование, карбоксилирование и др.), которые в совокупности обеспечивают функциональную активность этих белков.
Разработанные в настоящее время технологии получения некоторых лекарственных биологически активных веществ на основе использования культур клеток млекопитающих животных, которые способны в определенной степени осуществлять посттрансляционные модификации белков, являются слишком трудоемкими и дорогостоящими. Расчеты, основанные на результатах первых экспериментов, свидетельствуют, что разработка технологии получения трансгенных животных, продуцирующих лекарственные биологически активные вещества с молоком, позволит решить проблему более быстрыми темпами и с наименьшими затратами. Эти животные-суперпродуценты
7 могут стать высокоэффективными экологически чистыми биофабриками по производству биологически активных веществ, необходимых для медицины и сельского хозяйства по несравненно низкой себестоимости. Кроме того, получение этих веществ из молока позволит устранить опасность заражения их вирусами гепатита, СПИДа и др., которая существует при традиционной технологии получения этих веществ из тканей человека.
В связи с тем, что некоторые лекарственные вещества имеют высокую биологическую активность и малые терапевтические дозы, а потребности их на мировом рынке исчисляются в граммах. Многие исследователи приходят к выводу, что очень удобным объектом для получения с молоком высокоактивных лекарственных веществ белковой природы является кролик. Основными достоинствами кролика для технологии получения суперпродуцентов биологически активных веществ с молоком являются его высокая скоро-плодность и одноразовое кормление крольчихами своего потомства, в результате которого от крольчихи можно получать до 150-200 мл молока в сутки. Исходя из этих соображений, возникает необходимость в разработке эффективной технологии получения трансгенных кроликов, продуцирующих с молоком биологически активные вещества лекарственного назначения.
Для получения трансгенных животных наиболее широко используется метод микроинъекции плазмидных генно-инженерных конструкций в пронук-леусы зигот. Однако, при использовании этого метода общая эффективность переноса генов остается на низком уровне. По современным представлениям низкая эффективность получения трансгенных сельскохозяйственных животных обусловлена низкой частотой интеграции рекомбинантных конструкций в геном животных и снижением жизнеспособности зигот, микроинъеци-рованных различными генно-инженерными конструкциями, в организме животных-реципиентов.
В значительной степени эффективность технологии получения трансгенных животных зависит от жизнеспособности и приживляемости зигот, подвергнутых различным процедурам, связанным с введением в их пронуклеусы
8 генно-инженерных конструкций.
В настоящее время при получении трансгенных кроликов исследователи используют отдельные этапы технологии трансплантации эмбрионов поздних стадий развития, разработанной ранее для изучения некоторых вопросов биологии развития. Однако применительно к технологии получения трансгенных животных к этим этапам предъявляются значительно более жесткие требования в связи с тем, что в этой технологии используются эмбрионы на стадии зиготы, которая имеет продолжительность всего 6-8 часов. В связи с этим для разработки эффективной технологии получения трансгенных кроликов микроинъекционным методом, необходимы исследования по изучению влияния различных факторов на жизнеспособность и приживляемость зигот, микроинъецированных генно-инженерными конструкциями.
Одним из факторов, значительно снижающих эффективность технологии получения трансгенных животных, является низкий уровень интеграции чужеродных генов в геном хозяина. Это обстоятельство вынуждает использовать для получения одного трансгенного животного большое количество эмбрионов на стадии зиготы и большое число реципиентов, что значительно удорожает технологию.
Поиск путей, способствующих повышению интеграции рекомби-нантных ДІЖ в геном эмбрионов и рожденного потомства, является одной из главных проблем при разработке технологии трансгеноза.
Существует мнение, что использование генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусные вектора, является одним из направлений, с помощью которого возможно повышение частоты интеграции трансгена в геном животных. Однако вопрос о характере интеграции этих конструкций в геном эмбрионов и рождённого потомства остаётся ещё недостаточно изученным.
Поэтому возникает необходимость в изучении влияния генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, на жиз-
9 неспособность инъецированных эмбрионов, а также в изучении характера интеграции трансгена в геном первичных трансгенных животных.
Современные достижения цитогенетики дают основание полагать, что встраивание чужеродной ДНК происходит в местах естественных разрывов хромосомной ДНК хозяина. Вследствие этого возникло предположение, что при микроинъекции в пронуклеусы зигот вместе с генно-инженерными конструкциями рестриктаз, с помощью которых осуществлялось вырезание этих конструкций из плазмиды, может способствовать разрезанию хромосомной ДНК с образованием липких концов комплементарных липким концам вводимой генно-инженерной конструкции. В результате чего может возрасти вероятность встраивания генно-инженерной конструкции.
Исходя из вышеизложенного, для повышения эффективности технологии получения трансгенных животных необходимо изучение факторов, влияющих на интеграцию трансгена в геном хозяина и на жизнеспособность эмбрионов, инъецированных генно-инженерными конструкциями, при получении трансгенных животных.
Цель и задачи исследований
Целью настоящей работы являлось изучение жизнеспособности эмбрионов и характера интеграции трансгена в геном кроликов при введении в зиготы различных генно-инженерных конструкций.
Для достижения поставленной цели считали необходимым решить следующие задачи:
изучить влияние некоторых физиолого-эмбриологических факторов на жизнеспособность и приживляемость зигот, микроинъецирован-ных различными генно-инженерными конструкциями;
изучить влияние генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, на жизнеспособность кроличьих эмбрионов, при введении этих конструкций в перивителлиновое пространство зигот;
исследовать частоту и характер интеграции в геном эмбрионов и рожденного потомства генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, при введении их в перивителлиновое пространство зигот;
изучить влияние микроинъекции в пронуклеусы зигот плазмидных конструкций на жизнеспособность эмбрионов и частоту интеграции трансгена в геном животных.
Научная новизна исследований
Получены трансгенные кролики с интегрированным геном грануло-цит-колониестимулирующего фактора человека под промотором гена б)г57-казеина крупного рогатого скота путем микроинъекции в перивителлиновое пространство зигот генно-инженерной конструкции, встроенной в ретровирусный вектор {Rv-aSl-Cn-hG-CSF). Изучен характер интеграции этой конструкции в геном рожденного потомства кроликов и передача трансгена по наследству. Установлено, что при введении ретровирус-ной конструкции в перивителлиновое пространство зигот интеграция трансгена носит мозаичный характер.
Получены трансгенные кролики, несущие ген лактоферрина человека под контролем регуляторных элементов гена о5/-казеина и /?-лактоглобулина крупного рогатого скота {aSi-Cn-hLf и pLg-hLf), путем микроинъекции в пронуклеусы зигот плазмидных генно-инженерных конструкций. Изучена частота интеграции в геном эмбрионов и рожденного потомства кроликов генно-инженерных конструкций aSj-Cn-hL/и pLg-hLf человека при введении их в пронуклеусы зигот.
Практическая значимость
Результаты исследований, о влиянии генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, на жизнеспособность эмбрионов, частоту и характер интеграции трансгена в геном рожденного потом-
ства могут быть использованы в работах по получению трансгенных животных с целью повышения общей эффективности технологии трансгено-за. Результаты исследований, полученные в экспериментах по совместному введению в пронуклеусы зигот рестриктазы Xbal с генно-инженерной конструкцией, могут быть использованы для дальнейшей разработки способов, повышающих частоту интеграции трансгена в геном животных. Данные по развитию кроличьих зародышей после различных эмбриоин-женерных манипуляций могут быть использованы при разработке технологии трансгеноза и при проведении исследований в области экспериментальной эмбриологии млекопитающих.
Положения, выносимые на защиту
Микроинъекция в перивителлиновое пространство зигот генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, способствует увеличению частоты интеграции трансгена в геном эмбрионов и рожденного потомства, по сравнению с введением плазмидных конструкций в пронуклеусы зигот, но интеграция трансгена в геном первичных трансгенных кроликов при этом носит мозаичный характер.
При микроинъекции в пронуклеусы кроличьих зигот плазмидных генно-инженерных конструкций fiLg-hLf и aSrCn-hLf частота интеграции трансгена в геном первичного рождённого потомства кроликов достоверно ниже, чем частота интеграции в эмбрионы, определённая на стадии бластоцисты.
3. Крольчихи в возрасте до 2-х лет лучше реагируют на гормональную об
работку при вызывании суперовуляции и являются лучшими реципиентами для
трансплантации зигот, микроинъекцированных генно-инженерными конст
рукциями.
Трансгенные кролики - источники биологически активных рекомбинантных белков и модели болезней человека
Процесс получения трансгенных кроликов в отличие от мышей занимает больше времени в связи с более продолжительным периодом беременности и является дорогостоящим. Положительных результатов при создании трансгенных кроликов гораздо меньше, чем мышей, поэтому факторы, влияющие на успешное получение трансгенных кроликов, требуют дополнительного изучения. Для получения трансгенных кроликов наиболее распространённым является метод микроинъекции генно-инженерных конструкций в пронукле-усы зигот. Использование других методов не нашло широкого практического применения при работе с кроликами.
За рубежом в экспериментах по получению трансгенных кроликов чаще всего используют породы новозеландские белые и японские белые, есть данные о применении гибридов этих пород (Buhler et al., 1990; Brem et al., 1998). Для работы в нашей лаборатории используются кролики пород шиншилла и калифорнийский. Процедура получения трансгенных кроликов методом микроинъекции в пронуклеус, которую мы используем в своей работе, аналогична схеме, показанной на рис. 1. При получении трансгенных кроликов обязательным условием является использование только клинически здоровых животных. Суперовулирующий Кроликов необходимо содержать в помещении с дезинфицирующим барьером при температуре окружающей среды 23С и влажности 55 %, с 12 часовым световым режимом и свободным доступом к воде и пище.
Использование в работе клинически больных животных отрицательно сказывается на гормональных обработках, сукрольности реципиентов и процессах размножения. Для получения наибольшего числа эмбрионов от самок-доноров проводят их гормональную обработку для вызывания суперовуляции. Обычно при обработках кроликов для стимуляции суперовуляции используют сыворотку жерёбых кобыл (СЖК) или фолликулостимулирующий гормон (ФСГ). В результате такой обработки от одного донора можно получить около 20-30 эмбрионов. В первый день самкам-донорам вводят СЖК. На четвертый день, проводят спаривание самок-доноров с двумя или более самцами. После спаривания внутривенно вводят хорионический гонадотропин человека (ХГч) для того, чтобы вызвать овуляцию. При использовании ФСГ - 0.5 арморовских единиц (армор. ед.) гормона вводят подкожно через 12 часовые интервалы в течение 3 дней. На четвертый день проводят спаривание самок-доноров с самцами, а затем делают инъекцию ХГч.
Если сравнить два типа гормонов, то инъекция ФСГ приводит к более стабильному числу вымываемых эмбрионов, чем введение СЖК. Однако при обработках ФСГ требуется многократные гормональные инъекции, в то время как инъекция СЖК однократна и число полученных эмбрионов лишь немного меньше. Зиготы, полученные при любой из обработок можно использовать для микроинъекции.
Оплодотворенные эмбрионы вымываются из яйцевода с помощью специального катетера. При работе с кроликами можно несколько раз использовать в качестве доноров одних и тех же самок. Однако при последующих обработках наблюдается уменьшение числа полученных эмбрионов.
Микроинъекция эмбрионов кролика, как и эмбрионов мыши, выполняется на установке включающей инвертированный микроскоп с дифференциально-интерференционным контрастом и комплектом манипуляторов и микроинъекторов. Точность введения раствора ДНК, содержащего несколько сотен копий генно-инженерной конструкции, контролируют по увеличению пронуклеуса. После микроинъекции эмбрионы выдерживают при 37С в течение 2-3 часов в манипуляционной среде. Эмбрионы, пережившие микроинъекцию, трансплантируют в яйцевод самок-реципиентов.
Генно-инженерные конструкции использованные в работе
В целях получения максимального количества зигот у крольчих-доноров вызывали суперовуляцию по следующей схеме: в 1-й день в 16.30 крольчихам подкожно водили 0,5 арморовских единиц (армор. ед.) ФСГ-супер (ООО «Агробиомед», Боровск, Россия); на 2-й день в 9.00 и 16.30 - 0,5 армор. ед. ФСГ-супер; на 3-й день в 9.00 и 16.30 - 0,5 армор. ед. ФСГ-супер; на 4-й день в 9.00 - 0,5 армор. ед. ФСГ-супер и в 16.30 внутривенно вводили - 100 И.Е. хорионического гонадотропина человека (ХГч) и дважды покрывали самцом; на 5-й день проводили извлечение зигот в 10.00. Для гормональной стимуляции использовали самок в возрасте от 16-36 месяцев, весом 3-4,5 кг.
Извлечение зигот у крольчих-доноров проводили через 17-19 ч после покрытия их самцом и введения ХГч (Московский эндокринный завод), применяя стандартные хирургические методы (Магда, 1990). Эмбрионы вымывали через бахромку яйцевода с помощью специального катетера в стерильные флаконы. Для вымывания использовали DPBS («ПанЭко», Москва) с добавлением 0,01% БСА («Serva», USA) и 0,04 мг/мл гентамицина («Ферейн», Москва). Поиск эмбрионов в промывной жидкости проводили в 90 мм стерильных пластиковых чашках Петри («Медполимер», Санкт-Петербург), используя микроскоп МБС-9. Эмбрионы на стадии зиготы собирали и отмывали в 4-5 каплях свежей манипуляционной среды Капе (1983) с добавлением 10 мМ HEPES-буфера («ПанЭко», Москва) или DPBS («ПанЭко», Москва) с добавлением 2% ФТС («Eurobio», Франция), 0,04 мг/мл гентамицина («Ферейн», Москва) и 0,33 мМ натрия пирувата («Пан Эко», Москва). После чего их переносили в свежеприготовленные капли манипуляционной среды объёмом 40 мкл под минеральным маслом (Sigma embryo tested, USA) в 40 мм чашках Петри («Медполимер», Санкт-Петербургбург) по 20 зигот в одной капле.
В работе были использованы две плазмидные генно-инженерные конструкции, включающие регуляторные области гена /?-лактоглобулина крупного рогатого скота. Генно-инженерная конструкция BLg-hG-CSF, содержащая нуклеотидные последовательности гена гранулоцит-колониестимулирую-щего фактора (G-CSF) человека размером 1500 п.н. и регуляторные области гена /?-лактоглобулина крупного рогатого скота - 5Л- фланкирующая после довательность длиной в ЗОЮ п.н. и 3"-фланкирующая последовательность размером 1580 п.н., была выделена из ранее созданной рекомбинантной плазмиды pBLgGC (рис. 5а), гидролизованной рестриктазой ХЬа I (Езерский и др., 2007).
Приживляемость эмбрионов в организме крольчих-реципиентов в зависимости от числа трансплантированных зигот, микроинъецированных генно-инженерными конструкциями
Принимая во внимание невысокий процент приживляемости микроинъецированных зигот, существенное значение приобретает вопрос о числе зигот, которое необходимо пересаживать животному-реципиенту для получения положительного результата. Анализ результатов исследований по выяснению зависимости приживляемости эмбрионов, микроинъецированных плазмидными генно-инженерными конструкциями, от числа зигот, трансплантированных крольчихам-реципиентам (табл. 4), показал, что с увеличением числа трансплантированных эмбрионов процент сукрольности реципиентов увеличивался с 30,4 до 66,6% при пересадке, соответственно, 18 и 34-ти зигот. Увеличивалась также и приживляемость эмбрионов в расчёте на всех использованных реципиентов с 6,6% до 9,6%, соответственно. Однако среднее число крольчат, полученное на одного сукрольного реципиента, оставалось практически одинаковым: 4,1 - при трансплантации 14-20 зигот и 5,0 - при трансплантации 30-40 зигот.
При анализе результатов исследований по выяснению зависимости при-живляемости эмбрионов, микроинъецированных генно-инженерными конструкциями, встроенными в ретровирусный вектор, от числа зигот, трансплантированных крольчихам-реципиентам (табл. 5), видно, что с уменьшением числа трансплантированных эмбрионов процент сукрольности реципиентов увеличивается с 58 до 90% при пересадке, соответственно, 11 и 30-ти зигот.
Увеличивалась также и приживляемость эмбрионов в расчёте на всех использованных доноров с 17,2 до 39%, соответственно.
Более высокая приживляемость эмбрионов развившихся из зигот, инъецированных ретровирусными конструкциями, по сравнению с плаз-мидными, по-видимому, обусловлена тем, что ретровирусные конструкции вводили в перивителлиновое пространство зигот, не повреждая ци-топлазматическую и пронуклеарную мембраны. При введении в пронук-леусы плазмидных генно-инженерных конструкций прокалывается как цитоплазматическая мембрана, так и оболочка пронуклеуса, что и вызывает более сильное травмирование зигот.
На основании полученных результатов можно сделать вывод, что крольчихам-реципиентам наиболее целесообразно пересаживать от 30 до 40 зигот, микроинъецированных в пронуклеус плазмидными генно-инженерными конструкциями, и от 8 до 13 эмбрионов, микроинъецированных в перивителлиновое пространство генно-инженерными конструкциями, встроенными в ретровирусный вектор.
Похожие диссертации на Молекулярно-генетические и физиолого-эмбриологические аспекты технологии получения трансгенных кроликов-продуцентов биологически активных веществ человека
