Введение к работе
Актуальность темы исследования
В последнее время темп использования ископаемых топлив, особенно нефти и газа, ускоряется, что влечет за собой угрозу энергетического кризиса и глобального загрязнения окружающей среды. Возобновляемые формы энергии являются одним из путей решения этих проблем, значительные усилия направляются на исследование альтернативных источников электроэнергии. В последние годы интенсивно исследуются биотехнологические аспекты генерирования энергии, в том числе технологии биотопливных элементов (БТЭ) как способ генерации электричества или водорода из возобновляемых источников без эмиссии углекислого газа в экосистему. БТЭ также могут быть использованы для очистки сточных вод за счет способности применяемых биокатализаторов окислять широкий спектр органических веществ. В качестве биокатализаторов для окисления субстратов могут выступать ферменты или микроорганизмы. Использование последних более предпочтительно, т.к. не требуются сложные и дорогостоящие процессы выделения, очистки и хранения ферментов. Одними из перспективных микроорганизмов, на основе которых возможно создание БТЭ, являются уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans. Эти микроорганизмы обладают уникальной организацией метаболической системы, характеризующейся мембранной локализацией основных ферментов - дегидрогеназ, что делает возможным перенос электронов из активных центров фермента на внешнее пространство. В связи с этим мембранная фракция, относительно просто выделенная из бактериальных клеток, также может явиться перспективным биокатализатором в БТЭ. Для облегчения процесса передачи электронов от мембранно-локализованных ферментов бактерий на анод БТЭ применяются медиаторы электронного транспорта - низкомолекулярные соединения, которые могут проникать через внешнюю мембрану бактерий, получать электроны у мембранно-локализованных ферментов и окисляться на аноде. В качестве медиаторов электронного транспорта для Gluconobacter oxydans в БТЭ использовались различные органические и неорганические соединения, среди них 2,6-дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) оказался наиболее подходящим. При разработке проточных систем БТЭ важной проблемой является потеря биокатализатора, одним из возможных решений является применение иммобилизованных микроорганизмов. Сополимер поливинилового спирта (ПВС) и N-винилпирролидона представляется перспективной матрицей для иммобилизации бактериальных клеток за счет способности удерживать клетки, нетоксичности для них, механической и химической устойчивости. Анализ литературы показывает, что большинство исследований по БТЭ до сих пор посвящено в основном прикладным аспектам технологии, т.е. подбору оптимальных условий и разработке конструкций для достижения максимальных энергетических характеристик БТЭ. При этом фундаментальные вопросы по механизмам работы БТЭ, в том числе кинетические аспекты процессов переноса зарядов в системе «субстрат - биокатализатор - медиатор - электрод» не были систематически исследованы. Понимание таких механизмов позволит создавать эффективные БТЭ с высокими электрическими характеристиками. Таким образом, исследо-
вание кинетических аспектов передачи электронов в анодном отделении БТЭ на основе Gluconobacter oxydans представляется актуальной задачей в области биотехнологии альтернативных источников энергии.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы - выявление закономерностей и определение кинетических параметров процессов передачи электронов в системе «субстрат - биокатализатор - медиатор 2,6-дихлорфенолиндофенол - графитовый электрод» в БТЭ на основе уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans и выделенной из них мембранной фракции в суспензионном и иммобилизованном состояниях.
Для достижения указанной цели в работе решались следующие задачи:
-
Определить кинетические параметры взаимодействия медиатора с биокатализаторами в суспензионном состоянии в присутствии субстрата.
-
Выявить влияние операционных условий (природа и концентрация субстрата, содержание биокатализатора, рН, ионная сила раствора, присутствие растворенного кислорода) на скорость восстановления медиатора при использовании биокатализатора в суспензионном состоянии.
-
Выявить лимитирующую стадию и определить кинетические параметры взаимодействия медиатора с иммобилизованным биокатализатором.
-
Определить кинетические характеристики процесса разряда медиатора на графитовом электроде.
-
Сравнить энергетические характеристики БТЭ на основе бактерий Gluconobacter oxydans и их мембранной фракции, применяемых в виде суспензии и в иммобилизованном состоянии.
Научная новизна
Впервые определены эффективные константы скорости и начальные скорости восстановления ДХФИФ уксуснокислыми бактериями Gluconobacter oxydans и выделенной из них мембранной фракцией при различных условиях работы БТЭ (окислительная и инертная атмосфера, разомкнутая цепь и короткое замыкание, суспензионный и иммобилизованный биокатализатор), что позволяет оценить влияние этих условий на кинетику процесса восстановления ДХФИФ биокатализаторами.
Показано, что в условиях функционирования разработанного макета БТЭ растворенный кислород в анодном отделении не конкурирует с медиатором в процессе получения электронов от ферментных систем бактерий.
На основе модели ферментного электрода впервые выявлены области концентраций субстрата, при которых лимитирующей стадией является диффузия субстрата к частицам биокатализатора или ферментативная реакция окисления субстрата иммобилизованными в химически модифицированный поливиниловый спирт бактериями Gluconobacter oxydans на электроде.
Установлено, что процесс переноса электронов с восстановленной формы ДХФИФ на графитовый электрод протекает в смешанном режиме, т.е. конкурирующими являются стадии диффузии медиатора к электроду, адсорбции его на поверхности и перенос заряда на электрод, при этом окисление медиатора является реакцией первого порядка.
Практическая значимость
Выявленное влияние рабочих условий БТЭ на скорость восстановления ДХФИФ может служить ориентиром при подборе оптимальных условий для работы БТЭ на основе уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans и медиатора ДХФИФ.
Установлено, что при избытке бактериальных клеток Gluconobacter oxydans в качестве биокатализатора БТЭ может работать в аэробных условиях. При этом процесс передачи электронов от бактерий на молекулы медиатора не подвергается конкуренции со стороны растворенного кислорода, что позволяет конструировать более простые БТЭ без изолирования их анодного отделения от воздуха.
Впервые показана возможность использования поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном, для иммобилизации бактериальных клеток Gluconobacter oxydans на аноде БТЭ. Такая композиция анода повышает долговременную стабильность БТЭ, улучшает его энергетические характеристики и позволяет применять биокатализатор в проточных системах.
Результаты работы внедрены в учебный процесс - поставлена новая лабораторная работа по курсам «Биосенсоры» и «Биотехнология защиты окружающей среды» для студентов специальностей 020100 Химия и 240901 Биотехнология.
Апробация работы и публикации
Результаты работы представлены во всероссийских конференциях с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология», (г. Тула, 2010, 2011, 2012 гг.), Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», (2011г. г. Москва, диплом и медаль конкурса), Всероссийской школе-конференции "Химия биологически активных веществ" с международным участием "ХимБиоАктив-2012" (г. Саратов 2012г.), Международной интернет-конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее», (2012г.), Международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (г. Саранск, 2012г).
По теме диссертации опубликовано 3 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК и 7 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций, получен патент на полезную модель (2012г.).
Место проведения работы
Экспериментальная часть работы выполнялась на кафедре Химии ЕНФ Тульского государственного университета, в рамках проектов ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», Соглашение № 14.В37.21.0561 и Государственного задания Минобрнауки 4412 ГЗ.
Благодарности. Автор благодарен коллективам кафедры химии Тульского государственного университета за неоценимую помощь в проведении исследований и обсуждении результатов. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям - к.х.н., проф. Алферову В.А., к.х.н., доц. Пона-моревой О.Н.
Структура и объем работы.
Работа состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы». Диссертационная работа изложена на 111 страницах машинописного текста, содержит 42 рисунка и 12 таблиц. Список литературы включает 97 источников.
Похожие диссертации на Кинетические аспекты переноса электронов в системе "субстрат - биокатализатор - медиатор - электрод" в биотопливном элементе на основе Gluconobacter oxydans
