Содержание к диссертации
1. ВВЕДЕНИЕ 8
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Стимуляторы роста 12
2.2. Кортикостероиды 13
2.3. Дексаметазон 15
2.4. Фармакокинетика дексаметазона 16
2.5. Фармакодинамика дексаметазона 20
2.6. Определение приемлемой суточной дозы потребления ДМ 22
2.7. Расчет максимально допустимого уровня остатков ДМ 23
2.8. Период ожидания после применения ДМ 24
2.9. Скрининг-методы 2.10. Иммуноферментный анализ (ИФА) 26
2.11. Гетерогенный ИФА 27
2.12. Принципы иммобилизации биомолекул 30
2.13. Ферментативные метки в ИФА 33
2.14. Выбор подходящего субстрата вИФА
2.16. Арбитражные методы 36
2.17. Предел определения метода 36
2.18. Получение иммуногенов и иммунореагентов 38
2.19. Иммунная система млекопитающих 39
2.20. Синтез АГ 40
2.21. Количество АГ для иммунизации 43
2.22. Основные свойства адъювантов 45
2.23. Выбор адъюванта 47
2.24. Выбор животного для продукции поликлональных AT 47
2.25. Пути введения и количество инъекций для первичной иммунизации.. 50
2.26. Повторные поддерживающие иммунизации 51
2.27. Программы иммунизации з
2.28. Определение следов органических соединений 52
2.29. Жидкостно-жидкостная экстракция 53
2.30. Технология экстракции 57
2.31. Методы экстракции дексаметазона 60
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 61
3.1. Используемые реактивы и материалы 61
3.2. Методы исследований
3.2.1. Получение гаптена и конъюгатов дексаметазона с белками 64
3.2.2. Получение специфических поликлональных сывороток 65
3.2.3. Сенсибилизация лунок планшета 66
3.2.4. Определение активности иммунных сывороток 66
3.2.5. Определение специфичности и константы аффинности иммунных сывороток 67
3.2.6. Определение специфичности тест-системы 68
3.2.7. Определение концентрации белка по методу Лоури 69
3.2.8. Экстракция ДМ из биологических субстратов
3.2.8.1. Подготовка образцов мышечной ткани КРС 70
3.2.8.2. Подготовка образцов мышечной ткани свиньи 72
3.2.8.3. Подготовка образцов печени 72
3.2.8.4. Подготовка образцов почек 73
3.2.8.5. Подготовка образцов мочи 73
3.2.8.6. Подготовка образцов корма 75
3.2.8.7. Подготовка образцов молока 75
3.2.9. Проведение ВЭЖХ-МС-МС анализа 75
3.2.10. Определение концентрации ДМ в исследуемых образцах 77
3.2.11. Определение эффективности экстракции ДМ из биологических субстратов 77
3.2.12. Расчет метрологических характеристик НТК ИФА
3.2.12.1. Расчет пределов обнаружения и определения ДМ в образцах 77
3.2.12.2. Воспроизводимость результатов анализа 79
3.2.12.3. Сходимость результатов анализа 79
3.2.13. Обработка данных 79
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 80
4.1. Получение специфических иммунореагентов 80
4.2. Отработка условий проведения процедуры НТК ИФА
4.2.1. Получение специфических иммунных сывороток 82
4.2.2. Определение активности иммунных сывороток в НТ ИФА 83
4.2.3. Определение специфичности иммунных сывороток в НТК ИФА 83
4.2.4. Определение констант аффинности AT в НТК ИФА 86
4.2.5. Выбор ТФА для сенсибилизации иммунологического планшета 88
4.2.6. Выбор оптимальной концентрации ТФА 89
4.2.7. Определение оптимального времени сенсибилизации и оптимальной температуры инкубации ТФА с полистиролом 90
4.2.8. Проверка различных иммунологических планшетов в НТК ИФА 91
4.2.9. Определение оптимального времени и температуры инкубации ТФА
с AT в НТК ИФА 93
4.2.10. Определение чувствительности предлагаемого метода для определения ДМ 94
4.2.11. Определение специфичности тест-ситемы 95
4.2.12. Заключение 97
4.3. Разработка способов подготовки биологического материала для опре
деления ДМ методом ИФА 98
4.3.1. Экстракция метанолом и смесью метанол/вода (8/2) с последующей очисткой гексаном и экстракцией аналита из водного в эфирный слой 98
4.3.2. Экстракция хлороформом из органов и тканей при различных рН
(1,0; 5,2; 7,0) исходного образца 98
4.3.3. Экстракция смесью ацетонитрил/вода (7/3), с последующей очисткой экстракта в системе гексан/дихлорметан 109
4.3.4. Определение ДМ в молоке 111
4.3.5. Заключение 116 4.4. Комиссионные испытания 117
4.5. Определение ДМ в продукции животноводства и кормах методом жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием 1
4.5.1. Проведение ВЭЖХ-МС-МС анализа 117
4.5.2. Заключение 1 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 122
6. ВЫВОДЫ 138
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 140
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ 145
9. ПРИЛОЖЕНИЯ 159
Введение к работе
Дексаметазон (ДМ) - синтетический глюкокортикоид, который широко используется в ветеринарии в качестве противовоспалительного средства [128, 137, 164]. ДМ применяется также в качестве стимулятора роста продуктивных животных [43, 48, 44, 150, 18, 39]. Остаточное содержание этого глюкокорти-коида в животноводческой продукции может оказывать эмбриотоксическое и генотоксическое действие на организм человека [168, 169, 140, 82]. В России и странах Европейского Союза введен запрет на использование гормональных стимуляторов роста, в том числе ДМ, в животноводстве [53; 9]. Терапевтическое применение ДМ регламентировано максимально допустимым уровнем (МДУ), установленным для этого гормона в продукции животного происхождения [36, 12].
В 2003-2005 годах в Европе были проведены мониторинговые исследования нелегального использования гормональных стимуляторов роста в животноводстве. По данным Европейской Комиссии ДМ является гормоном, остатки которого чаще всего обнаруживают в животноводческой продукции. В 2003 г. было зарегистрировано 130 случаев нелегального применения ДМ в Европе; в 2004 г. - 64 случая; в 2005 г. - 186 случаев [130].
Возможное негативное влияние ДМ на здоровье людей, а также частое обнаружение остаточных количеств этого гормона в продукции животноводства, сделали актуальным проведение широкомасштабного мониторинга его использования. Мониторинг должен основываться на сочетании преимуществ использования быстрых иммунохимических реакций с достоинствами современных арбитражных спектрометрических методов анализа.
Для обеспечения в Российской Федерации мониторинга использования ДМ в кормах и продукции животноводства необходимо создание чувствительного и специфичного экспресс-метода. Наиболее перспективным для этих целей является использование непрямого твердофазного конкурентного иммуно 9 ферментного анализа (НТК ИФА), обладающего следующими преимуществами: низкая стоимость, простота проведения анализа и возможность тестирования большого количества образцов за короткий промежуток времени [163].
Среди арбитражных методов, используемых для подтверждения остаточного содержания глюкокортикоидов в образцах, показавших положительный результат в ИФА, наиболее перспективным является высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС-МС) [18, 148,20].
Цель и задачи исследований
Целью работы явилось создание высокочувствительной и специфичной тест-системы на основе непрямого твердофазного конкурентного иммунофер-ментного анализа для экспрессного определения ДМ в биосубстратах. В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
• синтезировать карбоксипроизводное ДМ и создать иммуноге-ны путем конъюгации его с белками;
• получить поликлональные кроличьи сыворотки на синтезированные иммуногены;
• провести скрининг полученных сывороток в ИФА с целью выявления наиболее активных и специфичных из них;
• оптимизировать условия постановки непрямого конкурентного твердофазного ИФА для определения ДМ в биосубстратах;
• разработать простые и экономичные способы подготовки биологических образцов для экспрессного определения в них ДМ; оценить чувствительность и специфичность метода;
• провести комиссионные испытания тест-системы ИФА для определения ДМ в биосубстратах; утвердить нормативную документацию на тест-систему и зарегистрировать ее в Российской Федерации; • подтвердить результаты экспрессного определения остаточного содержания ДМ в биосубстратах арбитражным методом ВЭЖХ-МС-МС.
