Содержание к диссертации
Введение
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
2.1. Общая характеристика [3-адрепостимуляторов 10
2.2. Метаболизм клснбутерола 14
2.3. Методы определения (3-адреностимуляторов 18
2.4. Скрининг-.методы 21
2.5. Иммуноферментный анализ 22
2.5.1. Гетерогенный иммуноферментный анализ 24
2.5.2. Получение иммобилизованных антигенов и антител 28
2.5.2.1. Носители, применяемые в ИФА 28
2.5.2.2. Иммобилизация антигенов 29
2.5.3. Ферменты, используемые Б ИФА в качестве меток , 30
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 33
3.1. ИсполЕлуемыс реактивы и материалы 33
3.2. Методы исследований 36
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 52
4.1, Получение конъюгатов кленбутерола с белками 52
4.2, Получение специфических иммунных сывороток 52
4.3, Отработка условий проведения процедуры НТК ИФА 53
4.3.1. Определение активности и специфичности иммунных сывороток .53
4.3.2. Выбор конъюгата в качестве твердофазного антиген а для сенсибилизации иммунологического планшета 55
4.3.3, Выбор оптимальной концентрации твердофазного антигена 56
4.3.4. ОЕіределение оптимального времени сенсибилизации иммунологических планшетов твердофазными антигенами 51
4.3.5. Проверка различных иммунологических планшетов в НТК ИФА 58
43.6. Выбор оптимальных условий инкубации антител с твердофазным антигеном в НТК ИФА 59
4.3.7. Проверка чувствительности реакции НТК ИФА для определения кленбутерола 60
4.3.8. Определение специфичности тест-системы 61
4.4. Разработка способов подготовки биологического материала для определения кленбутерола методом ИФА 64
4.4.1. Подготовка образцов мышечной ткани и печени 64
4.4.2. Подготовка образцов шерсти 67
4.4.3. Извлечение кленбутерола из сетчатой оболочки глаза 69
4.4.4. Извлечение кленбутерола из корма 71
4.4-5. Подготовка образцов мочи 72
4.4.6. Определение оптимального разведения экстрактов 71
4.4.7. Определение предела обнаружения 75
4.4.8. Комиссионные испытания 76
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 78
6. ВЫВОДЫ 89
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 91
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ 92
9. ПРИЛОЖЕНИЯ 106
- Общая характеристика [3-адрепостимуляторов
- ИсполЕлуемыс реактивы и материалы
- Подготовка образцов мышечной ткани и печени
Введение к работе
Помимо фармакологического эффекта эти вещества обладают и токсическим действием, поэтому, потребление людьми в пищу мяса и субпродуктов животных, получавших такие препараты с кормом для стимуляции роста, может вызвать отравление, проявляющееся в таких клинических признаках, как нарушение сердечного ритма, мышечный тремор, гипокалисмия, тахифилаксия, головные боли, мышечные спазмы, повышение артериального давления. Особенно опасно потребление таких продуктов людьми с заболеваниями сердца и сердечно-сосудистой системы. В различных странах зафиксированы массовые случаи отравления людей при потреблении мяса и говяжьей печени, содержащей остаточные количества этих прспаратов[45, 46].
В России опубликованы результаты исследований, в которых рекомендуется применять КБ в качестве стимулятора роста при выращивании крупного рогатого скота. При этом риск воздействий остаточного содержания КБ в продукции животноводства на здоровье потребителей не оценивался [1, 2, 3].
Использование р-адреностимуляторов в качестве стимуляторов роста для повышения продуктивности "животных запрещено в Российской Федерации и странах Европейского союза (35, 36). Этот запрет связан с риском негативного воздействия остаточного содержания этих препаратов в продукции животноводства на здоровье потребителей [105].
Негативные воздействия остаточного содержания р-адреностимуляторов в продукции животноводства на здоровье людей, особенно кленбутерола -наиболее опасного препарата этой группы, сделали актуальным проведение широкомасштабного мониторинга за их использованием. Такой мониторинг должен основываться на сочетании преимуществ использования экспрессных иммунолимическнх реакций с достоинствами современных арбитражных спектрометрических методов анализа.
Для обеспечения выполнения работ по мониторинг) необходимо создание чувствительной и специфичной тест-системы для быстрого определения КБ и других препаратов этой группы в биологических образцах. Наиболее перспективным является использование иммунохимических методов для скрининга препаратов этой группы, поскольку такие методы обладают высокой чувствительностью, простотой проведения анализа, низкой себестоимостью, и позволяют проводить анализ большого количества образцов за короткий промежуток времени [37, 40, 84, 16].
Цель и задачи исследований
Целью нашей работы являлось создание чувствительной и специфичной тест-системы для контроля за применением КБ в качестве стимулятора роста на стадии выращивания животных и определения его остаточного содержания в продукции животноводства экспресс-методом ИФА,
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1.Получить иммунорсагенты: конъюгаты КБ с высокомолекулярными белками-носителями и специфические антитела для определения КБ лммунохимическим методом.
2.11а основе полученных иммупореагентов оптимизировать условия проведения процедуры непрямого твердофазного конкурентного ИФЛ (НТК ИФЛ) для определения КБ в биологическом материале. Определить чувствительность и специфичность метода.
3.Разработать простые и эффективные способы подготовки биологического материала для определения КБ методом ИФА.
4.0сновываясь на данных по фармакокинстике КБ в организме лабораторных и сельскохозяйственных животных обосновать выбор биосубстратои для контроля за применением КБ на стадии выращивания животных, а также определения его остаточного содержания в продукции животного происхождения.
5.Провести комиссионные испытания разработанной тест-системы.
б.Разработать нормативную документацию и зарегистрировать в РФ тест-систему для определения КБ в кормах и биологических субстратах методом ИФА.
Ниучнян новизна работы
Впервые в Российской Федерации получены высокоспецифичные иммунореагенты - конъюгаты КБ с белками-нисителями и специфические антитела.
На основе полученных иммунореагентов создана чувствительная и специфичная тест-система, для обнаружения КБ в биологических субстратах на основе НТК ИФА.
Разработаны простые и экономичные методы экстракции КБ из кормов, биологических "жидкостей, органов и тканей животных, позволяющие не применять дополнительную очистку экстрактов методом твердофазной экстракции (ТФЭ) и обеспечивающие высокую чувствительность определения КБ методом ИФЛ.
Основываясь на данных по фармакокинетике КБ в организме лабораторных и сельскохозяйственных животных, обоснован выбор органов и тканей для эффективного контроля за применением КБ в животноводстве.
Практическая значимость работы
Впервые в Российской Федерации создана тест-система для определения КБ в кормах, биологических жидкостях, органах и тканях животных методом НТК ИФЛ.
Тест-система позволяет определять не только кленбутерол, но и р-адреиостимуляторы фенольного (сальбутамол ) и резорцинового (тербуталин) типа.
Па тест-систему утверждена нормативная документация. Тест-система зарегистрирована в РФ и налажено серийное производство наборов для выявления КБ в биологических образцах методом ИФА.
Тест-система может быть использована для мониторинга за применением КБ в качестве стимулятора роста на стадии выращивания животных и определения его остаточного содержания в продукции -животного происхождения
Апробации работы
Основные результаты диссертационной работы доложены на:
1. 11-ом Московском международном ветеринарном конгрессе (Москва, 2003).
2. 11-ом съезде «Общества биотехнологов России» {Москва, 2004).
3. 3-ей Международной конференции «Экстракция органических соединении» (Воронеж, 2005).
4. XIV Всероссийского ветеринарного конгресса (Москва, 2006).
5. Международном конгрессе но аналитической химии ICAS-2006 (Москва, 2006).
Основные положения диссертации, выносимые на зашиту
1. Получение специфических иммунореагентов и подбор, на их основе, оптимальных условий проведения НТК ИФА для определения КБ.
2. Разработка простых и эффективных способов подготовки биологического материала для определения КБ методом ИФА.
3. Результаты комиссионных испытаний разработанной тест-системы.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ в различных изданиях с изложением основных положений и выводов диссертационной работы, в том числе в ведущих научных журналах и изданиях.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на П I страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературных источников и приложения. Работа иллюстрирована 7 рисунками и 24 таблицами. Список литературы содержит 117 источников, в том числе 109 иностранных.
Общая характеристика 3-адрепостимуляторов
При изучении фармакологических свойств препаратов этой группы в организме были обнаружены р-адренорсцепторы, подразделяющиеся, в свою очередь, на Рг и Р2-адрснорецепторы. РрАдренорецспторы локализуются преимущественно в миокарде. Их возбуждение приводит к тахикардии и усилению сердечного выброса. Pi-Адренорецепторы локализованы в бронхах и возбуждение их сопровождается бронхорасширяющим действием [92,93].
Разные адреномиметическис препараты по-разному влияют на рг и Рг-алренорецепторы. Далее речь пойдет о препаратах, преимущественно влияющих на р -адренорецепторьт, которые более правильно называть р2-ядреностимуляторами.
В механизме биологического действия Р?-адреностимуляторов главную роль играет их способность стимулировать аденилатциклазу (АЦ), Рецептор (Р) сообщается с АЦ посредством активаторного белка (Gs). После закрепления 3-адреностимулятора на рецепторе, происходит активация АЦ, которая преобразует АТФ в цАМФ. Накопившийся в клетках цАМФ, влияя тта систему їіротеинкиназьі, лишает миозин способности соединяться с актином, что тормозит сокращение гладкой мускулатуры, способствует расслаблению бронхов и снятию бронхоспазмов. Кроме того, р2-адреностимуляторы тормозят высвобождение из тучных клеток медиаторов (гистамина, лейкотриепа Д4 и др.), способствующих спазмам бронхов и явлениям воспаления [101, 70].
Биологическое действие р:-адреностимуляторов сходно с действием стероидных гормонов. В десятикратной, но сравнению с терапевтической, дозе КБ обладает анаболическим эффектом [94, 1! 7]. Стимулируя р-адрснорецепторы на поверхности клеток мышечной ткани, р-адреностимуляторы усиливают синтез белка и гипертрофию клеток путем ипгибирования протеолиза [110]. В жировой ткани р-адреностимуляторы стимулируют липолиз. Все это приводит к тому, что общее содержание в туше жировой ткани снижается до 40%, а белка повышается до 40% («перераспределительный эффект») [47, 26, 11]. Это приводит к улучшению состава мяса, а именно, увеличению постной массы и снижению количества жира, что очень ценно для мясной промышленности [1, 2, 3].
В 1933 г. было высказано предположение, что связывание с р-адренорсцсптором происходит по трем участкам молекулы р-адрсномиметика: [3-гидроксильной группе, алифатическому атому азота и ароматическому кольцу. Последующие исследования показали, что заме ні ! любого из трёх участкон молекулы [3-адреномиметика могут иметь резко выраженное влияние на связывание с рецептором и стимулирующую активность [87].
Ароматическое кольцо, присоединённое к [3-углероду, оказывает существенное влияние на биологическую активность Р-адреномимстика. Оно обычно замещено гидроксильными группами, галогенами, аминами, гидроксиметильными группами, цианистыми группами или различными комбинациями. Замены этих групп в ароматическом кольце оказывают влияние на связывание с рецепторами и продолжительность жизни в тканях млекопитающих и птиц [21]. Почти все ароматические группы содержат атомы галогена, заменяющие гидроксильные группы. Примером может служить кленбутерол. Атомы галогена не ингибируют связь с рецептором и предотвращают быструю метаболическую деградацию, которая происходит с гидрокешшрованньш кольцом. Кленбутерол был синтезирован как устойчивый к быстрой метаболической деградации ферментами, активными к ароматическим гидроксильным группам.
В дозе, в 10 раз превышающей терапевтическую, р3-адреностимуляторы оказывают побочное действие, которое связано с их [ -активностью и проявляется в нарушении сердечного ритма, мышечном треморе, гипокалиечин, тахифилаксии, головных болях, мышечных спазмах, повышении артериального давления, тошноте. Это делает опасным потребление мяса животных, содержащее остаточные количества [їі-адреностимуляторов, людьми с сердечно-сосудистыми заболеваниями [107].
ИсполЕлуемыс реактивы и материалы
Конъюгаты кленбутерола (КБ) с бычьим сывороточным альбумином (БСА), кроличьим сывороточным альбумином (КСА), желатиной (Ж) и яичным альбумином (ЯА). Конъюгаты кленбутерола были синтезированы без предварительной модификации молекулы методом диазотирования [101].
Специфические поликлональные кроличьи сыворотки, полученные на введение коныогата КБ с БСА.
Образны шерсти, сетчатой оболочки глаза КРС, мочи, корма, мышечной и печёночной ткани КРС с внесением известного количества раствора кленбутерола.
Образцы шерсти, глазного яблока, мочи, мышечной и печёночной ткани КРС и кроликов, не без внесения кленбутерола (контроль).
Образцы шерсти, глазного яблока, мочи, мышечной и печёночной ткани бычков и кроликов, получавших препарат КБ с кормом в эксперименте.
Аттестованный стандартный образец бычьей печени с содержанием КБ 1,20 мкг/кт (Certified reference material BCR-649, IRMM, Бельгия).
Аттестованный стандартный образец бычьей мочи с содержанием КБ 6,01 мкг/л (Certified reference material BCR-504, IRMM, Бельгия).
Аттестованный стандартный образец бычьей мочи с содержанием КБ 3,30 мкг/л («R-Biopharm GmbH», Германия).
Растворы раствор №1 - карбонат-бикарбонатный буфер, 0,05М, рН 9,4-9,6: 1,47 г NaHCOj, 0,8 г Na COj доводили дистиллированной водой до 1000 мл.
раствор №2 - отмывочный буфер, 0,15 М NaCl с 0,05% твина-20: 8,775 г NaCl, 0,5 мл Tween 20, доводили дистиллированной водой до 1000 мл. раствор №3 - фосфатный буфер с 0,05% твина-20 и 1% БСА, рН 7,2-7,4: 1,45 г Na2HP04 12H20, 0,8 г КН2Р04, 0,1 г KCL, 4,0 г NaCl, 0,25 мл Tvveen 20 доводили дистиллированной водой до 500 мл. раствор хромогенного субстрата на основе 3,3 ,5,5 -тетраметилбензидина (ТМБ) с добавлением перекиси водорода, готовый для использования.
0,5М раствор серной кислоты.
0,01 н раствор соляной кислоты.
0,1н раствор соляной кислоты.
0,01 и раствор хлорной кислоты. V 0,1 н раствор хлорной кислоты.
0,1М Трис-буфер, рН 9,5: 1,21 г трис(гидроксиметил)аминометана доводили дистиллированной водой до 100 мл. При необходимости с помощью рН-метра доводили значение рН раствора до 9,5±0,1, добавляя по каплям, 0,1 и раствор соляной кислоты и постоянно перемешивая. 0,2М ацетатный буфер, рН 5,2: 2,12 г CH3COONa 3H20 доводили дистиллированной водой до 100 мл. При необходимости с помощью рН-метра доводили значение рН раствора до 5,2±0,1, осторожно по капля прибавляя 20% раствор уксусной кислоты и постоянно перемешивая. Смесь этилового эфира уксусной кислоты с изопропанолом в соотношении 3:2 по объёму. Калибровочные растворы, СБ, ТБЛ, АД в воде с концентрациями 1, 10, 50,100, 200 и 400 иг/мл. Калибровочные растворы КБ в воде с концентрациями 0,01, 0,05, 0,25, 1,25, 6,25 нг/мл.
Подготовка образцов мышечной ткани и печени
Предварительно образцы освобождали от соединительной ткани и измельчали. Для оценки эффективности способа экстракции использовали образцы печени и мышечной ткани КРС с добавлением известного количества КБ и без добавления КБ (контроль).
Измельчённую ткань смешивали с 0,2 М ацетатным буфером, рН 5,2 в равном соотношении и гомогенизировали до однородной массы. Отбирали навеску гомогената, содержащую 1 г ткани и проводили экстракцию КБ.
Для денатурации белков и последующей экстракции КБ мы применили обработку юмогената ткани соляной кислотой и хлорной кислотой с различной нормальностью в сочетании с последующей отмывкой осадка дистиллированной водой. Падосадочную жидкость объединяли, доводили её рН до 7,0 и анализировали методом ИФА (п.3.2.9 способы №1, №2 и №3).
Основными показателями, характеризующими полученные экстракты, являются степень извлечения кленбутерола из образца с известной добавкой, и процент связывания (ПС) антител при анализе образца без добавки КБ (контроль).
Исходя из полученных данных можно сделать вывод, что при обработке гомогената печени хлорной кислотой с большей нормальностью при сходных показателях уровня фонового сигнала (фона) в контроле, извлечение КБ проходит несколько эффективнее (таблица 5). Экстракция соляной кислотой приводила к низким показателям степени извлечения КБ. Сравнение эффективности извлечения КБ при экстракции соляной кислотой и хлорной кислотой с различной нормальностью Для повышения извлечения КБ из тканей мы применили методику, сочетающую в себе обработку гомогената 0,1 н хлорной кислотой и последующую экстракцию смесью органических растворителей этилацетат/изопропанол (3:2, об/об) (п.3.2.9, способы №4 и №5). При этом исследовали влияние промежуточного этапа отмывки осадка дистиллированной водой на степень извлечения КБ.
Этап экстракции органической смесью (п.3.2.9, способ №5) давал существенное повышение степени извлечения КБ, а дополнительная отмывка осадка дистиллированной водой повышала извлечение КБ. При этом влияние фона в контроле было ниже (таблица 6). Экстракты КБ из печени, полученные с использованием 0,1 и хлорной кислоты с последующей экстракцией смесью этилацетат/изопропанол, были исследованы двумя независимыми методами: разработанным нами НТК ИФА и ГХ-МС. Часть образцов дополнительно подвергали очистке методом ТФЭ 66 другие использовали без очистки. Применение предложенного способа пробоподіотовки печени позволило достичь высокой степени извлечения КБ и приемлемой чистоты экстракта для определения скрининг методом (НТК ИФА) без дополнительной очистки методом ТФЭ. При этом наблюдалась хорошая сопоставимость результатов ИФА и ГХ-МС (таблица 7).
