Содержание к диссертации
1. Список используемых сокращений 4
2. Введение 6
3. Обзор литературы 11
3.1. Краткая характеристика ортопоксвирусных инфекций человека 11
3.1.1. Вирус осповакцины 12
3.1.2. Вирус оспы коров 13
3.1.3. Вирус оспы обезьян 15
3.1.4. Вирус натуральной оспы 17
3.2. Современные молекулярно-диагностические методы в диагностике ортопоксвирусных инфекций на основе ПЦР
3.2.1. ПДРФ анализ 19
3.2.2. Олигонуклеотидные микрочипы 21
3.2.3. ПЦР в реальном времени 23
3.3. Мультиплексная ПЦР 29
3.3.1. Применение метода МПЦР в диагностике вирусных нейроинфекций 33
3.3.2. Применение метода МПЦР в диагностике респираторно-вирусных 35 инфекций
3.3.3. Применение метода МПЦР в диагностике урогенитальных инфекций 38
3.3.4. Применение метода МПЦР в NAT-скрининге донорской крови 41
3.3.5. Перспективы применения метода МПЦР в диагностике ортопоксвирусных 43 инфекций человека
4. Материалы и методы 45
4.1. Материалы 45
4.2. Выделение ДНК вирусов оспы коров или осповакцины из инфицированной 46 клеточной культуры
4.3. Компьютерный анализ 47
4.4. Амплификация ДНК 47
4.5. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля при помощи набора QIAquick 48 фирмы «QIAGEN», Германия
4.6. Секвенирование ДНК 48
4.7. Приготовление компетентных клеток E.coli 49
4.8. Трансформация компетентных клеток E.coli 49
4.9. Выделение плазмидной ДНК в препаративном варианте з
4.10. Выделение плазмидной ДНК в аналитическом варианте 51
4.11. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции 51
4.12. Лигирование 51
4.13. Электрофоретическии анализ нуклеиновых кислот в агарозном геле 51
5. Результаты и обсуждения 52
5.1. Выбор олигонуклеотидных праймеров для мультиплексного ПЦР 52
5.2. Исследование ДНК VARV-специфичного района генома CPXV 69
5.3. Конструирование положительного контрольного образца для разработанной 81 методики видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов
5.4. Оценка специфичности метода МПЦР 86
5.5. Оценка чувствительности метода МПЦР 6. Заключение 97
7. Выводы 102
8. Список литературы 1
Введение к работе
Род Orthopoxvirus семейства Poxviridae включает такие патогенные для человека виды, как вирусы натуральной оспы (VARV), оспы обезьян (MPXV), оспы коров (CPXV), и осповакцины (VACV). VARV вызывает одно из наиболее опасных инфекционных заболеваний человека. Известно, что штаммы VARV различного географического происхождения могут вызывать поражения человека, отличающиеся по тяжести и формам протекания заболевания. Оспа, характеризующаяся легким течением и летальностью 0,1-2%, исторически получила название малая оспа (variola minor), в то время как оспу, вызывающую тяжелые заболевания с летальностью до 40%, относят к большой оспе (variola major) (Dixon, 1962). В Азии был распространен тип variola major, тогда как в Африке существовали оба типа VARV (Fenner et al, 1989). Штаммы малой оспы в Америке принято называть alastrim. Биологические тесты выявили четкие отличия вирусов alastrim как от вирусов variola major, так и от изученных африканских изолятов variola minor по таким параметрам, как предельная температура размножения вируса на хорионаллантоисной оболочке куриных эмбрионов и гемадсорбция при 40 °С (Dumbell andHuq, 1986).
Оспа обезьян у человека по характеру клинического течения напоминает тип натуральной оспы, преобладавшей на Африканском континенте, и регистрируется, в основном, в Центральной и Западной Африке. Летальные случаи, а также случаи передачи инфекции от человека к человеку, наблюдались главным образом среди невакцинированного населения.
Оспа коров у человека, в основном, протекает доброкачественно и характеризуется развитием единичных местных поражений. У иммунодефицитных людей может приобретать генерализованную форму с летальным исходом. Заболевание регистрируется в большинстве стран Европы и некоторых странах восточной Азии и Латинской Америки. Источником инфекции для человека являются грызуны (основной природный резервуар вируса) или домашние животные (промежуточный хозяин).
Широкомасштабные мероприятия, предпринятые мировым сообществом под эгидой Всемирной организации здравоохранения по вакцинопрофилактике населения Земного шара против натуральной оспы, привели к ликвидации этого заболевания на планете (Маренникова и Щелкунов, 1998). В настоящее время коллекции вирусов натуральной оспы поддерживаются только в двух сотрудничающих центрах ВОЗ: в ФГУН Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Кольцово, Россия) и в Центре по контролю и профилактике заболеваний (CDC, Атланта, США). В результате повсеместного прекращения после 1980 года иммунизации против VARV доля населения, чувствительного к VARV и другим ортопоксвирусам, постоянно увеличивается. Об этом свидетельствует участившиеся вспышки инфицирования людей такими вирусами, как вирус оспы обезьян и вирус оспы коров (Stephenson, 2003; Lewis-Jones, 2004). Кроме того, VARV рассматривают как возможный агент биотеррористических атак (Онищенко и др., 2000; Spencer and Lightfoot, 2001; Breman and Henderson, 2002).
Потенциальное увеличение опасности ортопоксвирусных инфекций для человека привело к необходимости разработки эффективных методов быстрой диагностики и идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека. Используемые биологические и серологические методы оказываются недостаточно эффективными для детекции и экспресс-диагностики в том плане, что биологический анализ длителен (3-6 суток) и сопряжен с необходимостью работы с опасными вирусами. Серологические методы позволяют идентифицировать, как правило, только родовую принадлежность вирусов, и их чувствительность не всегда достаточна при анализе клинических образцов. Это обстоятельство делает актуальным разработку комплекса методов современной экспресс диагностики патогенных для человека ортопоксвирусов.
Появление метода амплификации фрагментов ДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР) создало предпосылки к разработке вариантов процедур экспресс идентификации ортопоксвирусов. В настоящее время описано применение ПЦР для детекции ортопоксвирусов с использованием единых олигонуклеотидных праймеров к району генов, кодирующих гемагглютинин, белок тел включения типа А и гомолог рецептора фактора некроза опухолей (Ropp et al, 1995; Meyer et al, 1997; Loparev et al, 2001). Во всех этих работах полученные после ПЦР фрагменты ДНК гидролизовали определенными рестриктазами и разделяли электрофорезом, что позволяло по картине расположения субфрагментов осуществлять видовую идентификацию ортопоксвирусов. Однако при анализе достаточно большого набора изолятов какого-либо вида ортопоксвирусов, выявлялась их гетерогенность по спектру получающихся субфрагментов, что вносило неоднозначность в трактовку получаемых результатов.
На основе полученных в нашем отделе и других лабораториях данных о геномных последовательностях ортопоксвирусов, возникла возможность выявления видоспецифичных районов ДНК этих вирусов и разработки простой и надежной методики одностадийной экспресс идентификации четырех видов ортопоксвирусов, патогенных для человека, основанной на применении мультиплексной полимеразной цепной реакции (МПЦР). Цели и задачи исследования.
Цель работы: Разработка одностадийного метода видоспецифичной диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов - вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины - на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции.
Основные задачи исследования:
1. Подобрать олигонуклеотидные праймеры для мультиплексного ПЦР, обеспечивающие видоспепифичную амплификацию ортопоксвирусных ДНК и образующих в МПЦР продукты разной длины, характерные для каждого вида ортопоксвируса.
2. Оптимизировать параметры МПЦР с выбранными олигонуклеотидами.
3. Сконструировать положительный контроль методики МПЦР диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов на основе клонированных специфичных ДНК-амшшконов.
4. Определить основные аналитические и диагностические характеристики разрабатываемой методики видоспецифичной диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов методом МПЦР.
