Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Вирусные заболевания культивируемых видов рыб 11
2.1.1. Семейство Rhabdoviridae 11
2.1.1.1. Структура рабдовирусов 11
2.1.1.2. Особенности генома рабдовирусов рыб 13
2.1.2. Некоторые заболевания культивируемых видов рыб, вызываемые рабдовирусами 16
2.1.2.1 Инфекционный некроз гемопоэтической ткани (ИНГТ) 16
2.1.2.2. Вирусная геморрагическая септицимия (ВГС) 17
2.1.2.3. Весенняя виремия карпа (ВВК) 18
2.1.3 Методы профилактики и лечения вирусных заболеваний рыб 19
2.2. Методы диагностики вирусных заболеваний рыб 21
2.2.1. Традиционные методы диагностики вирусных заболеваний в аквакультуре 21
2.2.2. Гибридизация нуклеиновых кислот 22
2.2.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и молекулярно-генетический анализ - 25
2.2.3.1. Новейшие модификации метода ПЦР в диагностике вирусных инфекций рыб ' 31
2.2.3.1.1. Мультиплексная ПЦР 31
2.2.3.1.2 ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR) 31
2.3. Генетическое типирование и филогенетический анализ рабдовирусов рыб 34
2.3.1. Вирус геморрагической септицимии 35
2.3.2. Вирус инфекционного некроза гемопоэтической ткани 42
2.3.3. Вирус весенней виремии карпа 49
2. 4. Заключение 51
3. Материалы и методы 54
3. 1. Материалы 54
3.2. Методы ' 59
3.2.1. Выделение вирусной РНК 59
3.2.2. Синтез ДНК, комплементарной вирусной РНК 59
3.2.3. Амплификация фрагмента N-гена SVCV 59
3.2.4. Полимеразная цепная реакция на кДНК вируса IHN 60
3.2.5. Анализ первичной структуры ДНК 60
3.2.6. Выравнивание последовательностей фрагментов N-генов SVCV и IHNV и поиск сайтов рестрикции 61
3.2.7. Филогенетический анализ 61
3.2.8. Гидролиз фрагментов N-гена SVCV и IHNV эндонуклеазами рестрикции (ПДРФ-анализ) 61
3.2.9. Штамм-специфическое типирование SVCV
(ПЦР с праймерами Nros 11 Rev - Nros2) 62
3.2.10. Элюция из ПААГ фрагмента N-гена IHNV 62
3.2.11. Лигирование фрагмента N-гена IHNV с векторной ДНК 62
3.2.12. Подготовка компетентных клеток Е. Coli и трансфекция рекомбинантным бактериофагом М13 63
3.2.13 Выделение RF-формы фаговой ДНК и анализ клонов 63
3.2.14. Выделение однонитевой ДНК фага М13 64
3.2.15. Мечение ДНК-зонда N-гидроксисукцинимидным эфиром биотина 65
3.2.16. Гибридизация вирусной РНК с биотинилированными ДНК-зондами 65
3.2.17. Выявление биотиновых групп на фильтрах 65
4. Результаты и обсуждение 67
4.1. Разработка методов выявления вируса весенней виремии карпа (SVCV) на основе полимеразной цепной реакции 67
4.1.1. Амплификация фрагментов генома SVCV 67
4.1.2. Определение специфичности и чувствительности выявления РНК SVCV методом ОТ-пгПЦР 68
4.1.3. Эффективность выявления вируса SVC методом ОТ-пгПЦР в полевых материалах от рыб 70
4.1.4. Определение эффективности метода ОТ-пгПЦР в ходе развития инфекции на пробах от экспериментально зараженных рыб 73
4.1.5. Оценка эффективности выявления вируса SVC методом ОТ-пгПЦР с использованием в реакции обратной транскрипции праймеров прямой и обратной ориентации 77
4.2. Генетическое типирование изолятов SVCV 82
4.2.1. Разработка метода штамм-специфической ПЦР 82
4.2.2. Рестрикционный анализ фрагмента N-гена SVCV 83
4.2.3. Филогенетический анализ изолятов SVCV на основании нуклеотидной последовательности фрагмента N-гена (405 пн) 91
4.2.4. Типирование вирусных штаммов в клинических материалах от рыб с помощью рестрикционного анализа ^ 95
4.3. Разработка методов выявления вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани (IHNV) на основе гибридизационного анализа 97
4.3.1. Конструирование ДНК-зонда для IHNV на основе ДНК фага МІ3 97
4.3.2. Гибридизационный анализ 98
4.4. Разработка метода выявления вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани с помощью ОТ-ПЦР 101
4.4.1. Амплификация фрагментов генома IHNV 101
4.4.2. Определение чувствительности и специфичности выявления РНК IHNV методом ОТ-пгПЦР 104
4.4.3. Определение эффективности метода ОТ-пг ПЦР в ходе развития инфекции на пробах от экспериментально зараженных рыб 104
4.4.4. Тестирование клинических материалов от естественно зараженных рыб 107
4.4.5. Оценка эффективности выявления вируса IHN методом ОТ-пгПЦР с использованием в реакции обратной транскрипции праймеров прямой и обратной ориентации 108
4.5. Генетическое типирование изолятов IHNV 111
4.5.1. Генетическое типирование изолятов IHNV с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) 111
4.5.2. Филогенетический анализ некоторых изолятов IHNV на основании нуклеотидной последовательности фрагмента N-гена (460 пн) 117
5. Выводы 120
6. Список использованной литературы
- Особенности генома рабдовирусов рыб
- Традиционные методы диагностики вирусных заболеваний в аквакультуре
- Амплификация фрагмента N-гена SVCV
- Определение специфичности и чувствительности выявления РНК SVCV методом ОТ-пгПЦР
Введение к работе
История аквакультуры насчитывает тысячи лет, беря свое начало в государствах Древнего Востока. Однако за последние 20-25 лет в ее развитии произошли революционные изменения, вызванные истощением биологических ресурсов океана и континентальных пресных вод, издавна служивших человеку источником высокоценных пищевых продуктов. Будучи сегодня самым перспективным и быстрорастущим сектором сферы производства продуктов питания, аквакультура все больше замещает промышленный промысел гидробионтов в дикой природе.
Серьезным препятствием на пути успешного развития аквакультуры являются болезни объектов культивирования, при этом основной ущерб наносят вирусные инфекции рыб. Несмотря на то, что современная ихтиовирусология - сравнительно молодая наука, уже обнаружено около 350 вирусов гидробионтов. Список открываемых вирусов, как правило, пополняется после введения в аквакультуру новых объектов разведения (Щелкунов И. С, 2006).
Рабдовирусы составляют группу особо значимых вирусных патогенов культивируемых видов рыб. Наиболее интенсивно изучались вирусы, инфицирующие лососевые породы, такие как вирус инфекционного некроза гемопоэтической ткани (IHNV) и вирусной геморрагической септицемии (VHSV), так как именно эти патогены имеют наибольшее экономическое значение для мирового производства рыбы. В России, наряду с инфекционным некрозом гемопоэтцческой ткани лососевых, весьма масштабной проблемой является весенняя виремия карпа (ВВК), вызываемая вирусом SVCV.
В последнее время большое внимание уделяется разработке методов молекулярно-генетической диагностики вирусных инфекций рыб, основанных на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР). Эти методы обладают рядом очевидных достоинств, среди которых быстрота получения результата, высокая чувствительность и специфичность, возможность осуществления генетического типирования изолятов.
Для создания эффективной системы ПЦР-диагностики очень важны данные по изменчивости геномов патогенных штаммов вируса, выделенных от хозяев из разных географических областей. Эти данные необходимы для создания тест-систем, способных различать генетические варианты вируса и, тем самым, прослеживать пути распространения инфекции. Цели и задачи исследования
Целью настоящего исследования было создание эффективных диагностических тест-систем на вирусы SVC и ,IHN на основе методов ПЦР и молекулярной гибридизации, изучение генетического разнообразия данных патогенов, а также разработка методов их генотипирования с помощью молекулярно-биологических методов.
В ходе работы решались следующие задачи:
1. Разработка метода ОТ-пгПЦР для выявления вирусов весенней виремии карпа и инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых.
2. Конструирование зондов и создание системы детекции IHNV с помощью гибридизационного анализа.
3. Определение чувствительности и специфичности разработанных методов идентификации SVCV и IHNV в зараженной культуре клеток и в клиническом материале от инфицированных рыб.
4. Разработка способов генетического типирования штаммов SVCV и IHNV на основании методов ПЦР и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).
5. Филогенетический анализ штаммов SVCV и IHNV на основе данных о нуклеотидной последовательности участков генов нуклеопротеина.
Положения, выносимые на защиту
1. Системы ОТ-пгПЦР-диагностики на вирусы весенней виремии карпа (SVCV) и инфекционного некроза гемопоэтической ткани (IHNV) позволяющие выявлять вирусную РНК с высокой .чувствительностью и специфичностью в препаратах культуральных вирусов и в клиническом материале от больных рыб.
2. Способ генотипирования рабдовирусов рыб с помощью ПДРФ-анализа. Все исследуемые изоляты SVCV образуют пять генетических групп. Исследованные изоляты IHNV принадлежат к трем основным геногруппам (U, М и L).
3. Филогенетическое исследование участков гена нуклеопротеина для восемнадцати изолятов SVCV и тринадцати изолятов IHNV. Изоляты SVCV образуют генетические группы в зависимости от географии их выделения. Камчатский изолят IHNV генетически близок североамериканским изолятам геногруппы U, а изоляты, выделенные в подмосковном регионе, образуют обособленную подгруппу в составе геногруппы U.
Научная новизна и практическая ценность работы
В результате проделанной работы на основе методов полимеразной цепной реакции и гибридизации нуклеиновых кислот впервые созданы тест-системы для идентификации РНК вирусов весенней виремии карпа и инфекционного некроза гемопоэтической ткани в инфицированных культурах клеток, в органах и тканях рыб. Разработаны методы генетического типирования изолятов указанных патогенов с помощью ПЦР и ПДРФ-анализа. Впервые проведен филогенетический анализ последовательностей гена нуклеопротеина для 12 российских и 6 европейских изолятов SVCV и показано их различие на генетическом уровне. Также выполнен филогенетический анализ последовательностей гена нуклеопротеина для изолятов IHNV. Проведено сравнение изолятов, выделенных из естественных водоемов Камчатки и из форелевых рыбоводных хозяйств Московской и Тверской областей с изолятами, распространенными на Тихоокеанском побережье Северной Америки.
Результаты настоящих исследований могут представлять интерес для практического рыбоводства, так как позволяют специфично, с высокой чувствительностью и в короткие сроки выявлять патогены, вызывающие наиболее опасные заболевания разводимых видов рыб (карповых" и лососевых). Знание эпизоотической обстановки как в естественных водоемах, так и на рыбоводных заводах и хозяйствах позволяет оценивать риск распространения опасных вирусных агентов среди разводимой рыбы, и, как следствие, избегать существенных экономических потерь. Информация, полученная с помощью разработанных методов генотипирования SVCV и IHNV, поможет проследить перемещение генетических вариантов вирусов, как в России, так и за рубежом при перевозке икры и живой рыбы для воспроизводства, что позволит своевременно и эффективно осуществлять соответствующие профилактические мероприятия.
Апробация работы и публикации
По материалам диссертации Опубликовано три статьи в реферируемых научных журналах и одна в книге «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». Полученные результаты были представлены на трех международных конференциях: Second United States and Russia Bilateral Conference "Aquatic&Marine Animal Health" (Shepherdstown, West Virginia, USA, 2003), 2-ой международной конференции (Москва, МГУ, 2004), международной научно-практической конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006).
Вклад автора
Выделение препаратов РНК вирусов, конструирование ДНК-зонда для IHNV на основе ДНК фага М13, мечение ДНК-зонда N-гидроксисукцинимидным эфиром биотина, гибридизационный анализ, выравнивание последовательностей фрагментов N-генов SVCV и IHNV, поиск сайтов рестрикции, ПЦР-ПДРФ анализ всех изученных изолятов SVCV и IHNV выполнен автором самостоятельно. Секвенирование ПЦР-фрагментов проводилось А.Г. Блиновым (ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск), И.В. Бабкиным и А.В. Качко (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, г. Новосибирск). Филогенетический анализ генетического разнообразия изолятов вирусов проведен автором совместно с И.В. Бабкиным.
Особенности генома рабдовирусов рыб
Все гены рабдовирусов рыб начинаются с последовательности ААСА, которая таким образом, может быть принята за консенсусную последовательность старт-сигнала для транскрипции всех вирусов этого семейства. Терминальная последовательность AG ATAG(A)7, найденная у всех рабдовирусов рыб, отличается от консенсусной последовательности везикуловирусов и лиссавирусов млекопитающих (Benmansour et al., 1994).
Впервые сходство нуклеотидных последовательностей М-гена и 3 -терминальной последовательности для вируса весенней виремии карпа и вируса везикулярного стоматита (VSV), относящегося к роду Vesiculovirus, было устанолено Roy et al. (1984). Концевые 20 нуклеотидов SVCV оказались практически идентичными соответствующим последовательностям двух штаммов VSV (Indiana и New Jersy). В дальнейшем сравнение первых 1780 аминокислот РНК-полимеразы L SVCV с последовательностями L-белков других рабдовирусов показало наличие значительной гомологии с полимеразой VSV штамма Indiana, а также некоторая гомология была также обнаружена с полимеразой вируса бешенства (Bjorklund et al., 1995). Гомологичные участки представляли собой несколько высококонсервативных доменов, разделенных вариабильными районами. Консервативные последовательности с наибольшей вероятностью являются идентифицированными ранее функциональными доменами РНК-полимеразы. Между аминокислотными последовательностями L-белков SVCV и IHNV было обнаружено очень небольшое сходство. В дальнейших исследованиях (Hoffmann et al., 2002) на основании анализа тенома было проведено сравнение аминокислотных последовательностей белков SVCV с различными представителями семейства Rhabdoviridae. Авторами был определен, процент гомологии аминокислотных последовательностей всех пяти белков вируса с соответсвующими белками других рабдовирусов (таблица 1). Из приведенных в таблице данных следует, что наибольшую гомологию вирус весенней виремии карпа имеет с вирусом везикулярного стоматита.
Геном IHNV стал первым геномом рабдовируса рыб, для которого была полностью определена нуклеотидная последовательность (Schutze, 1995, Kurath, 1985). Он кодирует шесть белков в следующем порядке: З -лидер — N-P — М — G-Nv — L-5 .
Ген белка Nv не найден у вируса везикулярного стоматита, первого изученного представителя семейства рабдовирусов, и есть только у вируса бешенства в редуцированной форме. Ген, похожий на Nv, был найден в геноме VHSV (рис. 3) (Bernard et al., 1995).
Открытие нового вирусного гена, кодирующего невирионный белок Nv, побудило ученых добавить новый род, объединяющий рабдовирусы рыб, который был одобрен Интернациональным Комитетом по Таксономии Вирусов и назван Novirhabdovirus (Kurath et al., 1997). Кроме IHNV и VHSV к новирабдовирусам относятся рабдовирус змееголова (SHRV) и вирусы угря В12 и С26. Однако не все рабдовирусы рыб принадлежат к этому роду. Такие патогены, как вирус весенней виремии карпа (SVCV), рабдовирус мальков щуки (PFRV), рабдовирус озерной форели, вирус язвенной болезни (UDRV) и американский и европейский вирус угря (EVA и EVEX) являются представителями рода Vesiculovirus и имеют организацию генома, типичную для всех представителей этого рода.
Филогенетический анализ с использованием полных аминокислотных последовательностей N, Р, М и G-генов, а также частичной последовательности L-гена подтверждает близкие взаимоотношения между SVCV и классическими представителями рода Vesiculovirus (Bjorklund et al., 1996). Примеры подобных филогенетических деревьев для аминокислотной последовательности N и G-генов представлены на рис. 4.
Инфекционный некроз гемопоэтической ткани (ИНГТ) - острая вирусная болезнь молоди лососевых, выращиваемых в условиях рыбозаводов и рыбопитомников. К заболеванию восприимчивы кета, чавыча, горбуша, сима, стальноголовый лосось и лосось Кларка, но наиболее восприимчивой считается молодь нерки и радужной форели.
Впервые заболевание было зарегистрировано в 50-х годах прошлого века среди молоди нерки на рыбоводных заводах штатов Вашингтон и Орегон (США), расположенных в бассейнах рек Тихого океана. Затем эта инфекция распространилась по восточному побережью Северной Америки и в 1974 году была зарегистрирована на Аляске, после чего в течение нескольких лет стала эндемичной для штата Айдахо (Kurath et al., 2003). В 1977 году болезнь появилась в Японии, начиная с 1987 года вирус обнаруживается во Франции и в Италии, а в 1992 году он впервые был выделен из радужной форели в Германии (Brachhof at al., 1995). В России это заболевание впервые было обнаружено в 2000 г. у искусственно выращиваемой молоди радужной форели на рыбоводном заводе в Подмосковье (Shchelkunov et al., 2001). В 2001г. вирус впервые выделили на Камчатке в естественном водоеме у половозрелой нерки, используемой для заводского воспроизводства (Рудакова, 2003). В последующие годы вспышки данного заболевания отмечали у молоди нерки на лососевых рыбоводных заводах (Рудакова, 2004), а вирус регулярно выделяют от половозрелой нерки в естественных водоемах Камчатки (Rudakova, Bochkova, 2005).
Характерная клиническая картина заболевания - экзофтальмия, обширная гематома за головой, кровоизлияния вокруг ануса и у основания плавников, раздутое брюшко. Входными воротами инфекции являются клетки жаберного эпителия, а органами -мишенями для репликации вируса - почки и селезенка, которые поражаются первыми. На поздних стадиях инфекции поражаются практически все органы, включая сердце, печень и мозг. При вскрытии наблюдаются очаговые некротические поражения внутренних органов, геморрагия заднего отдела почки, поражение желудочно-кишечного тракта (Рудакова, 2003, Brudeseth et al., 2002).
Инфекционный некроз гемопоэтической ткани характеризуется быстрым течением и высокой смертностью. При неблагоприятных зоогигиенических условиях, антисанитарном состоянии водоемов и нарушении основных требований биотехники рыбоводства инфекционный некроз гемопоэтцческой ткани лососевых протекает обычно в тяжелой форме и сопровождается массовой гибелью заболевших рыб (90-99%).
Вирусная геморрагическая септицимия является одним из самых важных заболеваний рыб в экономическом отношении: смертность разводимой форели при вспышке инфекции достигает 90%, а прямые и косвенные потери европейской рыбоводной отрасли превышают 70 миллионов евро в год (Cupit et al., 2001)
Традиционные методы диагностики вирусных заболеваний в аквакультуре
Первыми работами по характеристике изолятов VHS, основанной на определении нуклеотидной последовательности N-гена европейских и американских штаммов, были работы Bernard et al.(1990, 1991, 1992). Было показано, что, несмотря на антигенную идентичность, разница между изолятами на нуклеотидном уровне составила около 13%.
В последующих работах Oshima at al. (1993) использовали метод РНК-фингерпринтинга с рибонуклеазой ТІ для генетического анализа пяти американских и четырех европейских изолятов VHSV. Было показано, что европейские изоляты образуют одну группу, а американские - другую. Данная методика могла быть использована для определения степени родства между различными штаммам вируса, однако она оказалась трудоемкой и трудно выполнимой при анализе большого количества проб. В связи с этим широкое распространение для типирования рабдовирусов рыб получил метод ОТ-ПЦР.
Сравнение нуклеотидной последовательности N-гена VHSV американского изолята Makah и европейской референсной линии 07—71 показало наличие уникальной последовательности размером 20 нуклеотидов в интронной области рядом с N-геном изолята Makah, которой не было у изолята 07-71. Деления этого района является характерной чертой европейских линий VHSV.
Einer-Jensen et al. (1995) с помощью ,ОТ-ПЦР с использованием специфичных праймеров к N-гену удалось показать, что данная последовательность является специфичной для всех американских изолятов.
Праймеры для данного исследования были выбраны на основании нуклеотидной последовательности N-гена изолятов Makah и 07-71 следующим образом: Р1 -смысловой праймер размером 23 нуклеотида, комплементарный вирусному геному обоих изолятов; Р2-антисмысловой . праймер размером 20 нуклеотидов, комплементарный последовательности кДНК обоих изолятов; РЗ-антисмыловой праймер размером 21 нуклеотид, комплементарный уникальной последовательности изолята Makah.
Исследовали 8 американских изолятов, выделенных из разных хозяев, и 13 европейских штаммов, также изолированных из разных видов рыб. Изоляты были выбраны так, что среди них наблюдались наибольшие серологические различия. В качестве отрицательного контроля были использованы два других рабдовируса рыб.
В результате амплификации с набором праймеров Р1 и Р2 был синтезирован фрагмент размером 724 пн для всех изолятов VHSV, тогда как при использовании набора праймеров Р1 и РЗ фрагмент размером 803 пн синтезировался лишь в том случае, если изолят содержал уникальную последовательность 20 нуклеотидов, как у изолята Makah.
Амплификаты анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Анализ полученных продуктов ПЦР различных изолятов VHSV показал, что их можно чётко разделить на две группы (независимо от серогруппы) — европейскую и североамериканскую. Уникальная геномная последовательность американских изолятов локализована в интроне и не транскрибируется, то есть её присутствие никак не сказывается на структуре N-белка, что объясняет отсутствие серологических различий между этими группами.
Четкое разделение на американскую и европейскую группы также показали Basurco et al. (1995) с помощью сравнения нуклеотидной последовательности генов гликопротеина и Nv-гена.
Более интенсивное изучение нуклеотидньгх последовательностей и филогенетический анализ изолятов VHSV из Европы и Северной Америки позволил выделить несколько основных генотипов вируса. В работе Benmansour et al. (1997) для изучения генетического разнообразия вируса VHS была определена последовательность G-гена 6 североамериканских и 8 европейских изолятов. Европейские изоляты ранее были подразделены на четыре серогруппы. Хотя было известно, что североамериканские изоляты гораздо менее вирулентны для лососевых видов рыб, чем европейские, их не удалось различить с помощью серологических и биохимических методов. Авторы выбрали для изучения G-ген VHSV, так как известно, что он кодирует единственный поверхностный белок и, таким образом, изменения на генетическом уровне могут коррелировать с подразделениями на серотипы.
На основании последовательности G-гена 14 исследованных изолятов были разделены на три группы (генотипа). Генотип I состоял из изолятов континентальной Европы, генотип II - из изолята, выделенного у берегов Британских островов (Шотландия), генотип III включал в себя американские изоляты. Генотип I далее подразделялся на три ветви, две из которых состояли из одного изолята серотипа 2 и 3 соответственно. Третья ветвь в свою очередь подразделялась еще на две ветви, каждая из которых состояла из изолятов, принадлежащих к серотипу 1, но выделенных из разных географических областей: Дании и Франции соответственно. Таким образом, генетическая классификация изолятов VHSV выявила четкую зависимость принадлежности изолята к тому или иному генотипу от его географического распространения. Ни время выделения, ни вид рыбы, из которой был выделен изолят, не влияло на его положение на филогенетическом дереве. Кроме того, не было найдено полного соответствия между генетической и серологической классификацией.
Амплификация фрагмента N-гена SVCV
В среду YT 2 объёмом 4 мл вносили 40 мкл ночной культуры Е. coli JM103 и наращивали клетки при 37С с интенсивным перемешиванием до оптической плотности D6oo=0,4-0,6. Полученную клеточную культуру выдерживали во льду в течение 20 мин, после чего центрифугировали на центрифуге Eppendorf Centrifuge 5415С 2 мин при 6000 об/мин. Осадок ресуспендировали в растворе 1, содержащем 10 гаМ MOPS, рН 7,0 и 10 mM RbCb. Суспензию центрифугировали 2 мин при 6000 об/мин, супернатант сливали и осадок ресуспензировали в растворе 2, содержащем 100 mM MOPS, рН 6,5, ЮтМ RbCb и 50тМ СаСЬ и оставляли во льду на 15 мин. Затем клетки мягко осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20-40 сек, тщательно удаляли супернатант, осадок ресуспендировали в 200 мкл раствора 2, добавляли 3 мкл ДМСО и не более 10 мкл раствора, содержащего фаговую ДНК после лигирования. Смесь выдерживали во льду в течение 30 мин, затем прогревали 2 мин при 42С, после чего добавляли её в разогретый до 45-50С верхний агар, содержащий 0,5шМ ИПТГ и 33 мкг/мкл Y-Gal. Затем верхний агар ровным слоем выливали на чашки Петри с нижним агаром, подсушивали и инкубировали в течение ночи при 37 С.
RF-форму фаговой ДНК выделяли щелочным методом (Маниатис и др., 1984). Бактериальные клетки, зараженные фагом (из белых фаговых бляшек), выращивали в течение ночи на качалке при 37С до оптической плотности Deoo=UO. Клетки осаждали на центрифуге Eppendorf Centrifuge 5415С 2 мин при 6000 об/мин, осадок суспендировали в 200 мкл раствора, содержащего 1 ОтМ ЭДТА, 25тМ трис-HCl и 50тМ глюкозу. Далее к полученной суспензии для лизиса клеточных стенок осторожно добавляли 500 мкл раствора, содержащего 0,2М NaOH и 1% SDS и перемешивали, после чего добавляли 385 мкл ЗМ ацетата Na (рН 4.8) для осаждения белков. Смесь выдерживали 15 мин при -20С, затем центрифугировали 5 мин при 13000 об/мин. Супернатант аккуратно собирали в пробирку, добавляли 600 мкл изопропанола и выдерживали 15 мин при комнатной температуре, после чего центрифугировали 2 мин при 10000 об/мин. Супернатант выливали, осадок высушивали и растворяли сначала в 50 — 100 мкл деионизовнной воды, а затем к раствору добавляли эквивалентное количество 5М LiCl и оставляли на 15 мин при -20С. Полученную суспензию цетрифугировали 2 мин при 12000 об/мин, супернатант собирали в пробирку, добавляли 2.5 объёма охлаждённого этанола и выдерживали 30 мин при -20С, после чего центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин. Осадок промывали этанолом, высушивали и растворяли в 50 - 100 мкл деионизовнной воды.
Полученные пробы ДНК анализировали на наличие вставки - фрагмента N-гена IHNV размером 276 пн - с помощью гидролиза рестриктазами EcoRl и HincUll, сайты которых располагаются в полилинкерном районе фага М13тр8. Присутствие клонированного участка в фаговой ДНК подтверждалось наличием фрагмента 328 пн.
Культуру клеток Е. Coli DH5a наращивали на качалке при 37 С до оптической плотности D6oo=0,4-0,6, после чего проводили заражение фагом из расчета 2- -5x109 фаговых частиц на 1 мл культуры и выдерживали на качалке при 37С в течение часа. Затем полученные зараженные клетки добавляли к 100 мл среды YT 2 и растили культуру в течение ночи.
Инфицированную культуру .после выращивания переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали при 5000 об/мин на центрифуге Beckman в течение 20 мин для отделения клеток. После центрифугирования супернатант (80 мл) переливали в другие центрифужные пробирки, добавляли 20 мл раствора R15, перемешивали, выдерживали 20 мин при комнатной температуре для формирования фагового осадка и центрифугировали 20 мин при 10000 об/мин в том же роторе. Затем супернатант выливали, осадок суспендировали в 16 мл TES-буфера и повторяли осаждение фага, добавив 3,7 мл раствора R15. После второго центрифугирования в тех же условиях фаговый осадок суспендировали в 2 мл TES-буфера. Полученную суспензию фага М13 можно использовать для выделения однонитевой фаговой ДНК или для инфицирования культуры Е. coli.
Для выделения однонитевой фаговой ДНК суспензию фага разливали по 0,5 мл в пробирки типа Эппендорф и добавляли равный объём фенола, насыщенного буфером. Смесь хорошо перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 5 мин, после чего центрифугировали на центрифуге Eppendorf Centrifuge 5415С при 7000 об/мин в течение 2 мин для разделения фаз. Верхнюю водную фазу переносили в чистые пробирки, повторяли экстракцию фенолом ещё раз, затем после переноса водной фазы в другие пробирки приливали к ней равный объём смеси хлороформ:изоамиловый спирт (24:1) для удаления примесей фенола. Пробирки интенсивно встряхивали, центрифугировали для разделения фаз при 7000 об/мин в течение 2 мин и отбирали верхнюю водную фазу. ДНК из водной фазы высаживали добавлением 1/10 объёма уксуснокислого натрия рН 8,0 и 2,5 объёмов охлаждённого этилового- спирта. Пробирки выдерживали 1 час при -20С, центрифугировали 5 мин при 13000 об/мин, осадок промывали этанолом, высушивали при комнатной температуре и растворяли в 20 мкл деионизованной воды.
К водному раствору одноцепочечной ДНК фага М13тр8 с соответствующей вставкой (3-6 мкг) добавляли эквивалентный объём 1М раствора 4-аминооксибутиламина (синтезирован в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Поздняковым П.И.), смесь прогревали при 100С на водяной бане в течение 5 мин и помещали в лёд на 5 мин. Процедуру повторяли ещё раз, затем к раствору добавляли 3 объёма охлажденного этанола и выдерживали 30 мин при -20С для осаждения и центрифугировали на центрифуге Eppendorf Centrifuge 5415С при 13000 об/мин в течение 5 мин. Полученный осадок промывали этанолом и высушивали при комнатной температуре.
После высаживания осадок ДНК растворяли в 80 мкл воды, добавляли 10 мкл 1М NaHCCb и 10 мкл 0,1М раствора «активированного» биотина (готовили, растворяя навеску 2,25 мг N-гидроксисукцинимидного эфира биотина в 50 мкл ДМФА). Реакцию биотинилирования вели при комнатной температуре в течение 1,5-2 часов. Затем к раствору ДНК добавляли 10 мкл ЗМ ацетата натрия рН 5,5 и 2,5 объёма этанола для осаждения (при -20С 30 мин), после чего пробу центрифугировали в том же роторе при 13000 об/мин, осадок промывали этиловым спиртом, высушивали при комнатной температуре и растворяли в 10-20 мкл деионизованной воды.
10-50 пкг вирусной РНК наносили на нитроцеллюлозный фильтр, высушивали на воздухе и иммобилизовали, поместив на 1 мин под ультрафиолетовую лампу.
Для проведения предгибридизации фильтры с иммобилизованными образцами РНК помещали в кюветы с гибридизационным раствором и инкубировали в течение 1 часа при 60С. Затем фильтры переносили в гибридизационный раствор, в который добавляли биотинилированный ДНК-зонд до концентрации 0,1 мкг/мл, и вели гибридизацию во влажной камере в течение 16-18 часов при 60G.
Определение специфичности и чувствительности выявления РНК SVCV методом ОТ-пгПЦР
Очевидно, что нуклеотидные замены в сайтах узнавания эндонуклеаз рестрикции изменяют картину гидролиза и позволяют отличать изоляты из бывшего СССР от европейских с помощью ПДРФ-анализа. Кроме того, генетическое разнообразие изолятов из бывшего СССР также позволяет дифференцировать их между собой. На основании полученных данных о нуклеотидной последовательности N1-N2 фрагмента 18 изолятов SVCV был проведен поиск сайтов гидролиза для эндонуклеаз рестрикции, позволяющий проводить генетическое типирование с помощью рестрикционного анализа. Для исследования было выбрано 5 эндонуклеаз рестрикции, в сайтах узнавания которых на фрагменте 405 пн разных изолятов SVCV имелись нуклеотидные замены (рис. 19).
Для выявления различий между европейскими изолятами и изолятами из бывшего СССР были проанализированы нуклеотидные замены, характерные для всех отечественных штаммов и отличающие их от европейской референсной линии. На основании этих" данных эндонуклеазы рестрикции были выбраны так, что при замене одного нуклеотида на другой (в случае отечественных изолятов) сайт узнавания либо появлялся, либо, наоборот, исчезал.
Так, замена G—»А в позиции 1176 для изолятов из бывшего СССР ведёт к появлению сайта узнавания для фермента Clal, что и обеспечивает их отличие от европейских. Штамм М2 является исключением за счет присутствия дополнительной замены С— А в положении 1178.
Замена G— А в позиции 1150 для отечесвенных изолятов, напротив, ведёт к исчезновению сайта узнавания для эндонуклеазы рестрикции Rsal (рис. 20 а), делая их устойчивыми к гидролизу этим ферментом. Исключение составляют отечественный штамм М2 и европейский изолят RVC-1. Их рестрикционные карты отличаются от таковых для представителей своих групп, что определяется особенностями их нуклеотидных последовательностей в этой области.
У некоторых штаммов SVCV на фрагменте N1 - N2 N - гена существует три сайта узнавания эндонуклеазы рестрикии BsoMAl, причем один из них появляется в результате замены Т— С в позиции 1350 для большинства изолятов из бывшего СССР (рис. 20 б). Таким образом, они отличаются от отечественных изолятов Уд и Р4 и от всех европейских изолятов, кроме RVC-1, для которого также показана аналогичная замена. Кроме того, у штаммов KU/0204 и KL/0604 замена С— Т приводит к нарушению сайта ДУОМАІ В положении 1120.
Подобным образом, замена G— А в позиции 1358 приводит к появлению сайта для эндонуклеазы рестрикции ТгиЭ\ у большинства изолятов из бывшего СССР (исключение составляют Уд и Р4), а также у европейских штаммов 435 и RVC-1 (рис. 20 в). Замена Т— G в позиции 1361, напротив, приводит к исчезновению сайта узнавания рестриктазы Psil у большинства российских штаммов (за исключением Уд и Р4) и для европейского изолята RVC-1 (рис. 20 г). Штамм М2 устойчив к гидролизу данным ферментом за счет мутации Т
Для проверки достоверности результатов, полученных с помощью ПЦР-ПДРФ, на основании определенной нами нуклеотидной последовательности участка N-гена величиной 405 пн (приложение 1) был проведен филогенетический анализ 18 изолятов SVCV, принадлежащих к пяти рестрикционным геногруппам. Дендрограмму построили методом объединения ближайших соседей (Saitou and Nei, 1987) и провели перестановочный анализ статистической значимости дерева по 1000 реплик (рис 23).
В созданной дендрограмме выделяются три кластера. Первый кластер образуют изоляты из бывшего СССР, принадлежащие к рестрикционным геногруппам 5 и 3. Они имеют тенденцию фуппироваться в зависимости от географического происхождения с невысоким индексом статистической надежности. Внутри кластера выделяются несколько групп российских и украинских штаммов, причем российские изоляты Уд и Р4, входящие в рестрикционную геногруппу 3, с высокой надежностью по результатам перестановочного анализа образуют обособленную подгруппу. Второй кластер также образован изолятами из бывшего СССР, принадлежащими к другим рестрикционным группам: 2 и 4. С высоким индексом статистической надежности группируются российские изоляты KU/0204 и KL/0604, выделенные в подмосковном регионе (геногруппа 4), а молдавский изолят М2 (геногруппа 2) демонстрирует наиболее значительные отличия от,всех изученных штаммов SVCV. Третий кластер состоит только из европейских изолятов. Штаммы, выделенные по результатам ПДРФ-анализа в геногруппу 1, с высокой надежностью образуют отдельную подгруппу. Происхождение изолята RVC-1 точно не установлено, и по результатам ПДРФ его не удалось отнести ни к одной из выделенных геногрупп. Филогенетический анализ показал, что указанный изолят и изоляты из Европы, очевидно, имеют монофилетическое происхождение.
