Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Молекулярные механизмы возникновения устойчивости mycobacterium tuberculosis к антибиотикам и методы определения резистентности. Обзор литературы 3
1.1 История распространения туберкулеза 3
1.2 Подходы к лечению туберкулеза 6
1.3 Противотуберкулезные антибиотики 8
1.4 Развитие устойчивости М. tuberculosis к антибиотикам 12
1.5 Механизмы устойчивости к отдельным противотуберкулезным препаратам 13
Рифампицин 13
Изониазид 14
Стрептомицин 18
Пиразинамид 19
Этамбутол 20
Фторхинолоны 21
Канамицин, амикацин, виомицин, капреомицин 23
1.6 Методы диагностики лекарственной устойчивости 25
Микробиологические методы 25
Молекулярно-биологические методы 27
Заключение 36
ГЛАВА II. Результаты и обсуждение 37
2.1 Разработка метода аллель-специфичной истощающей ПЦР 37
Принцип метода аллель-специфичной истощающей ПЦР. 37
Критические параметры метода 38
Эффективность аллелъной дискриминации в АСИ ПЦР в зависимости от исследуемой мутации и природы 3 концевого нуклеотида праймера 41
Эффективность АСИ ПЦР для анализа смешанных образцов ДНК, содержащих несколько аллелей. 44
2.2 Адаптация метода АСИ ПЦР для определения устойчивости к антибиотикам и филогенетических исследований однонуклеотидного полиморфизма 45
Детекция устойчивости крифампицину и изониазиду 45
Детекция устойчивости к этамбутолу и фторхинолонам 47
Адаптация АСИ ПЦР для филогенетических исследований однонуклеотидного полиморфизма 51
2.3 Применение метода АСИ ПЦР для генотипирования клинических изолятов М. tuberculosis 54
Определение мутаций, приводящих к лекарственной устойчивости 55
Молекулярная эпидемиология 56
Метод АСИ ПЦР для идентификации клинических изолятов, содержащих несколько штаммов М. tuberculosis 60
ГЛАВА III. Практическая часть 64
Материалы 64
Методы 66
Выводы 75
Благодарности 76
- Развитие устойчивости М. tuberculosis к антибиотикам
- Канамицин, амикацин, виомицин, капреомицин
- Эффективность аллелъной дискриминации в АСИ ПЦР в зависимости от исследуемой мутации и природы 3 концевого нуклеотида праймера
- Адаптация АСИ ПЦР для филогенетических исследований однонуклеотидного полиморфизма
Введение к работе
Туберкулез - одно их наиболее распространенных инфекционных заболеваний человека. Эта болезнь является одним из старейших врагов человечества. Примерно треть населения Земли инфицирована туберкулезом, и каждый год эта болезнь уносит 2 миллиона жизней. Несмотря на существование эффективной терапии, заболеваемость туберкулезом во всем мире продолжает расти, причем особенностью современной эпидемии является распространение лекарственно-устойчивых форм болезни.
Для проведения успешного лечения особое внимание должно уделяться определению спектра и уровней чувствительности микобактериальных культур. Поскольку М. tuberculosis медленно растущая бактерия, стандартные микробиологические тесты для определения устойчивости могут занимать от нескольких недель до двух месяцев. В этой связи особое значение приобретает разработка быстрых и высокоэффективных методов определения лекарственной чувствительности клинических изолятов М. tuberculosis. Молекулярно-генетические методы определения устойчивости обладают важным преимуществом, так как позволяют сократить время необходимое для получения результатов до нескольких дней или даже часов.
Таким образом, разработка эффективного метода детекции однонуклеотидных замен в геноме М. tuberculosis является одной из актуальных проблем современной молекулярной диагностики, филогенетики и эпидемиологии.
Развитие устойчивости М. tuberculosis к антибиотикам
В комплекс Mycobacterium tuberculosis (туберкулёзный комплекс) объединяют следующие виды микобакгерий, вызывающие туберкулез млекопитающих -Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium canettii, Mycobacterium microti, Mycobacterium bovis, Mycobacterium pinnipedii, Mycobacterium caprae. Эти виды характеризуются очень высоким сходством нуклеотидной последовательности геномов (99.9%) и идентичной последовательностью 16S РНК, а также спектром хозяев и патогенностью. Высокая степень сходства нуклеотидной последовательности геномов и небольшое число синонимичных однонуклеотидных замен в структурных генах может объясняться тем, что микобакгерий туберкулезного комплекса в процессе эволюции и видообразования прошли через "бутылочное горлышко" примерно 15000-20000 лет назад (1).
Согласно принятой ранее теории, Mycobacterium bovis, вызывающий туберкулез крупного рогатого скота, мог являться эволюционным предшественником Mycobacterium tuberculosis. Одомашнивание скота, происходившее, как предполагается, 25000 -10000 лет назад могло привести к передаче патогена от животных к человеку и адаптации к новому хозяину, что привело к формированию нового вида -Mycobacterium tuberculosis. Эти предположения основывались на том, что М. tuberculosis является, как правило, человеческим патогеном, в то время как у М. bovis гораздо более широкий круг хозяев. Кроме того, в пользу данной теории свидетельствует высокая степень гомологии геномов этих видов, а также тот факт, что человек восприимчив к М. bovis.
В результате анализа специфических делеций в геномах микобактерий, была предложена новая гипотеза происхождения М. tuberculosis, согласно которой все виды микобактерий туберкулёзного комплекса произошли от общего предка (2). При этом отделение эволюционной ветви ведущей к М. tuberculosis произошло раньше, чем разделение видов М. bovis М. africanum и М. microti. Кроме того, было выдвинуто предположение о том, что общий предок бактерий туберкулёзного комплекса являлся человеческим патогеном, а не только крупного рогатого скота, как предполагалось ранее.
Туберкулез является одним из старейших заболеваний человека, следы которого обнаруживаются на протяжении всей истории человеческого вида. Одна из форм туберкулеза может вызывать поражение костей. Такие костные повреждения были обнаружены при изучении останков людей, умерших более 4000 лет назад. Частота, с которой подобные повреждения обнаруживаются в Древнем Египте, позволяет сделать вывод, что случаи заболевания туберкулезом были совсем нередки среди древних египтян. Останки с повреждениями костей были обнаружены и при изучении неолитических стоянок Италии, Дании и Ближнего Востока. Эти находки также подтверждают, что туберкулез был распространен более 4000 лет назад. Теоретически похожие повреждения костей могут быть результатом травм или других инфекционных заболеваний и только идентификация ДНК микобактерий туберкулезного комплекса может считаться основанием для такого диагноза. В нескольких работах была идентифицирована ДНК микобактерий туберкулезного комплекса в древнеегипетских мумиях (3), а также в мумифицированных останках, обнаруженных в Перу (4). Вероятно, болезнь была значительно более распространена, чем можно предположить на основании числа останков с костными повреждениями. При изучении 37 скелетных образцов из трех разных захоронений Древнего Египта (3000-500 лет до н. э.) было показано наличие ДНК микобактерий туберкулезного комплекса как в некоторых нормальных костных образцах, без патологий, так и в некоторых спорных случаях, когда повреждения нельзя однозначно определить как туберкулезные (5). В целом, полученные в различных работах данные свидетельствуют в пользу того, что человечество сталкивалось с туберкулёзом на протяжении значительной части своей истории.
Первым письменным упоминанием о туберкулезе считаются Ассирийские глиняные таблички, датируемые 7 веком до н.э. в которых описываются больные с кашлем с кровью. Более подробно симптомы туберкулеза описаны Гиппократом (5 век до н. э.). Он использует термин "фтизис" - чахотка, греческое слово, совмещающее два значения - "чахнуть" и кашлять кровью. Чахотка описывается уже как широко распространенное заболевание (6).
Европа становится эпицентром эпидемий туберкулеза в 16-17 веках благодаря росту городов и увеличению плотности населения. Пик эпидемии в Европе пришелся на первую половину 19 века, когда, согласно некоторым оценкам, примерно в каждом четвертом случае смерти причиной являлся туберкулез. Во второй половине 19 века смертность от туберкулеза снижается, в основном благодаря улучшению санитарных и жилищных условий (6).
Считалось, что в Новый Свет болезнь попала вместе с европейскими иммигрантами. Однако В. Сало с соавторами обнаружили ДНК микобактерий туберкулезного комплекса в найденных в Перу мумифицированных останках, датируемых X веком н. э., что может говорить о существовании туберкулеза в Южной Америке еще до заселения европейцами (4). В Америке эпидемия никогда не достигала таких масштабов, как в Европе, но в некоторых больших городах, таких как Бостон и Нью-Йорк смертность от туберкулеза достигала 600-700 человек на 100000 населения в 1800 году и 400-500:100000 в 1860-70г.
В 20 веке заболеваемость и смертность от туберкулеза в развитых странах постоянно падает, что объясняется улучшением социально-экономических условий, развитием системы лечения болезни. В ряде стран проводилась массовая вакцинация БЦЖ, кроме того, открытие в 40-х годах противотуберкулезных антибиотиков и разработка эффективной терапии позволяли надеяться на то, что «белая чума» будет побеждена окончательно. Однако к 90-м годам 20 столетия число новых случаев заболевания туберкулёзом начинает расти, причем не только в слаборазвитых странах. Вспышки туберкулеза были зафиксированы в Северной Америке, Европе, Японии. В 1990 году, согласно данным ВОЗ, в мире зафиксировано 3.8 миллионов случаев туберкулеза (7). В развитых странах показатели заболеваемости и смертности перестали падать, в Восточной Европе и странах Советского Союза возросли. Особенное тяжела ситуация в странах Африки, где число заболевших с 1990 года возросло в четыре раза. Считается, что причинами столь масштабной эпидемии в Африке является постоянный рост заболеваемости ВИЧ. ВОЗ определила 22 страны, число больных туберкулезом в которых составляет 80% всех случаев болезни, зафиксированных в мире. В этот список входит также и Россия. С 1991 по 2000 годы чисто заболевших туберкулезом удвоилось, а показатели смертности от туберкулеза стали самыми высокими в Европе (20.4 на 100000 населения) (8).
Канамицин, амикацин, виомицин, капреомицин
Первичная диагностика туберкулеза основывается на клинических признаках заболевания, тогда как для постановки окончательного диагноза требуется идентификация патогенного микроорганизма. Стандартная микробиологическая процедура определения возбудителя заболевания включает в себя стадию культивирования на специализированных питательных средах, анализ на наличие кислотоустойчивых бацилл, получение культуры, идентификацию микроорганизма и исследования лекарственной чувствительности клинического изолята.
Два параметра наиболее важны в микробиологических методах детекции устойчивости. Первый - критическая концентрация лекарства, которая должна использоваться для того, чтобы отличить устойчивые бактерии от чувствительных. Второй - какой должна быть доля бактерий устойчивых к лекарству, чтобы этот штамм можно было называть резистентным. Было определено, что критической является такая концентрация антибиотика, которая ингабирует рост бактерий дикого типа и не влияет на рост бацилл, устойчивых к лекарству. Критические концентрации антибиотика отличаются в зависимости от используемого метода детекции устойчивости.
Так как устойчивость развивается в результате отбора предсуществующих в популяции мутантов, на ранних стадиях развития резистентности присутствуют как устойчивые, так и чувствительные бактерии. Устойчивость определяется как рост in vitro на среде с критической концентрацией антибиотика 1% колоний, выросших на среде без антибиотика.
Определение чувствительности к антибиотикам является одной из наиболее трудно стандартизуемых методик в микробиологической лаборатории. Причин для этого можно назвать несколько - различия в препаратах лекарств, используемых для анализа методах, средах. Было показано, что анализ чувствительности М. tuberculosis к изониазиду и рифампицину характеризуется более высокой воспроизводимостью результатов, чем для стрептомицина и этамбутола.
Еще одной проблемой, характерной именно для М. tuberculosis, является сложность получения стандартизованного инокулята. Так как при анализе сравнивают количество колоний, выросших на средах, содержащей и не содержащей антибиотик, суспензия бактерий для посева в эти две среды должна быть стандартизованной. Характерной особенностью роста М. tuberculosis является образование жгутов или нитей, что обусловливает сложности стандартизации суспензии бактерий для посева. Методы определения лекарственной устойчивости подразделяются на прямые и непрямые. В прямых методах анализируются непосредственно деконтаминированные образцы мокроты, в непрямых методах для определения устойчивости анализируют предварительно полученную первичную культуру. В большинстве лабораторий используют непрямые методы. Это а) метода пропорций, б) метод абсолютных концентраций, в) метод коэффициента резистентности, г) радиометрический метод ВАСТЕС 460. Метод пропорций заключается в следующем: на среду, содержащую антибиотик, и на среду без антибиотика высевают равные количества бактериальной культуры. Дальше определяется число бактерий, устойчивых к критической концентрации лекарства, по сравнению с количеством колоний, выросших на среде без антибиотика. Если на среде с антибиотиком вырастает более 1% от числа колоний, выросших на среде без антибиотика, штамм считается устойчивым. Этот метод рекомендован как стандартный Национальным комитетом по клиническим и лабораторным стандартам (NCCLS), Международным союзом по борьбе с туберкулезом и болезнями легких (IUATLD), ВОЗ (Всемирной организацией здравоохранения). Следует отметить, что в США как правило используют среду Миддлбрука 7Н10, в то время как IUATLD и ВОЗ рекомендовано использование среды Левенштейна-Йенсена. Радиометрический метод (ВАСТЕС) основан на том, что туберкулезные бациллы метаболизируют 14С-меченую пальмитиновую кислоту, содержащуюся в среде Миддлбрука 7Н10, в результате чего образуется 14СОг, который детектируется системой. Количество и скорость высвобождения иС0г пропорциональны количеству бактерий и скорости роста. Этот метод был адаптирован для детекции устойчивости ко всем препаратам первого ряда. Неоспоримым преимуществом этого метода является скорость получения результатов (до 1 недели), однако к сожалению далеко не все лаборатории используют этот метод из-за его сравнительной дороговизны. В России в качестве унифицированного рекомендуется метод абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена. В этом методе объем засеваемой суспензии клеток стандартизован и соответствует 107 микробных тел. Анализируется рост бактерий при нескольких концентрациях антибиотика. Появление более 20 КОЕ на среде с определенной критической концентрацией обозначает устойчивость штамма к этой концентрации (120).
М. tuberculosis является медленно растущей бактерией, и постановка диагноза, а также диагностика устойчивости может занимать от нескольких недель до двух месяцев. Поэтому особенное значение придается разработке более быстрых технологий для детекции устойчивости. Из современных методов, активно используемых в клинических лабораториях, наиболее быстрым является радиометрический метод (ВАСТЕС), однако помимо отмеченной ранее дороговизны, его недостатком является необходимость использования радиоактивных веществ. В настоящее время активно развиваются новые методики, позволяющие получать результаты также быстро и отказаться от работы с радиоактивными веществами. Так например, в системе MGIT (Mycobacteria growth indicator tube) (121, 122) используется среда 7Н9, содержащая флуоресцентный кислородный сенсор. Высокие начальные концентрации кислорода гасят флуоресценцию, интенсивность которой повышается по мере роста бактерий. Если флуоресценция в пробирке, содержащей антибиотик не наблюдается в течении 2 суток, штамм считается чувствительным. Если рост наблюдается и в пробирке с лекарством и в контрольной пробирке (без антибиотика) штамм считается устойчивым. ESP Culture system II -полностью автоматизированная система, основанная на детекции изменений давления (в результате поглощения или выделения газов при росте бактерий) (123). Другая полностью автоматизированная система МВ/ВАСТ, в которой рост бактерий детектируется с помощью колориметрического определения выделяемого СОг (124,125).
Медленный рост М. tuberculosis приводит к тому, что определение чувствительности может длиться несколько недель. Наряду с разработкой новых быстрых микробиологических тестов, в последнее десятилетие прилагаются огромные усилия для развития молекулярно-биологических методов идентификации возбудителя туберкулеза и детекции лекарственно-устойчивых штаммов.
Эффективность аллелъной дискриминации в АСИ ПЦР в зависимости от исследуемой мутации и природы 3 концевого нуклеотида праймера
Подавление накопления продукта элонгации праймеров с неспаренным 3 концевым нуклеотидом на фоне амплификации другого фрагмента, где праймеры полностью комплементарны матрице, по всей видимости обусловлено несколькими факторами. Одним из них является концентрация дНТФ. При невысокой концентрации дНТФ подавление нежелательной элонгации может происходить в результате того, что эффективная амплификация дополнительного продукта приводит к быстрому потреблению дНТФ. Это предположение подтверждается тем, что дальнейшее понижение концентрации дНТФ приводит к повышению специфичности метода. На поздних циклах ПЦР, вероятно начинает действовать другой механизм подавления нежелательной амплификации. Известно, что на поздних циклах ПЦР происходит ингибированию ДНК полимеразы за счет неспецифического связывания накапливающегося ПЦР продукта (146). Кроме того, в результате увеличения концентрации ПЦР-продуктов, может возникать прямая конкуренция между матрицами за полимеразу.
В классической АС ПЦР концентрация ДНК-матрицы является одним из существенных факторов, определяющих специфичность. Чем выше концентрация ДНК-матрицы, тем больше вероятность накопления продукта в результате достройки праймеров, содержащих 3 концевой неспаренный нуклеотид. Для исследования чувствительности и специфичности метода АСИ ПЦР, амплификацию проводили используя серию последовательных разведений геномной ДНК штамма H37Rv в качестве матрицы (Рис. 8). Было показано, что АСИ ПЦР эффективна и сохраняет специфичность в широком диапазоне концентраций ДНК (от 10 пкг до 100 нг).
Высокая специфичность АСИ ПЦР вне зависимости от количества исходной ДНК-матрицы является важным преимуществом разработанного нами метода. При низких концентрациях дНТФ потребление большей части дНТФ приводит к тому что кривая накопления ПЦР-продуктов выходит на плато, где количество и соотношение ампликонов не меняется. Таким образом, результаты АСИ ПЦР могут анализироваться на стадии плато. Это свойство АСИ ПЦР является особенно важным для использования метода в клинической лаборатории, где количество ДНК для анализа может существенно отличаться в разных образцах. Эффективность аллельной дискриминации в АСИ ПЦР в зависимости от исследуемой мутации и природы 3 концевого нуклеотида праймера.
Известно, что эффективность достройки праймеров Taq-полимеразой различна для разных типов мисматчей праймер-матрица. В ряде работ была исследована кинетика элонгации совершенных дуплексов и праймеров, содержащих разные нуклеотиды на 3 конце (147, 148). Было показано, что Taq полимераза связывает такие дуплексы с одинаковой эффективностью, однако элонгация происходит значительно медленнее в случае несовершенного дуплекса. В зависимости от природы 3 концевого неспаренного нуклеотида, эффективность элонгации составляет от 1% до 0.0001% от эффективности элонгации совершенного дуплекса (147, 149). Для изучения влияния этого фактора был использован набор из четырех праймеров, отличающихся 3 концевым нуклеотидом. В качестве матрицы для ПЦР использовались 4 геномных ДНК М. tuberculosis, содержащие все четыре нуклеотида в 1 положении 526 кодона гена гроВ (САС, AAC, ТАС, GAC). Этот эксперимент представляет собой уникальную возможность исследовать влияние природы мисматча на аллельную дискриминацию используя в качестве матрицы геномную ДНК М. tuberculosis, а не искусственно созданные или модельные ДНК. Каждая из четырех ДНК, содержащая мутацию в 526 кодоне, была использована в качестве матрицы для АСИ ПЦР и классической АС ПЦР с 4 различными парами праймеров. За скоростью накопления продукта следили с помощью ПЦР в реальном времени, для детекции аллель-специфичного ампликона использовали флуоресцентный зонд Taqman (Рис. 9) Высокая дискриминирующая способность АСИ ПЦР бьша показана для всех вариантов, за исключением двух пар праймер-матрица, содержащих на 3 конце дуплекса С-А и T-G.
Как видно из Рис. 9 для матрицы, содержащей аденозин в анализируемой позиции, в классической АС ПЦР накопление нецелевых продуктов на поздних циклах ПЦР происходит для всех пар праймер-матрица (С-А, G-A, А-А). При использовании метода АСИ ПЦР, только праймер, содержащий неспаренный цитидин на 3 конце (пара С-А) эффективно достраивается полимеразой, в то время как продукты элонгации дуплексов, содержащих G-A и А-А на 3 конце отсутствуют даже на поздних циклах ПЦР. В целом, амплификация дополнительного продукта в АСИ ПЦР приводит к подавлению нежелательной элонгации для 10 из 12 возможных некомплементарных сочетаний нуклеотидов на 3 конце дуплекса праймер-матрица. Полученные разными авторами данные о том какие именно пары нуклеотидов на 3 конце дуплекса эффективно достраиваются полимеразой, расходятся, что по всей видимости связано с серьезными отличиями в условиях экспериментов, последовательностях и длинах используемых праймеров. Полученные нами результаты согласуются с ранее опубликованными данными Newton с соавторами для АС ПЦР, где также отмечена весьма эффективная достройка дуплексов, содержащих на З конце пары пурин-пиримидин (150).
Для детекции трудноразличимых методом АС ПЦР замен могут быть использованы праймеры, содержащие кроме 3 концевого неспаренного нуклеотида дополнительные мисматчи в положении -1 (предконцевой) или в положении -2. Такие мисматчи приводят к дополнительной дестабилизации дуплексов, что способствует повышению аллельной дискриминации. Для изучения влияния дополнительных мисматчей на эффективность АСИ ПЦР нами были выбраны два набора праймеров, содержащих дополнительный мисматч в положении -1 и -2. В качестве матрицы для ПЦР использовали четыре геномных ДНК М. tuberculosis, содержащих разные мутации в первом положении 526 кодона гена гроВ (САС, ААС, ТАС, GAC). Бьшо показано, что введение мисматча в положении -1 приводит к существенному снижению выхода аллель-специфичного продукта, количество которого практически не детектируется при окрашивании бромистым этидием на агарозном гель-электрофорезе. Сходные данные для АС ПЦР были получены другими авторами (147,149). Оптимальный баланс между выходом ПЦР-продукта и аллельной дискриминацией в АСИ ПЦР достигался при использовании праймеров, содержащих дополнительный мисматч в положении -2. (Рис.10)
В классической АС ПЦР при использовании праймеров, содержащих неспаренный нуклеотид в положении -2, происходит накопление нецелевых продуктов для некоторых комбинаций 3 концевых пар нуклеотидов дуплекса праймера-матрица (Рис. 10). АСИ ПЦР в тех же условиях является высокоспецифичной для любых пар праймер-матрица и продукты нежелательной элонгации отсутствуют даже на поздних циклах ПЦР.
Адаптация АСИ ПЦР для филогенетических исследований однонуклеотидного полиморфизма
Метод 1S6110 ПДРФ основан на различии в числе копий и сайтов интеграции мобильного элемента IS6110 (анализ полиморфизма длин рестриктных фрагментов геномной ДНК М. tuberculosis с использованием последовательности IS6110 в качестве гибридизационного зонда.). Сполиготипирование - определение с помощью гибридизации наличия уникальных спейсеров в определенном участке генома М. tuberculosis, MIRU-типирование -определение числа тандемных повторов. Хотя эти методы хорошо подходят для эпидемиологических исследований, данные, полученные стандартными методами генотипирования, сложно использовать для глобального анализа популяции и эволюционных исследований. Так для метода сполиготипирования показана конвергенция - эволюционно далекие изоляты имеют идентичный сполигопаттерн (161). Кроме того, объединение и анализ результатов, полученных разными методами в разных лабораториях, представляет собой весьма сложную задачу. Детекция однонуклеотидных замен является наиболее подходящим методом для филогенетических исследований. Механизм, приводящий к заменам очевиден, анализ однонуклеотидного полиморфизма менее подвержен искажению из-за селективного действия отбора, чем детекция протяженных делеций, часто затрагивающих гены. Результаты детекции однонуклеотидных замен легко сравнимы между лабораториями и полученная информация может быть представлена в виде интернет-доступных баз данных (162).
Стандартно используемый для филогенетического анализа подход -мультилокусное определение нуклеотидной последовательности - не информативен для М. tuberculosis, так как геном этой бактерии весьма консервативен (1, 163-165). Таким образом, для таких исследований более подходящим является метод детекции точечных мутаций. К настоящему моменту опубликовано только несколько работ, посвященных выявлению эволюционно значимых однонуклеотидных мутаций, однако активное изучение первичной структуры геномов разных штаммов М. tuberculosis безусловно позволит выявить новые филогенетически важные замены. Основываясь на полиморфизме в в 463 кодоне гена katG и 95 кодоне гена gyrA, S. Srevatsan с соавт. были выделены 3 "основные генетические" группы микобактерий туберкулезного комплекса (ОГГ) (1). Метод АСИ ПЦР был адаптирован для идентификации таких замен. ОГГ I характеризуется комбинацией аллелей katG 463Лей и угА95Тре, ОГГ II -katG 463Арг и gyrA95Tpe, ОГГ III - katG 463Арг и gyrA 95Сер. Схема метода и результаты АСИ ПЦР представлены на Рис. 14.Анализ полной нуклеотидной последовательности геномов 3 штаммов М. tuberculosis и M.bovis (164-166) позволил Filliol с соавт. выделить 6 филогенетически важных однонуклеотидных замен, согласно которым изоляты делятся на группы согласно кластеризации по точечным мутациям (SCG, single nucleotide polymorphism cluster group) (163). Далее такие группы обозначены как ФГ (филогенетические группы). Замены, предложенные авторами для определения принадлежности изолятов к одной из 7 филогенетических групп (ФГ) представлены на Рис.15. Нами был предложен метод определения ФГ с помощью 2 ПЦР, в каждой из которых содержится 6 пар праимеров. Анализируемые однонуклеотидные полиморфные замены, и результаты определения принадлежности изолятов к одной из 7 филогенетических групп представлены на Рис.15.
С 80-90-х годов 20 столетия заболеваемость туберкулезом во всем мире нарастает, не являются исключениями Россия и страны бывшего Советского Союза. С 1991 по 2000 годы число заболевших туберкулезом в России удвоилось, а показатели смертности от туберкулеза стали самыми высокими в Европе (20.4 на 100000 населения) (8). Еще более угрожающей является ситуация в тюрьмах и исправительных учреждениях, где в 2000 году уровень заболеваемости составил 3174 на 100000 заключенных (8). Условия содержания в тюрьмах, и в особенности их переполненность, плохое питание, отсутствие должной вентиляции способствуют распространению туберкулеза, а тюрьмы представляют собой источник болезни для всего населения. Еще одной серьезной проблемой является высокий процент случаев лекарственно-устойчивого туберкулеза среди заключенных.
Нами были исследованы изоляты, выделенные от больных туберкулезом, пребывающих в тюремном госпитале поселка Озерки Тульской обл. (2000-2001 гг.). Были получены генотипические характеристики 87 изолятов методом IS6110 ПДРФ-типирования, определена принадлежность к ОГГ и ФГ, идентифицированы мутации, приводящие к устойчивости к антибиотикам. Согласно данным АСИ ПЦР, 4 изолята представляли собой смеси двух штаммов и были исключены из кластерного анализа. Определение мутаций, приводящих к лекарственной устойчивости
Изоляты были определены как чувствительные/устойчивые к рифампицину и изониазиду методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена. Кроме того, было проведено определение первичной структуры участков генов гроВ и katG.
Согласно данным АСИ ПЦР и результатам определения первичной структуры участка гена katG, все 67 изониазид-устоичивых изолята содержали мутацию Сер315Тре в katG. Ни в одном из чувствительных к изониазиду изолятов мутации Сер315Тре в katG обнаружено не бьшо.
Среди 66 рифампицин-устойчивых изолятов методом АСИ ПЦР были обнаружены мутации Асп 516 Вал - в 27 (41%) изолятах, Сер 531 Лей - 28 (42%), Гис 526 Асп и Гис 526 Тир - в 4 (6%) и 1 (1.5%) изолятах. В рифампицин-чувствительных изолятах мутаций обнаружено не бьшо. Один изолят был определен как чувствительный методом АСИ ПЦР, однако являлся устойчивым согласно данными секвенирования участка гроВ, так как содержал замену Лей51Шро, которая не входила в список анализируемых АСИ ПЦР мутаций. Таким образом, совпадение данных метода АСИ ПЦР с результатами секвенирования составило 99% и 100% для рифампицина и изониазида соответственно. Метод АСИ ПЦР позволил корректно определить устойчивость к изониазиду в 100% случаев и к рифампицину - в 93% случаев. В большинстве случаев устойчивость М. tuberculosis к рифампицину обусловлена мутациями в гене гроВ. Согласно данным разных авторов от 2 до 14% устойчивых изолятов не содержат мутаций в этом гене и механизм резистентности для них неизвестен. Совпадение результатов АСИ ПЦР с данными секвенирования свидетельствует о том, что из 100% случаев, которые принципиально могут быть определены молекулярными методами, в 99% были детектированы мутации методом АСИ ПЦР с использованным набором праймеров.
