Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 14
1.1. Общая характеристика микобактерий 14
1.2. Молекулярно-биологические методы, используемые в эпидемиологических исследованиях возбудителей туберкулеза 17
1.3. Анализ филогенетических взаимоотношений среди представителей комплекса микобактерий туберкулеза 24
1.4. Характеристика эпидемиологически значимой группы микобактерий W/Beijing 34
2. Материалы и методы 38
2.1. Штаммы микобактерий, используемые в исследовании 38
2.2. Выделение ДНК из культур микобактерий 38
2.3. Праймеры, используемые для ПЦР амплификации и секвенирования 40
2.4. Приготовление гибридизационных зондов 41
2.5. Реактивы для гибридизации по Саузерну 44
2.6. Методика RFLP гибридизации 45
2.7. Секвенирование фрагментов ДНК 48
2.8. Методика гибридизации с молекулярными бикэнами 49
3. Разработка методики быстрой идентификации w-beijing штаммов 50
3.1. Анализ результатов гибридизации клинических штаммов с W- Beijing зондом 51
3.1.1. dnaA-dnaN межгенный район хромосомы микобактерий 51
3.1.2. DR-область хромосомы М:tuberculosis 56
3.1.3. Хромосомный локус NTF, (регион В) 57
3.2. Интерпретация результатов гибридизации с многокомпонентным W-Beijing зондом 58
4. Анализ хромосомных делеции tbd1, rd6, pks15/1 клинических штаммов м. tuberculosis. 67
4.1. Гибридизация хромосомных ДНК с TbDl зондом 68
4.2. Гибридизация с RD6 зондом 73
4.3. Гибридизация с зондамиpks 15/1 74
5. Характеристика делеции, специфичных для представителей w-beijing группы 79
Заключение 86
- Молекулярно-биологические методы, используемые в эпидемиологических исследованиях возбудителей туберкулеза
- Выделение ДНК из культур микобактерий
- Интерпретация результатов гибридизации с многокомпонентным W-Beijing зондом
- Гибридизация с зондамиpks 15/1
Введение к работе
Туберкулез по-прежнему остается одной из актуальных проблем практического здравоохранения во всем мире. По данным ВОЗ, глобальная среднегодовая смертность, обусловленная туберкулезом, составляет около 2 млн. случаев. В Российской Федерации показатели заболеваемости и смертности от туберкулеза в несколько раз превышают значения по странам Западной Европы (база данных Европейского регионального комитета ВОЗ, http://data.euro.who.int/hfadb/ ). Россия входит в число стран с высокими уровнями заболеваемости (85,4 на 100 тысяч населения -2004 г.) и смертности (21,4 на 100 тысяч населения - 2004 г.) по туберкулезу. Сложные социально-экономические условия жизни населения, военные конфликты, миграция, увеличение числа штаммов возбудителя заболевания, устойчивых к действию противотуберкулезных препаратов, являются одними из основных причин напряженной эпидемической ситуации в России (Перельман, 2001; Шевченко, 2000). Заболеваемость туберкулезом среди населения стала нарастать быстрыми темпами за период 1990-2001 гг. (с 34,2 до 90,7 на 100 тысяч населения соответственно), отмечалось утяжеление клинических форм туберкулеза с реверсией распространенных, генерализованных, остро прогрессирующих случаев, сопровождавшихся обильным бактериовыделением, деструктивным характером поражений, снижением эффективности лечебных мероприятий (Шилова, 1999). Следует отметить, что после 1999 года темпы роста основных эпидемиологических показателей снизились, по сравнению с 1991-1995 гг. Однако тенденции к продолжению накопления резервуара инфекции остаются и по сей день (Шилова, 2001). Особо настораживает увеличение распространенности случаев заболевания с первичной лекарственной устойчивостью (Балабанова с соавт., 2005).
Иркутск является одним из неблагополучных городов по туберкулезу, основные показатели такие, как заболеваемость и смертность превышают среднестатистические показатели по России и составляют 84,9 на 100 000 и 22,6 на 100 000 населения соответственно (данные на 2004 г.) (Губанова, 2005). Серьезная эпидемиологическая ситуация в регионе объясняется низким (по сравнению с Европейской частью России) благосостоянием населения, высокой концентрацией мест лишения свободы, ростом числа лиц без определенного места жительства и беспризорных детей, активизацией неконтролируемых миграционных процессов (особенно из эпидемически неблагополучных регионов с высокой распространенностью туберкулеза с МЛУ).
В условиях сложившейся эпидемической ситуации развитие и использование новых методов в клинической диагностике и эпидемиологических исследованиях приобретает особое значение. В качестве наиболее перспективных, следует выделить молекулярно-биологические методы, особенно комплексное сочетание нескольких методов, что позволит более точно выявлять звенья эпидемиологических цепочек распространения инфекции и своевременно локализовать очаги туберкулеза.
Актуальность проблемы
Особенности природы заболевания, в частности длительность инкубационного периода, лекарственная устойчивость и отсутствие надежных методов идентификации штаммов возбудителя затрудняют диагностику и лечение туберкулеза, а также эпидемиологические исследования в очагах. Последние достижения молекулярной биологии в сочетании с успехами в области молекулярной генетики микобактерий позволили разработать способы надежной дифференцировки штаммов Mycobacterium tuberculosis (М. tuberculosis) на уровне хромосомной ДНК, которые существенно повышают эффективность микробиологической диагностики и эпидемиоло
гических исследований при туберкулезе. Однако подавляющее большинство методов, используемых для молекулярного типирования туберкулеза, отличается многоступенчатостью проведения, недостаточной дискрими-нативной способностью, высокой стоимостью. Проведение исследований, направленных на поиск молекулярных маркеров специфичных для отдельных эпидемиологически значимых групп микобактерий, особенно имеющих лекарственную устойчивость, и разработка простых в исполнении, точных и недорогих методов идентификации групп штаммов М. tuberculosis, а также применение этих методов в комплексе являются необходимым условием успешной организации противоэпидемических мероприятий, направленных на снижение заболеваемости и смертности от туберкулеза.
Цели и задачи исследования
Целью исследования являлась разработка молекулярных маркеров и оптимизация методик их использования для идентификации отдельных групп особо вирулентных штаммов М. tuberculosis, в том числе представителей W-Beijing филогенетической линии, среди клинических изолятов микобактерий.
Основные задачи: • Используя данные ранее проводимых исследований, разработать од-ноэтапный метод для идентификации W-Beijing штаммов среди клинических изолятов М. tuberculosis:
- учитывая структуру геномных локусов, подобрать соответствующие специфичные праймеры для амплификации фрагментов ДНК;
- создать многокомпонентный гибридизационный зонд для последующего RFLP-анализа;
- применить полученный гибридизационный зонд для
идентификации представителей различных кластеров в коллекции PHRI ТВС клинических штаммов М. tuberculosis; - оценить специфичность и практические преимущества предлагаемого метода.
• Разработать молекулярные маркеры, специфичные для интактного и измененного, в связи с микроделецией, фрагмента гена pks 15/1, отвечающего за продукцию фенолгликолипидов - факторов вирулентности М. tuberculosis, с применением метода RT-PCR с зондами -«molecular beacons».
• Разработать гибридизационные зонды, специфичные для фрагментов TbDl,RD6, рЫ5/1.
• Провести анализ делеций TbDl, RD6, pks 15/1 с использованием ПЦР амплификации, RFLP гибридизации и метода RT-PCR с зондами - «molecular beacons» клинических изолятов М. tuberculosis.
• Провести исследование, базирующееся на секвенировании фланкирующих последовательностей различных по локализации и размеру делеций, представленных в геноме для дифференциации различных кластеров W-Beijing штаммов, а также представителей других филогенетических линий М. tuberculosis.
Научная новизна и практическая значимость работы
На сегодняшний день в литературных источниках описано множество молекулярно-биологических методов для генотипирования штаммов М. tuberculosis. Наиболее широко используемыми методами, относящимися к «золотому стандарту» являются IS6770-RFLP (Restriction fragment length polymorphism - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК) генотипирование и сполиготипирование (spoligotyping), определение точечных мутаций ассоциированных с лекарственной устойчивостью, а также MIRU-VNTR (полиморфизм тандемов повторяющихся фрагментов
ДНК) анализ. Учитывая особенности некоторых эпидемиологически значимых групп возбудителей, таких как W-Beijing штаммы: широкую распространенность, высокий уровень смертности при заражении данными штаммами и часто встречающуюся лекарственную устойчивость, идентификация изолятов W-Beijing филогенетической линии имеет большое практическое значение. Только единичные лаборатории имеют возможность применения нескольких методов генотипирования в виду высокой стоимости проведения исследований. Проведение типирования с использованием нескольких методов занимает в лучшем случае 5-10 дней. Больной с активной формой туберкулеза способен заразить в течение месяца от 15 до 100 человек.
Исходя из этого, возникает необходимость в разработке быстрого недорогого и эффективного метода, способного определить микобактерии, принадлежащие к W-Beijing группе. В настоящем исследовании впервые разработан метод генотипирования штаммов W-Beijing, с применением техники RFLP гибридизации, основанный на комплексном использовании нескольких специфичных апробированных маркеров. Метод высокочувствительный, быстрый и удобный для выделения различных групп представителей W-Beijing, в том числе обладающих лекарственной устойчивостью среди любых штаммов микобактерии. Проведен анализ хромосомных де-леций TbDl, RD6, pksl5/l при сопоставлении результатов с данными IS6J10-RFLP типирования у анализируемых клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных в различных регионах мира. Впервые описан IS6110-RFLP кластерный состав предковой («ancestral» - не имеющих TbDl делецию) группы штаммов. Показано распределение исследуемых штаммов по выявленным и ранее известным признакам. Помимо этого, метод детекции штаммов с делетированным pksl5/l фрагментом с использованием методики оценки кинетики ПЦР (RT-PCR, realime PCR) со специфическими молекулярными зондами - «molecular beacons», позволяет
выделить особо вирулентные микобактерии туберкулеза. В работе показаны перспективы совместного комплексного применения простых и апробированных методик для более точного выявления путей распространения инфекции. Описаны делеции, характерные для представителей W-Beijing филогенетической линии. Использование полученных данных в дальнейших исследованиях позволит разработать специфичные молекулярные маркеры. Применение которых, в совокупности с другими методами типи-рования, даст возможность идентифицировать различные подгруппы W-Beijing филогенетической линии, тем самым ускорить выявление эпидемиологических очагов заболевания и с большей достоверностью выявлять цепочки распространения инфекции.
Основные защищаемые положения:
1. Метод гибридизации с многокомпонентным зондом W-Beijing прост, удобен в применении и способен эффективно идентифицировать W-Beijing штаммы среди любых клинических изолятов М. tuberculosis.
2. Распределение делеции TbDl, Ш)6,рЫ5/1 у клинических штаммов М. tuberculosis различных генетических групп и кластеров позволяет выяснить связь возникновения данных делеции с другими маркерными генетическими событиями.
3. Идентификация М. tuberculosis с интактными генами pksl5/l позволяет выделить группу потенциально высоко вирулентных штаммов среди клинических изолятов.
4. Штаммы линии W-Beijing характеризуются наличием специфических делеции, которые могут использоваться в качестве молекулярных маркеров для выявления отдельных групп микобактерии W-Beijing.
Личный вклад соискателя
В основу диссертации положены исследования, выполненные автором в лаборатории молекулярной эпидемиологии, в Научно-исследовательском
институте здравоохранения (PHRI ТВС, г. Ньюарк, Нью-Джерси, США) в период 2002-2004 г.г. Разработка молекулярных маркеров велась автором самостоятельно под руководством сотрудников лаборатории: Натальи Ку-репиной и Елены Шашкиной, Бэрри Крэйсвирта и научным руководством Беликова Сергея Ивановича (Лимнологический институт СО РАН, г. Иркутск).
Апробация результатов диссертации и публикации
Результаты работы были представлены на конференции в Кейстоуне, 2-7 апреля, 2005 г. (Keystone, США ) и Всероссийской научно-практической конференции в г. Санкт-Петербурге, 21-23 апреля, 2005 г. Основные результаты диссертации опубликованы в 5 печатных работах.
Структура и объем диссертации
Работа состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы, содержащего 124 источника и 5 приложений. Диссертация изложена на 137 страницах, содержит 6 таблиц, 4 схемы, иллюстрирована 10 рисунками.
Молекулярно-биологические методы, используемые в эпидемиологических исследованиях возбудителей туберкулеза
В конце 80х начале 90х годов XX века впервые у микобактерии туберкулеза описано наличие вставочных элементов и их потенциальная возможность быть использованными для генотипирования (Eisenach et al, 1988;.Zainuddin et al, 1989; Zainuddin et al, 1990). Наиболее известным и используемым на сегодняшний день является IS (insertion sequence) 6110, относящийся к IS3 семейству вставочных элементов. 1S6110 представляет собой последовательность длиной 1355 п. н. с терминирующими 28 п. н. инвертированными повторами. Вставочный элемент имеет несколько открытых рамок считывания (ORF), одна из них кодирует собственно транспозазу, в процессе транспозиции 3-4 п. н. сайта вставки последовательности ДНК дуплицируются и становятся прямыми повторами, фланкирующими вставку (McAdam et al., 1990; Thierry, 1990; Zainuddin et al., 1989). IS6J10 является ключевыми маркером для проведения эпидемиологических исследований распространения М. tuberculosis (Small, 1994; van Embden et al., 1993). Специфичный для представителей MTK, IS6U0 варьирует по числу копий от 0 до 26 и локализации в геноме (McAdam et al., 1990; Thierry, 1990; Zainuddin et al., 1989). По данным исследователей IS6110 обладает адекватной динамикой, позволяющей определять эпидемиологически родственные штаммы и прослеживать цепочки недавней трансмиссии, при этом по данным Лайлбэк (Lillebaek), по результатам 18о7./0-основанных методов типирования, была подтверждена эндогенная реактивация случая заболевания туберкулезом после 30-ти летнего периода ремиссии, хотя средний период стабильности IS6110 элементов колеблется от 3-4 до 8 лет, и зависит от множества факторов влияющих на интенсивность репликативных процессов (таких как стадия развития заболевания, продолжительность лечения на момент взятия анализа и др.), индивидуальные особенности взаимодействия организма человека и патогена и др. (Cave et al., 1994; de Boer et al., 1999; Lillebaek et al., 2002; Stead, 1967; Warren R. M. et al., 2002; Yeh, 1998). К методикам, широко используемым для типирования представителей МТК, относится анализ, основанный на исследовании длин реестрик-ционных фрагментов хромосомной ДНК (restriction fragment length polymorphism - RFLP). Амплифицированный фрагмент IS6110 вставки используется в качестве гибридизационного зонда для Саузерн-блот гибри- дизации.
Полученные профили гибридизации штаммов представляют собой наборы фрагментов рестрикции ДНК, содержащих IS6110 элемент, которые различаются по количеству и молекулярной массе. При этом большинство эпидемиологически несвязанных штаммов имеют индивидуальные профили гибридизации. Напротив, профили штаммов из очагов туберкулеза могут быть идентичными или сходными. Ограничения в применении данного метода связаны с высокой стоимостью оборудования для проведения типирования, необходимостью выделения чистых культур микобактерий для получения больших количеств ДНК, а также затруднения в идентификации штаммов с малым (менее 6) количеством копий IS элемента. Помимо этого возникают трудности при воспроизведении и интерпретации результатов разными лабораториями. Картирование сайтов инсер-ции показало, что IS6110 не имеет определенных последовательностей-мешеней для вставки, тем не менее, некоторые регионы предпочтения (preferential regions) или горячие точки (hot-spots) были идентифицированы. Такие, как фосфолипазный регион (pic region), вставка IS1547, регион прямых повторов (direct repeat region, DR-region) и область инициации репликации (OriC) (Fang et al, 1997; Fang et al, 2001; Kurepina et al, 1998; Sampson et al., 1999) DR-локус является специфичной характеристикой для представителей МТК. В ходе исследования этого фрагмента ДНК, разными учеными не было обнаружено значительной гомологии этого локуса с оставшейся геномной ДНК микобактерий МТК и геномами других бактерий (Hermans et al, 1991; van Embden, 2000). DR-область хромосомы M. tuberculosis представляет собой множественный повтор консервативных 36 п. н. тандемов, разделенных неповторяемыми 34-41 п. н. последовательностями (спейсе-рами). Совокупность одного DR и спейсера определена как прямой варьирующий повтор (Direct Variable Repeat, DVR) (Groenen et al, 1993). Использование амплификации DR-области хромосомы микобактерий тубер- кулеза методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволила объединить детекцию, идентификацию и генотипирование возбудителя в единый тест - сполиготипирование (spoligotyping) (Groenen et al, 1993; Kamerbeek et al, 1997; van Embden, 2000). Сущность метода заключается в гибридизации амплифицированных в ходе ПЦР участков DR-области хромосомы штаммов микобактерии туберкулеза с набором из 43 синтетических спей-серных олигонуклеотидных зондов, фиксированных на специальной мембране. При этом штаммы могут отличаться по наличию или отсутствию определенных DVR спейсеров в DR-области, что четко видно на мембране. Различия в профилях сполиготипирования обусловлены транспозицией вставочных элементов 1S6110 (Fang et al, 1998; van Embden, 2000), гомологичной рекомбинацией (Groenen et al, 1993) или сокращением репликации (Hancock, 1995). Этот метод не требует выделения чистых культур микобактерии туберкулеза, поскольку для амплификации достаточно незначительного количества бактериальных клеток (в том числе нежизнеспособных) в исходном материале. Что дает возможность использовать не только культуры микобактерии туберкулеза, но и окрашенные мазки из мокроты, пунктаты и гистологические препараты (Driscoll et al, 1999; Kamerbeek et al, 1997; Qian et al, 1999; van der Zanden, 1998). Помимо этого, результаты сполиготипирования могут быть выражены в цифровом формате, что дает возможность компьютерного анализа полученных данных и единую интерпретацию результатов между разными лабораториями (Dale et al, 2001). Тем не менее, сполиготипирование имеет меньшую дискри-минативную способность в отличие от \S6110 генотипирования (Kremer et al, 1999). PGRS (Polymorphic GC-rich Repetitive sequence) типирование - впервые описанно Ross в 1992 году - это Саузерн-блот гибридизационная техника, сходная с IS 57/0-RFLP, где используется рестрикция Alul эндонук-леазой и PGRS-специфичный зонд (Ross et al, 1992).
Зонд представляет собой 3,4 kb вставку GC-богатой последовательности, содержащейся в ре-комбинантной плазмиде (pTBN12). При гибридизации с рестрицированной Alul хромосомной ДНК М. tuberculosis, получаемый профиль позволяет выделять цепочки трансмиссии, сходные эпидемиологически несвязанные штаммы (Yang, 1996). Кластеры микобактерий, определенные IS6110-RFLP методом, также выделяются PGRS типированием, помимо этого метод применяется для типирования штаммов с малым числом копий IS6110 элемента (Chaves et al, 1996; Rhee et al., 2000; Yang, 2001). Однако профайлы PGRS-типирования сложны для компьютерного анализа и стандартизации. Поиск новых способов идентификации возбудителя совсем недавно привел к разработке системы генотипирования бактерий МТК, основанной на полиморфизме двенадцати локусов из 41, обнаруженного в геноме микобактерий туберкулеза. Локусы включают тандемные повторы, варьирующие по количеству копий (variable number tandem repeats, VNTR), названные MIRU (mycobacterial interspersed repetitive units) (Cowan et al., 2002; Frothingham et al, 1998; Mazars et al, 2001; Skuce et al, 2002; Supply, 2000). MIRU-VNTR анализ основан на ПЦР амплификации фрагментов ДНК, содержащих варьирующее число тандемных повторов. С последующим анализом полиморфизма размера ампликонов, зависящего от количества копий повторов в тандеме в каждом из анализируемых локусов. Для амплификации используются праймеры, комплементарные фланкирующим MIRU последовательностям. Результаты анализа легко могут быть представлены в цифровом формате, что дает возможность для их единой межлабораторной интерпретации. Преимуществами данного метода типирования являются быстрота проведения анализа, нет необходимости выделения большого количества геномной ДНК, простота проведения, дискри-минативная способность, сравнимая с таковой при IS-RFLP типировании. Разработанная система нашла применение в практике многих лабораторий,
в том числе для предварительного типирования штаммов с малым количеством копий IS6110 элемента наряду со сполиготипированием (Kremer, 2005; Sola, 2003; Sun, 2004; Warren, 2004). .
Выделение ДНК из культур микобактерий
Для выделения ДНК из культур микобактерий применяли следующую ниже методику, отработанную и успешно используемую в лаборатории Центра исследования туберкулеза: Инкубированную при 37С в течение 3-4 недель на среде Левен-штейна-Иенсена культуру М. tuberculosis шпателем или большой бактериологической петлей, в максимально возможном объеме, переносили в пробирку «Эппендорф» с 500 мкл дистиллированной воды, суспендировали. Выдерживали на водяной бане при 80С в течение 30 минут. Добавляли 70 мкл 10% SDS и 50 мкл протеиназы К (водный 39 раствор 10 мг/мл) инкубировали 1 час на водяной бане при 60С при многократном встряхивании. Добавляли 100 мкл 5М NaCl (Merck, Германия) перемешивали переворачиванием, добавляли СТАВ (1% СТАВ в 0,7М NaCl (Merck, Германия)), тщательно перемешивали переворачиванием пробирки. Инкубировали на водяной бане при 60С - 15 мин. При периодическом встряхивании пробирки. Замораживали на 15 мин при -70С (либо оставляли на ночь при температуре -20С). Доводили до комнатной температуры, добавляли 700 мкл смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1), перемешивали переворачиванием (20-25 раз) до отсутствия разделения фаз. Центрифугировали в течение 10 мин при 13000 оборотов /мин. Переносили верхнюю водную фазу ( 700мкл) в пробирку с 700 мкл холодного изопропанола, перемешивали переворачиванием. Охлаждали 30-40 мин при -20С или оставляли на ночь при +4С для осаждения ДНК. Центрифугировали в течение 10 мин при 13000 min-1. Сливали изопропанол, осадок промывали 80% этанолом, центрифугировали 5-Ю мин. Удаляли этанол, сушили осадок. Добавляли 55 мкл дистиллированной воды, оставляли на ночь при +4С для лучшего растворения. Ресуспендировали пипетировани-ем. Анализировали выделенную ДНК по 5 мкл в 1% агарозном (BioRad) геле. В процессе исследований были подобраны последовательности прай-меров для амплификации различных фрагментов ДНК микобактерий. Для создания зондов TbDl, RD6 были использованы праймеры, предложенные ранее (Brosch et ah, 2002).
Праймеры и область их применения в проводимых исследованиях представлены в таблице 2. Для создания зонда, специфичного к IS 67 і 0 элементу, использовали предложенную ранее методику (van Embden et al., 1993). Праймеры для амплификации фрагмента представлены в таблице 2, в качестве матрицы использовали ДНК штамма М. tuberculosis TN 14430. Амплификацию проводили в 100 мкл реакционной смеси, содержащей: 5 мкл - 10х буфера (Roche Diagnostics GmbH) 4mM MgCl2, 4 мкл - 5mM смеси dNTP, no 1 мкл 10 pmol каждого праймера, 10 нг ДНК, 1 мкл Taq DNA Polymerase (Roche Diagnostics GmbH) при 94C - 2 мин, 40 циклов (94C - 20 сек, 62C - 10 сек, 72C - 30 сек), 2 мин 72C, на амплификаторе Gen Amp PCR System 2700 (Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA). Полученный фрагмент оценивали электрофорезом в агарозном геле в 1х ТВЕ буфере, затем обрабатывали с использованием набора для гибридизации (Enhanced Chemilumi-nescent kit, ECL, Amersham Biosciences, England) по следующей методике: На 1 объем ДНК (10 мкл) брали равный объем дистиллированной воды (10 мкл) (Enhanced Chemiluminescent kit, ECL, Amersham Biosciences, England), денатурировали кипячением на водяной бане в течение 5 мин и переносили в лед на 10 мин. Добавляли двойной объем (20 мкл) реактива из набора с люменофором «Labelling reagent», а затем такой же объем Gluaraldehyde, выдерживали 15 мин при 37С, общий объем зонда для гибридизации одной мембраны - 60 мкл. Полученный зонд в дальнейшем использовали для RFLP гибридизации (см. раздел 2.5 главы 2). При анализе делеций TbDl и RD6 использовали зонды для RFLP ти-пирования, созданные на основе амплифицированных фрагментов данных регионов штаммов М. tuberculosis H37Rv и М. bovis ВЕ4, соответственно. Для амплификации фрагментов использовали праймеры, предложенные ранее (Brosch et al, 2002) (табл. 1). Условия ПНР и методика приготовления зондов использовались те же, что и для приготовления 18 5/70-зонда. Для анализа делеций 7 п. н. в генах pks 15/1 использовали молекулярные зонды «molecularbeacons», которые в реакционной смеси в свободном состоянии образуют структуру «шпильки», сближающую флюоресцирующий компонент с гасителем флюоресценции. При гибридизации зондов с «мишенью» - комплементарными фрагментами ДНК (в условиях нашего исследования - нарабатываемого ПНР продукта), они (зонды) изменяют свою конформацию на линейную. При этом освобождается флюоресцирующий компонент от гасителя, что выражается в нарастании уровня флюоресценции в процессе реакции по мере наработки соответствующего гомологичного ПНР продукта (Marras et al., 1999). Молекулярные зонды и праймеры были сконструированы с использованием Beacon Designer software (Premier Biosoft International, http://www.premierbiosoft.com/ molecular_beacons/molecular_beacons.html), Beacon Designer, version 2.12, software и Oligo, version 4.04, software (Molecular Biology Insights Inc., Cascade, США) и заказаны в компаниях Biosearch Technologies Inc, США и Sigma-Genosys, Woodlands, Texas, США, соответственно. ПНР проводили на амплификаторе Мх4000 (Stratagene, США), позволяющем проследить повышение уровня флюоресценции в процессе реакции в режиме реального времени (RT-PCR). При проведении ПЦР использовали реактивы Stratagene, США. Зонд, специфичный для штаммов с 7 п. н. делецией в генах pksl5/l с 5 конца был мечен флюоресцирующим красителем 6-carboxy-2 ,4,4 ,5 ,7,7 -hexachIorofluorescein (HEX-fluorophore); второй зонд, специфичный к интактному региону с 5 конца был помечен красителем 5-carboxyfluorescein (FAM-fluorophore).
Оба зонда имели dabcyl в 3 положении. В реакции оба зонда использовались одновременно. Для идентификации W-Beijing штаммов М. tuberculosis был создан многокомпонентный W-Beijing зонд, созданный, как комбинация ПЦР-ампликонов специфических геномных локусов, описанных ранее (Kremer et al, 1999; Kurepina et al, 1998; Plikaytis et al, 1994). Для амплификации фрагментов использовали хромосомную ДНК лабораторного штамма H37Rv, АТСС 35837 (http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/genome.cgi) (Cole et al, 1998). Определяющим в дизайне гибридизационных зондов было ограничение по количеству получаемых гибридизационных полос. Последовательности и локализация праймеров в геноме согласно нумерации нук-леотидов для H37RV представлены в таблице 1. Амплификация проводилась с использованием амплификатора GenAmp PCR System 2700 (Applied Bio-systems, Inc, Foster City, CA) в 100 мкл, 4 mM MgC12, при 94C - 2 min, 35 циклов (94C - 20 сек, 62C - 10 сек, 72C - 30 сек), 72C - 2 мин, с Taq DNA Polymerase (Roche Diagnostics GmbH). Очистка полученных ПЦР продуктов при необходимости проводилась с использованием QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Cat. No.28106, Valencia, CA). Для приготовления W-Beijing зонда, необходимого для повторной гибридизации одной мембраны, амплифицированные фрагменты были взяты в пропорции 1:2:2,5 ( 5 мкл (DR фрагмент) + 10 мкл (dna A-N локус) +12 мкл (NTF регион)). Методика для создания многокомпонентного зонда применялась аналогичная описанной выше для создания зонда IS6110, с тем же набором реактивов для гибридизации. 2.5. Реактивы для гибридизации по Саузерну 20х SSC 3 М NaCl (Merck, Германия) 175,3 г/л и 0,3 М цитрат натрия 88,2 г/л растворяли в бидистиллированной воде и доводили рН до 7,0. Приготовление буфера для гибридизации (ECL - буфер) На 300 мл раствора: 270 мл гибридизационного буфера ECL (Enhanced Chemiluminescent kit, ECL, Amersham Biosciences, England); 30 мл 5M NaCl (Merck, Германия); 15г закрепителя (Blocking agent - Enhanced Chemiluminescent kit, ECL, Amersham Biosciences, England). Раствор для первичной отмывки На 1 л раствора: 360 г. мочевины (Promega, США); 25 мл 20х SSC; 20 мл 20% SDS (Fluka, Швейцария).
Интерпретация результатов гибридизации с многокомпонентным W-Beijing зондом
Алгоритм для интерпретации гибридизационных профилей представлен на рисунке 6. Используя этот алгоритм, каждый индивидуальный штамм может быть соотнесен с W-Beijing филогенетической линией, W-Beijing семейством или отнесен к другому кластеру штаммов. В таблице 5 представлены результаты регибридизации мембран, содержащих рестри-цированную PvuII ферментом ДНК клинических изолятов М. tuberculosis. Для оценки данного метода было регибридизованно 526 клинических изолятов (32 мембраны) с W-Beijing-полизондом, затем полученные гибриди-зационные профили были проанализированы. Следуя данному алгоритму, было выделено три основные группы. Первая группа состоит из 104 изолятов с профилями гибридизации, имеющими полосы 3,65 kb, 3,36 и 1,6 kb (соответственно DR, dnaA-dnaN и NTF фрагментам), и два изолята с 3,65 kb, 3,36 kb и 1,1 kb полосами. Эти 106 штаммов были распознаны как члены семейства W-Beijing, что было подтверждено проводимым ранее компьютерным анализом IS67/0-RFLP профилей гибридизации (идентичность профилей более 65%). По данным компьютерного анализа, эти 106 штаммов представляют 46 независимых кластеров, которые отличаются друг от друга в меньшем случае на одну вставку IS6110 или имеют сдвиг в размере гибридизационных полос. Вторая группа из 42 изолятов с размерами полос гибридизации 3,65 kb, 3,36 kb и 1,4 соответственно для членов W-Beijing филогенетической линии (предшествующие «ancestral» штаммы). Эти изоляты были ранее отнесены при анализе в PHRI ТВ Center как члены N, HD, CI, KY, LB и других семейств. Предшествующие штаммы не могут быть распознаны по IS6110 профилям, при компьютерном анализе они имеют менее 65% сходство IS6770-RFLP профилей с изолятами, относящимися к W-Beijing семейству. Эти две группы вместе являются представителями W-Beijing филогенетической линии (п=148). Третья группа состояла из 378 изолятов, которые демонстрировали одну или две гибридизационные полосы различного размера вдобавок к 10,85 kb и 1,4 kb гибридизационным полосам. Как и ожидалось, эти 377 изолятов характеризуются отсутствием IS6110 вставок в dnaA-dnaN и NTF локусах и как минимум наличием одной копии 1S6110 в DR области хромосомы и, таким образом, не принадлежат к W-Beijing фенотипическому линейджу или семейству.
С двумя ложно-отрицательными и одним ложноположительным результатами, чувствительность и специфичность W-Beijing-полизонда была определена 98,7% (п=526) (147/149) и 99,7% (377/378) соответственно (табл. 5). Ложно-отрицательные случаи были представлены двумя штаммами W семейства, которые приобрели вторую копию IS6110 элемента в области инициации репликации (линии 13 и 14, рис. 5); один W-Beijing не родственный штамм со вставкой IS6110 элемента в другой отличной от А1 локализации дал ложно-положительный результат. Полирезистентный штамм М. tuberculosis, вызвавший вспышки туберкулеза как внутрибольничного заболевания с высоким уровнем смерт-ности заболевших, был идентифицирован в Нью-Йорке в начале 1990 годов (Bifani et ah, 1996; Frieden et al, 1996;.Munsiff, 2003). Этот штамм определенный как W, был объектом многих исследований. В 1991 году в Китае группой независимых исследователей было сделано сообщение о доминирующей группе изолятов М. tuberculosis, характеризующейся большим количеством копий IS6110 элементов (15-24 в геноме) и по характерным 1S6110-KFLP гибридизационным профилям эта группа изолятов была названа Beijing штаммами (van Soolingen et al., 1995). На сегодняшний день в ходе многочисленных исследований выяснено, что W, W - родственные и Beijing штаммы генетически сходны, соответственно могут быть объединены под названием «W-Beijing» или «Beijing/W» семейство штаммов (Bifani et al., 2002; Glynn et al., 2002). Генетическая связь между W-Beijing штаммами определена с использованием множества отдельных молекулярных маркеров, включая IS6770-RFLP, VNTR, делеционные анализы и сполиготипирование (Bifani et al., 2001; Bifani et al, 2002; Bifani et al, 1999; Kurepina et al, 1998). Более того, недавние исследования показали, что W-Beijing штаммы относятся ко II кластеру по sSNPs анализу и являются W-Beijing филогенетической линией (Gutacker et al, 2002). На рисунке 5 схематически показаны филогенетические взаимоотношения штаммов М. tuberculosis, основанные на генетических маркерах, описанных в данной работе. Последние сообщения показали, что манифестация заболевания может в определенной мере быть обусловлена взаимодействием между штаммами М. tuberculosis и иммунной системой хозяина. В одном из сообщений отражено, что в особенности штамм 210 (относящийся к семейству W-, Beijing) способен к репликации в культивированных человеческих макрофагах на более высоком уровне в 4-8 раз по сравнению с другими неродственными штаммами (Zhang et al, 1999). Другие исследования наблюдали 10-ти кратное увеличение бациллярного заселения легких и низкую выживаемость мышей, инфицированных W-Beijing штаммами в сравнении с другими тестируемыми изолятами (Manca et al, 2001). Исследователи отмечают, что эти феномены коррелируют с низким иммунным ответом хозяина, индуцированным инфицированием W-Beijing штаммами. При инфицировании W-Beijing штаммами выявляется низкий цитокин-зависимый ТЫ протективный иммунный ответ хозяина, таким образом, для этих штаммов характерно торможение внутриклеточной элиминации М. tuberculosis макрофагами, что в определенной степени может объяснить успешное существование патогена. На сегодняшний день имеется множество сообщений о возникновении вспышек туберкулеза, вызванных W-Beijing штаммами, широком географическом распространении и высоком преобладании этих штаммов относительно других представителей М. tuberculosis (Bifani et al., 2002; Frieden et al., 1996; Narvskaya et al, 2002; Zhang et al, 1999). Сказанное выше отражает значимость штаммов этого семейства при проведении мероприятий, направленных на контроль над туберкулезом, и подчеркивает необходимость быстрой идентификации W-Beijing штаммов в популяциях М. tuberculosis.
Целью данного этапа исследования являлось разработать быстрый, точный и недорогой метод для идентификации штаммов М. tuberculosis, способный выделить W-Beijing штаммы среди любой коллекции клинических изолятов, ранее генотипированных IS67/0-RFLP методом. Этот метод основывается на комбинации трех выбранных зондов для регибриди-зации уже имеющихся мембран. Мишенями этих зондов являются различные специфичные геномные локусы уникальные для W-Beijing штаммов. Предлагаемые маркеры хорошо изучены и дают эффективную и просто интерпретируемую картину регибридизационных профилей. Наиболее изучен маркер, включающий dnaA-dnaN межгенную область хромосомного локуса инициации репликации. Все W-Beijing штаммы имеют IS61J0 вставку в этой области в позиции А1 и гибридизацион-ную полосу 3,36 kb, соответственно. При гибридизационном анализе PHRI ТВС коллекции изолятов не было описано W-Beijing штаммов, не имеющих вставку в этой позиции, но встречались некоторые редкие изоляты, имеющие вторую вставку в данном регионе (Kurepina et al., 1998). Эти штаммы не имеют 3,36 kb гибридизационной полосы (при рутинном IS6//0-RFLP типировании), и при гибридизации с W-Beijing-полизондом демонстрировали две полосы меньшего размера, в добавок к 3,65kb (DR) и 1,6 kb (NTF) полосам (линии 13 и 14, рис. 5 В). Несмотря на редкость встречаемости таких штаммов очень важно распознать эти исключения, чтобы избежать ложно-негативной идентификации штаммов. Второй выбранный маркер относится к хорошо изученному локусу хромосомы М. tuberculosis, который включает серию прямых повторов, описанных как DR регион. Вариации в присутствии/отсутствии специфических спейсеров в DR лежат в основе сполиготипирования (Groenen et al, 1993). При изучении базы данных результатов сполиготипирования (PHRI ТВС) было выявлено, что большинство штаммов W-Beijing имеют споли-готип NY_S00034 (восьмизначный код 000000000003771, тип 1 в Spoldb3), отсутствие спейсеров 1-34 с позитивной гибридизацией по спейсерам 35-43. Тем не менее, несколько исключений все же было обнаружено (рис. 5 А, В, линии 4-6 и 8) (Bifani et al, 2001). Как результат хромосомных перестановок, связанных с 1S6110 элементом, штаммы W-Beijing филогенетической линии имеют характерную делецию, которая включает часть DR области (спейсеры 1-34) и фланкирующие хромосомные последовательности (Beggs et al, 2000; van Embden, 2000).
Гибридизация с зондамиpks 15/1
Гены pksl5/1 участвуют в синтезе микобактериями фенольных глико-липидов (ФГЛ; phenolic glycolipids, PGL). ФГЛ микобактерий туберкулеза, по данным многих исследователей, считаются важными факторами вирулентности, их действие связано с угнетением Th-І опосредованного иммунного ответа хозяина (Reed, 2004). Показано, что у большинства распространенных клинических штаммов, также как и у лабораторного штамма H37R.V, отмечается сниженный синтез ФГЛ. Это обусловлено делецией 7 п. н. со сдвигом рамки считывания в группе генов поликетид синтетазы (рЫ5/1) (Constant, 2002). Однако, штаммы W-Beijing семейства, характеризующиеся способностью вызывать тяжелые, трудно поддающиеся лечению случаи туберкулеза и высоким уровнем смертности при заражении, имеют интактным кластер генов pks 15/1 и способны экспрессировать значительное количество ФГЛ (Reed, 2004). Таким образом, идентификация штаммов, имеющих полноценные гены pks 15/1, позволяет выявить штаммы с потенциально высокой вирулентностью, в том числе представителей W-Beijing филогенетической линии. В ходе работы было протестировано 300 генетически различных клинических штаммов. На рисунках 9 и 10 схематически показан механизм взаимодействия молекулярных зондов с «мишенями» и кривые уровня флюоресценции, наблюдаемые в ходе реакций. На схеме показаны фрагменты генов pks 15/1 штаммов М. tuberculosis: с интактным регионом (штамм W4) и с 7 п. н. делецией (штамм H37RV); стрелками указаны расположение праймеров, используемых в реакции; использовано два типа молекулярных зондов: 1 - специфичный к интактному фрагменту (FAM-fluorophore, синий цвет); 2 - специфичный к фрагменту с 7 п. н. делецией (HEX fluorophore, красный цвет). Зонды, первоначально имеющие конфигурацию «шпильки», при взаимодействии с комплементарными фрагментами ДНК изменяют структуру и флюоресцируют. Среди тестируемых штаммов 109 дали положительные результаты гибридизации с зондом, специфичным к интактному региону pks 15/1; у 179 штаммов отмечены положительные результаты гибридизации с зондом специфичным к фрагменту с 7 п. н. делецией; девять штаммов М. bo-vis и М. bovis BCG не давали положительных результатов с используемыми зондами, в виду характерной для этой группы делеции 6 п. н. (Constant, 2002), три штамма М. africanum также не давали положительных результатов гибридизации с зондом, специфичным к фрагменту с 7 п. н. делецией, хотя не имели данный регион интактным (Marmiesse, 2004). Таким образом, по результатам проводимого типирования, все тестируемые штаммы, относившиеся ко второй и третьей основным генетическим группам, имели 7 п. н. делецию генов pksl5/l, что соответствует данным ранее проводимых исследований (Constant, 2002; Marmiesse, 2004). Штаммы, имеющие полноценные гены рЫ5/1, являлись представителями первой основной генетической группы I, II, X sSNPs кластеров (табл. 6; рис. 3 прил. 4).
В процессе анализа нами был обнаружен уникальный штамм TN10445 с характеристиками первой основной генетической группы katG463 (Leu) и gyrA95 (Thr), имеющий 7 п. н. делецию кластера генов рЫ5/1, который по результатам гибридизации также имел TbDl делецию. Результаты нашего исследования подтверждают ранее опубликованные предположения, что 7 п. н. делеция в генах pks 15/1 появилась у пред-ковых штаммов до возникновения мутаций в генах katG 3 (Leu-Arg) и gyrA95 (Thr-Ser), характерных для представителей второй и третьей основных генетических групп. Однако, обнаружение штамма TN10445 позволяет предположить, что данный штамм может быть представителем переходной ветви с «ancestral» типом гена katG463 (Leu) уже имеющих ТЬБІделецию и с 7 п. н. в генахpksl5/l (Sinsimer et al, 2005). Тем не менее, повреждение генов pksl5/l не является единственным путем нарушения синтеза фенольных гликолипидов. Синтез ФГЛ микобактериями представляет собой многоступенчатый комплексный процесс, требующий взаимодействия продуктов многих генов (Reed, 2004). Многие стадии этого процесса остаются еще не до конца выясненными и требуют проведения дальнейших исследований. В заключение необходимо отметить, что метод RFLP анализа клинических штаммов с использованием разработанного TbDl зонда позволяет идентифицировать представителей sSNPs кластера 1, основной генетической группы 1 среди клинических изолятов. Возникновение данной деле-ции предшествует мутациям, определяющим принадлежность штаммов к 2 и 3 основным генетическим группам и sSNPs кластерам II, X первой основной генетической группы. Определение RD6 делеции у клинических штаммов не является строгой характеристикой какой-либо определенной группы микобактерий, выделенной IS6770-RFLP и sSNPs методами. Идентификация штаммов с интактными генами pksl5/l позволяет выделить группу потенциально высоко вирулентных изолятов, в том числе и представителей W-Beijing семейства.
