Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 6
2. Обзор литературы. Методы генотипирования вирусов 10
2.1 Уникальные методы генотипирования РНК-содержащих вирусов 11
2.1.1. Олигонуклеотидный метод "отпечатков пальцев" 11
2.1.2. Анализ полиморфизма длин геномных сегментов. (Электрофоретипирование) 13
2.2. Методы генотипирования ДНК- и РНК-содержащих вирусов 15
2.2.1. Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот 15
2.2.2. Иммуноферментный анализ ДНК 16
2.2.3. Анализ с помощью РНКазы А 17
2.2.4. Гетеродуплексный анализ 19
2.2.4.1. Анализ подвижности гетеродуплексов 19
2.2.4.2. Анализ подвижности гетеродуплексов с меченым зондом 20
2.2.5. Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК 22
2.2.6. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) 24
2.2.6.1. Классический ПДРФ анализ 24
2.2.6.2. ПЦР-ПДРФ анализ 27
2.2.6.3. ОТ-ПЦР-ПДРФ анализ 29
2.2.6.4. ДПЦР-ПДРФ анализ 30
2.2.6.5. Филогенетический анализ данных ПДРФ 31
2.2.6.6. Саузерн-блот анализ 32
2.2.7. Определение нуклеотидной последовательности вирусных геномов 32
2.2.7.1. Методы секвенирования 32
2.2.7.2. Стратегия секвенирования протяженных фрагментов ДНК 34
2.2.7.3. Применение секвенирования для генотипирования вирусов 36
2.2.8. Генотипирование смешанных инфекций 38
2.3. Генотипирование поксвирусов 40
2.3.1. ПДРФ анализ ДНК ортопоксвирусов 40
2.3.2. ПЦР-ПДРФ анализ ортопоксвирусов 43
2.3.3. ПЦР методы анализа ДНК ортопоксвирусов 50
2.3.4. Методы молекулярной гибридизации ортопоксвирусов 52
2.3.5. ПДРФ анализ ДНК поксвирусов 53
2.3.6. Определение нуклеотидных последовательностей поксвирусов 55
2.4. Заключение 57
3. Материалы и методы 59
3.1. Материалы 59
3.2. Выделение ДНК вируса натуральной оспы 66
3.2.1. Вьщеление ДНК вируса натуральной оспы, культивированного в культуре клеток Vera 66
3.2.2. Вьщеление ДНК вируса натуральной оспы, культивированного наХАО КЭ 67
3.3. Олигонуклеотидные праймеры для ДПЦР 68
3.3.1. Олигонуклеотидные праймеры для получения музеев ампликонов и клонотек фрагментов ДНК ВНО 68
3.3.2. Олигонуклеотидные праймеры для ПДРФ-ДПЦР анализа 69
3.4. Длинная полимеразная цепная реакция (ДПЦР) 72
3.5. Получение рекомбинантных плазмид 72
3.6. Приготовление компетентных клеток E.coli 73
3.7. Трансформация компетентных клеток E.coli 73
3.8. Вьщеление плазмидной ДНК 73
3.9. ДПЦР-ПДРФ анализ 74
3.10. Филогенетический анализ данных ДПЦР-ПДРФ 74
4. Результаты 75
4.1. Получение и характеризация препаратов полноразмерных ДНК ВНО 75
4.2. Создание и характеризация музея коллекций ампликонов ДНК ВНО 75
4.2.1. Расчет олигонуклеотидных праймеров для ДПЦР 75
4.2.2. Получение и характеризация коллекций ампликонов ДНК ВНО 76
4.2.3. Создание музея коллекций ампликонов ДНК ВНО 78
4.3. Создание клонотек фрагментов ДНК полных геномов штаммов вируса натуральной оспы 79
4.3.1. Расчет олигонуклеотидных праймеров для ДПЦР 80
4.3.2. Синтез ампликонов ДНК ВНО для получения рекомбинантных плазмид 80
4.3.3. Получение рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты ДНК ВНО 80
4.3.4. Создание музея клонотек фрагментов ДНК ВНО 82
4.4. Изучение вариабельности геномов разных штаммов ВНО при использовании ДПЦР-ПДРФ анализа 84
4.4.1. Расчет олигонуклеотидных праймеров для ДПЦР 84
4.4.2. Получение ампликонов для ДПЦР-ПДРФ анализа Российской коллекции ДНК ВНО 85
4.4.3. Получение рестрикционных профилей ампликонов 86
4.4.4. Филогенетический анализ ДПЦР-ПДРФ базы данных штаммов ВНО Российской коллекции 88
4.4.5. Филогенетическое сравнение геномов штаммов ВНО Российской коллекции и коллекции США 97
Обсуждение результатов 108
Выводы 119
- Методы генотипирования ДНК- и РНК-содержащих вирусов
- Генотипирование поксвирусов
- Выделение ДНК вируса натуральной оспы
- Изучение вариабельности геномов разных штаммов ВНО при использовании ДПЦР-ПДРФ анализа
Введение к работе
Широкомасштабные мероприятия, предпринятые мировым сообществом под эгидой Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по вакцинопрофилактике населения Земного шара против натуральной оспы и строгому противоэпидемическому надзору, привели к ликвидации этого заболевания на планете (WHO, 1980). В настоящее время коллекции вирусов натуральной оспы (ВНО) поддерживаются только в двух Сотрудничающих центрах ВОЗ: в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Кольцово, Россия) и в Центре по контролю и профилактике заболеваний (Атланта, США). В результате повсеместного прекращения после 1980 года иммунизации против оспы доля населения, восприимчивого к ВНО, постоянно увеличивается. Наличие хранилищ жизнеспособных штаммов ВНО рассматривается как источник возможной биологической опасности. Поэтому на четвертом заседании Комитета ВОЗ по ортопоксвирусным инфекциям в 1986 году было принято решение о необходимости уничтожения коллекций штаммов ВНО и их геномных ДНК (WHO, 1980). Учитывая планируемое уничтожение в будущем коллекций ВНО, необходимо осуществить надежную консервацию в биологически безопасной форме генетического материала разных изолятов ВНО, что чрезвычайно важно для будущих исследований.
Эксперименты, выполненные ранее в лаборатории проф. С.С.Маренниковой, выявили большое разнообразие штаммов ВНО по спектру биологических свойств (Маренникова, Щелкунов, 1998). Поэтому, несомненно, важным направлением исследований является дальнейшее углубленное сравнительное изучение структуры геномов широкого набора изолятов ВНО, выделенных в разное время в разных географических зонах. Только детальное генотипирование штаммов позволит выявить границы изменчивости их геномов.
Известно, что штаммы ВНО различного географического происхождения могут вызывать поражения человека, отличающиеся по тяжести и формам протекания заболевания. Оспа, характеризующаяся легким течением, исторически получила название малая оспа (variola minor), в то время как оспу, вызывающую тяжелые заболевания, относят к большой оспе (variola major). В Азии был распространен тип variola major, тогда как в Африке существовали оба типа ВНО. Штаммы малой оспы, циркулирующие в Америке, принято называть alastrim. Биологические тесты выявили четкие отличия штаммов alastrim как от штаммов variola major, так и от изученных африканских изолятов variola minor (Fenner et al, 1989; Маренникова и Щелкунов, 1998).
7 Натуральная оспа была ликвидирована до периода бурного развития новейших технологий молекулярной биологии, наблюдаемого в последние два десятилетия. Поэтому возбудитель данного заболевания и его геном остались почти не изученными. Без фундаментальных исследований генома ВНО разработка современных методов диагностики ВНО и других ортопоксвирусов, создание новых эффективных и безопасных вакцин, методов лечения натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций типа оспы обезьян у человека невозможны или мало эффективны.
Цели и задачи исследования
Целями настоящего исследования были консервация генетического материала различных штаммов вируса натуральной оспы в биологически безопасной форме, изучение вариабельности геномов набора штаммов ВНО из коллекций России и США и оценка скорости молекулярной эволюции штаммов ВНО.
В ходе работы решались следующие задачи:
Выделение препаратов ДНК вируса натуральной оспы и получение музея препаратов полноразмерных ДНК набора штаммов ВНО.
Создание и характеризация музея коллекций перекрывающихся ампликонов, охватывающих в совокупности полный геном ВНО, для набора штаммов этого вируса.
Получение и характеризация музея клонотек гибридных плазмид, содержащих фрагменты ДНК, покрывающих в совокупности полные геномы набора штаммов ВНО.
Сравнительный рестрикционный анализ продуктов длинной полимеразной цепной реакции (ДПЦР) полных геномов штаммов ВНО Российской коллекции.
Филогенетический анализ генетического разнообразия штаммов ВНО Российской коллекции на основе данных исследования полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) продуктов ДПЦР.
Сравнительное изучение молекулярно-биологического разнообразия 63 штаммов ВНО из Российской коллекции и коллекции США.
Оценка скорости молекулярной эволюции штаммов ВНО на основе данных ДПЦР-ПДРФ анализа.
Научная новизна и практическая значимость работы
Создан музей препаратов полноразмерных ДНК штаммов ВНО, позволяющий проводить дальнейшее изучение структурно-функциональной организации генома этого уникального вируса.
Впервые реализована стратегия создания коллекции ампликонов, перекрывающих в совокупности полный геном ВНО.
На основе полученной коллекции ампликонов получены представительные библиотеки гибридных плазмид, содержащих фрагменты полных геномов девяти штаммов ВНО.
Проведена паспортизация и надежная консервация полученного музея ампликонов семнадцати штаммов ВНО и музея клонотек девяти штаммов ВНО в составе Международного репозитария ДНК ВНО при ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», что дает возможность использовать их в последующих научных исследованиях. Полученный репозитарий обеспечит возможность долговременного и безопасного хранения фрагментов генома разных вариантов ВНО, используя которые можно будет создавать новейшие поколения вакцин, продуценты любых вирусных белков, накапливать данные секвенирования выбранных районов генома ВНО и разрабатывать новейшие методы ДНК-диагностики.
Впервые проведен сравнительный анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов двадцати ампликонов, покрывающих в сумме полные геномы 21 штамма ВНО Российской коллекции. Была использована стратегия получения ампликонов ДНК ВНО с помощью длинной полимеразной цепной реакции. Создана база данных ДПЦР-ПДРФ анализа, которая может быть использована как референс система для генотипирования штаммов ВНО. Филогенетический анализ выявил, что штаммы ВНО группируются в зависимости от их географического происхождения, и штаммы alastrim демонстрируют наибольшие отличия от остальных штаммов ВНО. Впервые выявлен полиморфизм штаммов ВНО внутри одной численно малой вспышки натуральной оспы, произошедшей в Москве в 1960 г.
Проведено подробное исследование генетического разнообразия 63 штаммов ВНО, находящихся в коллекциях ГНЦ ВБ «Вектор» (Россия) и Центре по контролю и предотвращению заболеваний (США) и имеющих различное географическое происхождение. При проведении сравнительного филогенетического анализа данных ДПЦР-ПДРФ этих штаммов ВНО показано, что западноафриканские штаммы ВНО и штаммы ВНО minor alastrim относятся к отдельному подтипу ВНО, демонстрирующему наибольшие отличия от остальных штаммов ВНО, и что штаммы alastrim произошли от
9 западноафриканских штаммов ВНО. Впервые сделано предположение о времени, когда западноафриканский подтип эволюционно произошел из вида вируса натуральной оспы.
Апробация работы
По материалы диссертации опубликованы 3 статьи в реферируемых изданиях. Результаты работы были представлены на международных конференциях: 4th, 5th and 7th Meetings of the WHO Advisory Committee on Variola Virus Research (Geneva, Switzerland, 2002; 2003; 2005); 2nd, 4th and 5th US-Russia Cooperative Biological Research Review Conferences (Serpukhov, St. Petersburg, St. Petersburg, Russia, 2002; 2004; 2005); the XVth International Poxvirus and Iridovirus Symposium (Oxford, UK, 2004).
Вклад автора
Выделение препаратов ДНК вируса натуральной оспы проводилось в лаборатории 1-го уровня биобезопасности ГНЦ ВБ «Вектор» автором совместно с И.В. Бабкиным и М.В. Михеевым. Создание и характеризация музея коллекций ампликонов ДНК ВНО выполнено лично автором. Получение и характеризация музея клонотек геномов штаммов ВНО в плазмидных векторах выполнено П.Ф. Сафроновым, Е.А. Уваровой, А.В. Тотмениным, Л.Н. Голиковой, Е. В. Серегиной совместно с автором. ДПЦР-ПДРФ анализ двадцати одного штамма ВНО Российской коллекции выполнен лично автором. ДПЦР-ПДРФ анализ сорока пяти штаммов ВНО из коллекции США выполнен Ю Ли при участии автора. Филогенетический анализ генетического разнообразия штаммов ВНО из Российской коллекции и коллекции США проведен автором совместно с И.В. Бабкиным.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
МЕТОДЫ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ВИРУСОВ
В последние годы все острее встает проблема возникновения новых вирусных заболеваний. СПИД, синдром атипичной пневмонии, лихорадка Эбола, птичий грипп являются угрозами для всего человеческого сообщества. В случае ортопоксвирусов обращают на себя внимание вспышки оспы обезьян в Демократической Республике Конго, начавшиеся в 1996-1997 гг. и продолжающиеся до сих пор, свидетельствуя о возрастании трансмиссибильности этой инфекции на фоне исчезновения иммунитета к оспе. При этом процент заболевших в результате передачи инфекции от человека к человеку до 1986 г. был около 30%, от общего числа зарегистрированных больных. В 1996 году этот показатель увеличился в 2,5 раза и составил 73%. Возросло в 2 раза и число генераций в цепи передачи инфекции от человека к человеку. Выявившиеся факты привели к пересмотру представлений о вирусе оспы обезьян как о малоконтагиозной инфекции, не представляющей интереса для общественного здравоохранения (Mukinda et a/.,1997;Hutine/a/.,2001).
В связи с вышесказанным очень важно исследовать изменчивость и эволюционные взаимосвязи вирусов. Современные методы типирования вирусов подразделяют на фено-и генотипические. Фенотипические методы - это методы, с помощью которых определяются характеристики, проявляемые вирусом. Генотипические - это методы исследования структуры полноразмерных геномов или их фрагментов (Belkum, 1994; Шагинян, 2000).
К фенотипическим методам относятся (Мацеевич 1996; Шагинян, 2000; Носик и Стаханова, 2000):
Классические вирусологические методы - изучение размножения вируса на восприимчивых животных, в пермиссивных культурах клеток или на хорионаллантоисных оболочках куриных эмбрионов.
Серологические методы, основанные на взаимодействии антигена с антителом -реакция связывания комплемента, реакции пассивной и обратной гемагглютинации, реакция торможения гемагглютинации, реакция агглютинации сенсибилизированных вирусными антигенами эритроцитов, метод иммунофлуоресценции, а также различные варианты иммуноферментного анализа.
3. Морфологические методы типирования - электронная и иммунная электронная
микроскопии.
Фенотипические методы широко используются для диагностики хорошо изученных штаммов вирусов, однако, они мало подходят для изучения изменчивости
11 вирусов. Для этой цели необходимо использовать генотипические (молекулярные) методы, выявляющие различия в структуре вирусных геномов (табл.1) (Arens, 1999).
Вирусные геномы могут мутировать, при этом сохраняются существенные характеристики их белков и вирионов. Эта изменчивость - основа для молекулярной характеризации и классификации типов вирусов. Некоторые области вирусного генома чрезвычайно консервативны, в то время как другие области могут быть гипервариабельными. Если изучается только фрагмент генома, необходимо подходить к его выбору с большим вниманием. Структура тестируемого фрагмента должна представлять собой вариабельную последовательность, фланкированную консервативными участками. Это позволяет проводить амплификацию последовательности с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и типировать всех представителей вида по результатам анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) или определения нуклеотидной последовательности (Arens, 1999; Орешкова, 2002).
Замены нуклеотидных оснований (н.о.) могут и не приводить к замене аминокислотных остатков. Отдельные замены н.о. в геноме вирусного изолята не препятствуют его отнесению к определенному виду, при этом он может быть сгруппирован со сходными изолятами того же самого вируса молекулярными методами. Необходимо отметить, что РНК-содержащие вирусы имеют намного более высокую скорость мутационных изменений, чем ДНК-содержащие вирусы, вследствие того, что вирусные РНК-зависимые РНК-полимеразы не могут редактировать ошибки, сделанные во время репликации генома (Arens, 1999).
Методы генотипирования ДНК- и РНК-содержащих вирусов
Основой метода молекулярной гибридизации является то, что для образования дуплекса обе цепи нуклеиновых кислот должны иметь комплементарные последовательности, и стабильность дуплекса зависит от протяженности комплементарных участков. В конце 70-х годов был описан метод гибридизации ДНК зонда с известной последовательностью с множеством образцов, иммобилизованных на фильтре, получивший название дот блот анализа (Kafatos et al, 1979). Гибридизация ДНК на фильтрах, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, для идентификации мутаций также впервые была предложена в конце 70-х годов XX века (Wallace et al, 1979). В настоящее время этот метод широко используется для анализа вирусов как сам по себе, так и совместно с другими методами. Обратная гибридизация является методом, основанным на том, что продукты ПЦР гибридизуются со специфическими иммобилизованными зондами (Arens, 1999). При использовании этой технологии были разработаны коммерческие наборы для типирования и субтипирования вируса гепатита С (HCV). РНК HCV выделяют из сыворотки и амплифицируют «гнездовым» ОТ-ПЦР с биотинилированными праймерами. Продукты гибридизуют со специфическими зондами, иммобилизованными на мембранных полосках, и гибриды выявляют с помощью конъюгата щелочной фосфатазы со стрептавидином. Реакция приводит к формированию видимых линий на полосах, позволяя идентифицировать таким образом по крайней мере шесть из девяти известных в настоящее время главных генотипов HCV и соответствующие им субтипы. 2.2.2. Иммуноферментный анализ ДНК Метод иммуноферментного анализа продуктов молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот основан на взаимодействии двухцепочечной ДНК со специфическими антителами к ней. Впервые этот метод был предложен Mantero et al (1991) для детекции ДНК вируса гепатита В. В этом методе денатурированные продукты ПЦР гибридизуются со специфическими олигонуклеотидными зондами, иммобилизованными на планшете. Гибриды связываются с мышиными моноклональными антителами на двухцепочечную ДНК, этот комплекс затем выявляют кроличьими антимышиными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена.
Образование тройного комплекса выявляют с помощью субстрата по окрашиванию раствора. Этот метод был использован для генотипирования ДНК генома вируса папилломы человека (Sangiuolo et al, 1994). Быстрый, чувствительный и специфичный метод позволил выявить большое количество типов этого вируса. Техника иммуноферментного анализа ДНК была развита для типирования вируса простого герпеса (Cassinotti et al, 1996), позволяя отличать тип 1 от типа 2. В статье (Cassinotti and Siegl, 1998) этот подход позволил дополнительно к этим двум типам дифференцировать другого представителя семейства Herpesviridae -цитомегаловируса человека. При сравнении чувствительности различных методов детекции вирусов респираторного тракта человека было показано, что метод иммуноферментного анализа ДНК является более чувствительным, чем иммунофлуоресцентный анализ и изоляция вируса для аденовируса, риновируса, респираторно-синцитиального вируса и вируса парагриппа (Freymuth et al, 1997). Для идентификации типов и субтипов HCV разработаны коммерческие наборы, использующие этот метод. РНК HCV выделяют из сыворотки и амплифицируют «гнездовым» ОТ-ПЦР с праймерами на один из районов HCV. Этот метод более точен при субтипировании, чем метод обратной гибридизации, особенно для субтипов 1 и 2 HCV (Pogam et al, 1998). Однако, ошибка определения субтипа HCV с помощью иммуноферментного анализа ДНК достигает 7%. Этот метод широко применим, так как антитела узнают ДНК/ДНК гибриды независимо от их структуры и без необходимости мечения праймеров и ампликонов. Этот подход объединяет чувствительность ПЦР с простотой иммуноферментного анализа. Иммуноферментный анализ ДНК позволяет в ряде случаев проводить количественную оценку вирусной ДНК. Были предложены методики количественной оценки содержания вирусных ДНК геномов в исследуемых препаратах для вируса Эпштейна-Барр (Zingg et al, 1999) и цитомегаловируса (Nazzari et al, 2000). Однако для генотипирования как методом молекулярной гибридизации, так и иммуноферментным анализом ДНК требуется предварительное определение нуклеотидных последовательностей большого числа изолятов вируса различных субтипов. 2.2.3. Анализ с помощью РНКазы А Этот метод анализа был разработан Myers et al. (1985) для выявления наличия и приблизительного местоположения точечных мутаций в ДНК. Эта технология включает в себя использование относительно короткого, синтезированного in vitro, радиоактивномеченого РНК зонда, который транскрибируется с геномной ДНК дикого типа или стандартного штамма вируса. В оригинальном методе этот РНК зонд затем гибридизуется с ДНК исследуемых штаммов с последующей обработкой гетеродуплекса РНКазой А. Получающиеся фрагменты разделяются в полиакриламидном геле, содержащем мочевину (рис. 2). РНКаза А расщепляет радиоактивный РНК зонд в положениях неправильного спаривания с ДНК. Исследуемые геномы с мутациями, которые не представлены в зонде, или с мутациями в иных положениях, чем в зонде, будут иметь отличное расположение полос в геле. Метод в состоянии обнаружить приблизительно половину всех однобуквенных мутаций (Myers et al, 1985). Неясно, почему все мутации не выявляются, но возможно это связано с вторичной структурой гетеродуплекса.
В случае ДНК-содержащих вирусов анализ с помощью РНКазы А редко используется для генотипирования из-за своей сложности.
Основное применение он находит в изучении функциональной организации геномов, например, для определения активности вирусных промоторов, для картирования сайтов инициации транскрипции и т.д. (Walls and Perricaudet, 1991; Lin et al, 1999). Модификация этого метода позволила использовать его для исследования геномов РНК-содержащих вирусов, включая вирус гриппа и респираторно-синцитиальный вирус. При использовании этой техники было показано присутствие точечных мутаций в РНК-транскриптах c-ras гена (Winter et al, 1985), этот метод широко использовался в эпидемиологическом исследовании респираторно-синцитиального вируса (Storch et al, 1989; Cristina et al, 1990) и в изучении эволюции полевых изолятов вируса гриппа (Lopez-Galindez et al, 1988). Хотя метод технически труден, он позволяет выявлять эпидемиологически связанные изоляты в той же мере, что и ПДРФ анализ ДНК-содержащих вирусов. двухцепочечные районы в местах неправильного спаривания. Продукты гидролиза разделяются электрофорезом в ПААГ, и полосы детектируются радиоавтографией. Изоляты вирусов, имеющие мутации, отличаются друг от друга по расположению полос на геле (Storch et al, 1989). 2.2.4. Гетеродуплексный анализ 2.2АЛ. Анализ подвижности гетеродуплексов Метод основан на получении фрагментов исследуемого вирусного генома, их денатурации и последующей ренатурацией в смеси с аналогичными фрагментами ДНК известного субтипа или типа вируса. Полученный таким образом набор гомо- и гетеродуплексов анализируют в полиакриламидном геле. Показано, что при различии нуклеотидных структур фрагментов, образующих гетеродуплекс, более чем на 1-2% происходит уменьшение скорости миграции гетеродуплекса в полиакриламидном геле по сравнению с соответствующим гомодуплексом. При этом уменьшение подвижности пропорционально генетическому расстоянию, определяемому количеством вставок/делеций или замен (Wang and Griffith, 1991; Barlow et al, 2000). Анализ подвижности гетеродуплексов использовали для исследования генетической изменчивости (на молекулярном уровне) различных штаммов или подвидов вирусов (Arens, 1999). Barrett-Muir et al. (2003) с помощью этого метода провели обширную идентификацию изолятов ДНК-содержащего вируса ветряной оспы/опоясывающего лишая. Было выявлено сорок вариабельных сайтов генома.
Генотипирование поксвирусов
Семейство Poxviridae состоит из подсемейств вирусов позвоночных (Chordopoxvirinae) и вирусов насекомых (Entomopoxvirinae). В состав Chordopoxvirinae входит восемь родов, при этом в род Avipoxvirus входят вирусы птиц, а остальные семь родов включают в себя вирусы млекопитающих. Среди последних наиболее хорошо изучены вирусы рода Orthopoxvirus. Это обусловлено тем, что в состав данного рода входят такие патогенные для человека виды, как вирус натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров и вирус осповакцины, являющийся живой вакциной против натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций (Fenner et al, 1989; Маренникова и Щелкунов, 1998). Генотипирование вирусов рода Ortopoxvirus имеет ряд особенностей, обусловленных структурой генома этих вирусов. Их геном представлен линейной двухцепочечной ДНК с ковалентно замкнутыми концами, называемыми шпильками или теломерами. Молекулярная масса ДНК ортопоксвирусов варьирует от 120 (у вируса натуральной оспы) до 145 мегадальтон (у вируса оспы коров) (Маренникова и Щелкунов, 1998). В ранних исследованиях геном этих вирусов исследовали с помощью ПДРФ анализа различными эндонуклеазами рестрикции (Wittek et al, 1977; Garon et al, 1978; Esposito and Knight, 1985). Для ортопоксвирусов подходящими для видовой идентификации ферментами оказались Hindlll, Xhol, ВатШ, Sail и некоторые другие крупнощепящие ферменты, которые в результате гидролиза ДНК образуют около двух десятков фрагментов (Wittek et al, 1977; Garon et al, 1978; Esposito and Knight, 1985) (рис. 5). В этих работах было показано, что ПДРФ анализ полезен для классификации ортопоксвирусов, так как они группируются по видовой принадлежности при использовании некоторых эндонуклеаз рестрикции. В другой работе было предложено использовать для видовой дифференциации ортопоксвирусов эндонуклеазу рестрикции Hindlll (Esposito et al., 1978). Однако позже исследования изолятов вируса оспы коров, выделенных от различных носителей, показали, что, сохраняя общность картины в целом, рестрикционные карты ДНК большинства изолятов вируса оспы коров отличались как от референс-штамма Brighton, так и друг от друга (Mackett and Archard, 1979; Маренникова и др., 1996). При сравнении рестрикционных карт ДНК разных штаммов и видов ортопоксвирусов (Esposito and Knight, 1985) было обнаружено, что внутренние области генома имели практически идентичное расположение сайтов, в то время как в концевых районах наблюдались многочисленные различия (рис. 6).
На основании этих данных предположили, что в геномах ортопоксвирусов существует центральная консервативная область, в которой находится большая часть жизненно важных генов вируса, и концевые вариабельные области, содержащие гены несущественные для жизнеспособности вируса, но важные для проявления таких свойств вируса как вирулентность, круг хозяев и др. ПДРФ анализ использовали как для дифференциации, так и для идентификации штаммов и видов, относящихся к роду Orthopoxvirus. Этим методом вирус оспы буйволов был классифицирован как подвид вируса осповакцины (Dumbell and Richardson, 1987). ПДРФ анализом были охарактеризованы изоляты вируса оспы верблюдов, вызвавшие вспышку заболевания в Дубай в 1993-1994 гг. (Pfeffer et al., 1996). ПДРФ анализ геномной ДНК требует получения большого количества высококачественной ДНК. Сегодня методы, основанные на ПЦР, значительно усовершенствовали чувствительность и специфичность методов генотипирования вирусов, а расшифровка полных последовательностей геномов различных ортопоксвирусов (Goebel et al, 1990; Massung et al, 1994; Shchelkunov, 1993; Shchelkunov, 1995; Shchelkunov et al, 1998, 2000, 2002; Antoine et al, 1998; Gubser and Smith, 2002; Afonso et al, 2002), существенно увеличила потенциал молекулярно-генетических исследований. В настоящее время ПДРФ анализ ПЦР продуктов широко используется для изучения ортопоксвирусов. Loparev et al. (2001) предложили метод для выявления и дифференциации ортопоксвирусов Старого Света (ВНО, вирус осповакцины, вирус оспы коров, вирус оспы обезьян, вирус оспы верблюдов, вирус эктромелии и татерапокс вирус). Метод основан на амплификации последовательности гена, кодирующего модулятор цитокинового ответа (сгтВ). Подобранная пара праймеров гибридизовалась со всеми геномами изученных ортопоксвирусов Старого Света. Были проанализированы препараты ДНК 43 штаммов различных ортопоксвирусов. Длины амплификационных фрагментов, полученных при использовании ДНК вируса эктромелии (382 п.н.) и вируса осповакцины (1210 п.н.), отличались от длины (1310 п.н.) других ампликонов, синтезированных на матрицах ДНК других ортопоксвирусов Старого Света. Далее полученные после ПЦР фрагменты ДНК гидролизовали определенными эндонуклеазами рестрикции и разделяли электофорезом (ПДРФ анализ). Сначала авторы использовали эндонуклеазу рестрикции МаШ, что позволяло по картине расположения субфрагментов на электрофореграмме осуществлять видовую идентификацию ортопоксвирусов. При этом разные штаммы вируса оспы коров давали различные картины. Было выявлено 4 различных картины рестрикции, соответствующих разным штаммам вируса оспы коров (рис. 7). Также была обнаружена гетерогенность картин рестрикции изучаемого сегмента ДНК штаммов, принадлежащих к вирусам осповакцины и оспы верблюдов. Штаммы вирусов натуральной оспы, оспы обезьян и вирусов, принадлежащих к виду татерапокс, давали видоспецифичные картины распределения рестрикционных фрагментов ДНК гена сгтВ. Также в этой статье представлены результаты рестрикции ампликонов гена сгтВ эндонуклеазами Лей, Sau3A, МаШ, Neil, которые были использованы для внутривидовой дифференциации, однако при проверке 25 штаммов вируса оспы коров была обнаружена высокая вариабельность полученных электрофореграмм.
Несмотря на то, что количество штаммов было достаточно для тестирования возможностей ПДРФ анализа, результаты, представленные в статье, не позволяют говорить о точной дифференциации штаммов разных видов. В работе (Ropp et al, 1995) был разработан способ дифференциации ортопоксвирусов, выделенных в Старом (ВНО, вирус осповакцины, вирус оспы коров, вирус оспы обезьян, вирус оспы верблюдов, вирус эктромелии и поксвирус песчанок) и Новом Свете (вирус оспы енотов, вирус оспы скунсов, поксвирус полевок), с помощью ПЦР-ПДРФ анализа. Для этого были рассчитаны две пары праймеров: одна - для вирусов Старого, а другая - для вирусов Нового Света. Продукты амплификации содержали последовательность гена вирусного гемагглютинина и различались по длине. На первом этапе ампликоны гидролизовали эндонуклеазой рестрикции Taq\ для вирусов Старого Света и Rsa\ при использовании вирусов Нового Света. Была достигнута видовая дифференциация вирусов Нового Света. Однако штаммы вируса оспы коров давали чрезвычайно полиморфную картину распределения фрагментов. Для выявления подвида вируса натуральной оспы alastrim использовали эндонуклеазу рестрикции Hha\. Далее на основании данных секвенирования был рассчитан набор праймеров, состоящий из пар, специфичных для каждого вида ортопоксвирусов. Этот набор позволил более уверенно проводить видоспецифичное дифференцирование в сложных смесях после гидролиза ампликонов ферментами рестрикции. Затем авторы предприняли попытку разработать метод видоспецифичного определения ортопоксвирусов на основе анализа полиморфизма длин амплификационных фрагментов. Это позволило бы избежать стадии гидролиза ампликонов эндонуклеазами рестрикции и ускорить генотипирование. Были предложены новые видоспецифичные наборы праймеров и подобраны условия амплификации, однако оказалось, что для однозначного разделения вирусов на виды необходимо использование высокоочищенных препаратов ДНК, а также подбор специфических условий проведения реакций и концентраций реагентов для каждого вида вируса отдельно. Это чрезвычайно затрудняет постановку такого метода анализа. В исследовании Meyer et al. (1994) было предложено использовать район гена, кодирующего белок тел включения типа A (ATI), для проведения ПЦР-ПДРФ анализа.
Выделение ДНК вируса натуральной оспы
Использованные в работе штаммы ВНО приведены в таблице 2. Выделение ДНК из препаратов вируса натуральной оспы проводили в лаборатории 1-го уровня биобезопасности ГНЦ ВБ «Вектор», сертифицированной для этих работ Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) и Министерством здравоохранения и социального развития РФ. Эксперименты с неинфекционной ДНК ВНО проводили в лаборатории 2-го уровня биобезопасности. 3.2.1. Выделение ДНК вируса натуральной оспы, культивированного в культуре клеток Vero Культуры клеток, инфицированные различными штаммами ВНО были любезно предоставлены сотрудниками ГНЦ ВБ «Вектор» Гуськовым А.А. и Сокуновой Е.В. Клетки из инфицированного клеточного монослоя (приблизительно 1x10 клеток) переносили в 250 мл центрифужные стаканы для JA-10 ротора. Затем клетки собирали центрифугированием в течение 15 минут при 1500g, ресуспендировали в 10 мл изотонического буфера и осаждали центрифугированием в течение 15 минут при 1500g. Клеточную массу ресуспендировали в 9 мл гипотонического буфера и инкубировали при 0С в течение 10 минут, затем добавляли 25 мкл меркаптоэтанола и 1 мл 10% (v/v) Triton Х-100, и продолжили инкубацию 10 минут при 0С с мягким перемешиванием. Центрифугировали в течение 5 минут при 1000g при 4С, супернатант переносили в 50 мл центрифужные стаканы для JA-20 ротора и центрифугировали при 20000g в течение 60 минут при 4С. К осадку добавляли 140 мкл раствора протеиназы К (10 мг/мл) и 1 мл ЛБ, затем инкубировали 10 минут при 56С. Раствор переносили в новые 1,5 мл пробирки по 600 мкл в каждую, и проводили депротеинизацию добавлением равного объема смеси фенол/хлороформ (рН 8,0). Водную фазу переносили в новую 1,5 мл пробирку, добавляли 60 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,0), 30-40 мкг РНК-носителя и 600 мкл изопропанола. Пробирки помещали в передаточную камеру, где проводили обработку формалином и 30% перекисью водорода, и переносили в лабораторию 2-го уровня биобезопасности. Смесь инкубировали в течение 15 минут при -20С и центрифугировали при lOOOOg в течение 15 минут, супернатант удаляли. Осадок промывали 1 мл 70% этанола и растворяли в 600 мкл буфера ТЕ. Добавляли 600 мкл изопропанола, инкубировали в течение 15 минут при -20С, и центрифугировали при 18000g в течение 15 минут, супернатант удаляли. Осадок промывали 1 мл 70% этанола, высушивали при 65С, и растворяли в 300 мкл 1 мМ Трис-HCl (рН 7,0). Раствор хранили при 4С. 3.2.2. Выделение ДНК вируса натуральной оспы, культивированного на ХАОКЭ ХАО КЭ дважды измельчали в гомогенизаторе при максимальных оборотах в течение 3 минут с перерывом в 3 минуты при 4 С.
Гомогенат переносили в центрифужные стаканы для JA-14 ротора и центрифугировали при 1500g в течение 10 минут при 4С. Верхнюю (водную) фазу переносили в центрифужные стаканы для JA-14 ротора. К осадку добавляли равный объем 50 мМ Трис-HCl (рН 9,0) и 1Л объема 1,1,2, трифтортрихлорэтана и измельчали в гомогенизаторе при максимальных оборотах в течение 3 минут с перерывом в 3 минуты при 4 С. Гомогенат переносили в центрифужные стаканы для JA-14 ротора и центрифугировали при 1500g в течение 10 минут при 4С. Супернатанты объединяли. К верхней (водной) фазе добавляли равный объем 50 мМ Трис-HCl (рН 9,0) и 1А объема 1,1,2, трифтортрихлорэтана и повторяли стадии измельчения и центрифугирования. К объединенному супернатанту добавляли 1,1,2, трифтортрихлорэтан до 1А по объему и центрифугировали в JA-14 роторе в течение 10 минут при 1500g. Водную фазу отбирали от 1,1,2, трифтортрихлорэтана и центрифугировали при 20000g в течение 60 минут при 4С. К осадку добавляли 5 объемов 50 мМ Трис-HCl (рН 9,0) и обрабатывали ультразвуком (20 кГц 5 ватт) в течение 3 минут при 4С до получения опалесцирующего препарата. Полученный гомогенат наслаивали на подложку из 5 мл 36% сахарозы в 1 мМ Трис-HCl (рН 9,0), в стакане для JA-14 ротора и центрифугировали 80 минут при 20000g. После центрифугирования верхнюю фазу убирали, а к осадку, содержащему вирус добавляли 5 объемов 50 мМ Трис-HCl (рН 9,0) и повторяли стадии обработки ультразвуком и центрифугирования, как описано выше. К осадку добавляли 140 мкл раствора протеиназы К (10 мг/мл) и 1 мл ЛБ, затем инкубировали 10 минут при 56С. Раствор переносили в новые 1,5 мл пробирки по 600 мкл в каждую, и проводили фенольную депротеинизацию 600 мкл смеси фенол/хлороформ (1:1). Водную фазу переносили в новую 1,5 мл пробирку, добавляли 60 мкл З М ацетата натрия (рН 5,0), 30-40 мкг РНК-носителя и 600 мкл изопропанола. Пробирки помещали в передаточную камеру, где проводили обработку формалином и 30% перекисью водорода, и переносили в лабораторию 2-го уровня биобезопасности. Смесь инкубировали в течение 15 минут при -20С, и центрифугировали при 10000g в течение 15 минут, супернатант удаляли. Осадок промывали 1 мл 70%) этанола и растворяли в 600 мкл буфера ТЕ. Добавляли 600 мкл изопропанола, инкубировали в течение 15 минут при -20С, и центрифугировали при 18000g в течение 15 минут, супернатант удаляли. Осадок промывали 1 мл 70%) этанола, высушивали при 65С, и растворяли в 300 мкл 1 мМ Трис-HCl (рН 7,0). Раствор хранили при 4"С. 3.3. Олигонуклеотидные праймеры для ДПЦР Олигонуклеотидные праймеры были синтезированы на автоматическом синтезаторе «ABI-394» («Applied Biosystems», США) в Институте Химической Биологии и Фундаментальной Медицины СО РАН (Новосибирск). 3.3.1.
Олигонуклеотидные праймеры для получения музеев ампликонов и клонотек фрагментов ДНК ВНО Нуклеотидные последовательности 28 пар праймеров, их локализация на геноме ВНО для штамма Бангладеш-1975 (GenBank, номер доступа L22579) и соответствующие им расчетные длины амплификационных продуктов представлены в табл. 7. ДПЦР проводили с использованием набора «XL PCR Kit» («Applied Biosystems», США) в 50-75 мкл смеси в 0,2 мл тонкостенных микропробирках («Applied Biosystems», США). Каждая реакционная смесь содержала следующие компоненты: «XL PCR» буфер, dNTP (200 мкМ каждого), 1,2 мМ Mg(OAc)2, 4 е.а. полимеразы «rTth DNA Polymerase XL», 40 пкм каждого праймера и 50-100 нг матрицы ДНК ВНО. Реакции проводили с использованием технологии горячего старта в амплификаторе «GeneAmp PCR System 9700» («Applied Biosistems», США). Условия проведения ДПЦР для создания музеев ампликонов и клонотек фрагментов генома: предварительная денатурация - 1 минута при 94С; 16 циклов (15 секунд при 94С, 15 секунд при 62С, 15 минут при 68С); далее 16 циклов (15 секунд при 94С, 15 минут с добавочными 15 секундами на каждый цикл при 68С); заключительная стадия - 20 минут при 72С. Продукты амплификации хранили при 4С до проведения электрофоретического анализа. Анализ фрагментов проводили электрофорезом в 0,8% агарозном геле в буфере ТАЕ с бромистым этидием в концентрации 0,2 мкг/мл. Полученные ампликоны после обработки эндонуклеазами рестрикции очищали электрофорезом в 0,8% агарозном геле с последующим выделением ДНК с помощью набора QIAquick Gel Extraction («Qiagen», США) в соответствии с рекомендациями производителя. Условия проведения ДПЦР для получения фрагментов для последующего ПДРФ-ДПЦР анализа: предварительная денатурация - 1 минута при 94С; 15 циклов (15 секунд при 93С, 15 секунд при 58С, 15 минут при 68С); далее 15 циклов (15 секунд при 93С; 15 минут, с увеличением времени на 15 секунд в каждом цикле при 68С); заключительная стадия - 20 минут при 72С. Продукты амплификации хранили при 4С до проведения электрофоретического анализа. Анализ фрагментов проводили электрофорезом в 0,8% агарозном геле в буфере ТАЕ с бромистым этидием в концентрации 0,2 мкг/мл. 3.5. Получение рекомбинантных плазмид Векторную плазмиду pBluescript II SK+ для встройки определенных фрагментов ДНК ВНО переводили в линейную форму гидролизом соответствующими эндонуклеазами рестрикции.
Изучение вариабельности геномов разных штаммов ВНО при использовании ДПЦР-ПДРФ анализа
Последовательности 20 пар олигонуклеотидных праймеров, комплементарных консервативным районам вирусной ДНК рассчитали, используя выровненные нуклеотидные последовательности секвенированных ранее трех геномов ВНО (штаммы: Индия-1967, GenBank, №Х69198; Гарсия-1966, GenBank, №Y16780; Бангладеш-1975, GenBank, №L22579) при помощи компьютерной программы Oligo 6,0. Прямой (5 -3 ) праймер ампликона №19 и обратный (3 -5 ) праймер ампликона №20 (табл. 8, рис. 18) комплементарны консервативным районам, расположенным в непосредственной близости к концевым шпилькам ДНК ВНО (Fenner et al, 1989; Маренникова и Щелкунов, 1998). Была использована схема расположения праймеров, предложенная LeDuc et ей. (2002) (Центр по контролю и предотвращению заболеваний, Атланта, США), позволяющая получить в ДПЦР 20 перекрывающихся ампликонов, включающих в себя нуклеотидную последовательность полного генома ВНО (рис. 18). Использование общей схемы ДПЦР и ПДРФ позволяло сопоставить результаты анализа ДНК штаммов ВНО как Российской коллекции, так и коллекции США. 4.4.2. Получение ампликонов для ДПЦР-ПДРФ анализа Российской коллекции ДНК ВНО ДПЦР проводили при использовании 40 праймеров (табл. 8), как описано в разделе «Материалы и методы». Ампликоны, в совокупности охватывающие полный геном ВНО, предсказанной длины от 2,5 до 16 т.п.н. были получены, для каждого из 21-го изученного штамма ВНО (табл. 5, рис. 19). Ампликоны №19, 1 и 2 соответствуют левому вариабельному району генома, ампликоны с №3 по 12 расположены в центральном консервативном районе, а ампликоны №13-18 и 20 - в правом вариабельном районе генома ВНО. Из большого набора известных на сегодняшний день эндонуклеаз рестрикции класса II были выбраны ферменты Нра\\ и Bs/FNI. Данные эндонуклеазы рестрикции были использованы, так как их сайты узнавания представлены в геноме ВНО с частотой в среднем 1 сайт на 1200 п.н. Эти ферменты узнают специфические GC-богатые нуклеотидные последовательности двухцепочечной ДНК длиной 4 п.н. (CCGG - для Нра\\ и CGCG - для Bs/FNI эндонуклеазы рестрикции). Выполненный компьютерный анализ показал, что количество сайтов узнавания fovFNI варьирует между штаммами ВНО в большей степени по сравнению с Ира\\. Количество BstfNl-сайтов изменяется от 150 для штамма ВНО Бангладеш-1975 и 152 для штамма Индия-1967, до 161 у штамма Гарсия-1966. В то время как количество Hpall-camos изменяется лишь от 161 до 164 среди этих штаммов ВНО с известной последовательностью нуклеотидов генома. Были получены Hpall- и Ду М-гидролизаты всех 20 ампликонов для каждого из 21-го штамма ВНО. Продукты гидролиза всех ампликонов рестриктазами Hpall и ZkYFNI были разделены электрофорезом в градиентных 4-20% полиакриламидных гелях. Это позволило достоверно разделить фрагменты ДНК длиной от 30 п.н. до нескольких т.п.н. в геле длиной 8 см.
Пример одной из электрофореграмм приведен на рис. 21. Для подтверждения достоверности полученных результатов были проведены повторные ДПЦР-ПДРФ анализы как &7FNI-, так и ЯраІІ-гидролизатов отдельных ампликонов некоторых ДНК ВНО. Во всех случаях была показана полная воспроизводимость метода. Изображения гелей документировали с помощью цифровой камеры системы визуализации и сохраняли для последующей компьютерной обработки. Далее их помещали в компьютерную базу данных и с помощью программы BioNumerics выполняли ряд операций по обработке изображений гелей: коррекцию нарушений изображений гелей, возникших во время электрофореза; построение денситометрических кривых; выравнивание изображений гелей относительно маркерной системы; отнесение полос к определенным классам. В результате выполнения данной работы впервые создана ДПЦР-ПДРФ база данных набора штаммов ВНО из Российской коллекции, которая может быть использована как референс-система для генотипирования штаммов ВНО на основе анализа полного вирусного генома. 4.4.4. Филогенетический анализ ДПЦР-ПДРФ базы данных штаммов ВНО Российской коллекции Созданную базу данных, включающую AtfFNI- и ТфаИ-рестрикционные карты 20-ти ампликонов каждого из изученных 21 штамма ВНО, обработали с помощью компьютерной программы BioNumerics и сконструировали единую бинарную таблицу. На основе этой таблицы провели филогенетический анализ полученных результатов. Построили дендрограммы методом объединения ближайших соседей (Saitou and Nei, 1987). Сначала провели филогенетический анализ как Hpall-, так и, BstFNl-гидролизатов каждого из 20 ампликонов 21-го изучаемого штамма ВНО (рис. 22, 23). При изучении дендрограмм, построенных для каждого из 20 ампликонов после Hpall гидролиза, установили, что рестрикционные картины для амплификационных фрагментов №5, 6, 8, 17 совпадают для всех исследованных штаммов.
Наибольший полиморфизм наблюдается во фрагментах №1-3, 15, 19, 20, расположенных ближе к правому и левому вариабельным концам генома вируса натуральной оспы. Было обнаружено, что полиморфизм центральной консервативной части генома незначителен за исключением фрагментов №3 и 12.. Исследование дендрограмм, полученных для каждого из 20 ампликонов после ДуЛТМ-гидролиза, выявило сходную картину. Рестрикционные картины для амплификационных фрагментов №4, 5, и 14 были идентичны. Наибольший полиморфизм наблюдается во фрагментах №1-3, 15, 18-20, расположенных ближе к правому и левому концам генома, а центральная часть генома демонстрирует, как и для /#?а11-гидролизатов, небольшой полиморфизм. Сравнительный анализ дендрограмм для обоих ферментов рестрикции показал, что наибольшие отличия в центральной части генома представлены во фрагменте №3 и 12. Следует отметить, что в itoFNI-дендрограммах наблюдается больший полиморфизм, чем в /фаІІ-дендрограммах. Это согласуется с тем, что количество ifa/FNI-сайтов различается между штаммами в большей степени, чем в случае эндонуклеазы рестрикции Hpall. Затем построили дендрограммы методом объединения ближайших соседей при использовании коэффициентов подобия Жаккарда (Saitou and Nei, 1987) и провели перестановочный анализ статистической значимости дерева по 1000 реплик по данным ДПЦР-ПДРФ анализа ЯраІІ-гидролизатов (рис. 24) и /М-М-гидролизатов (рис. 25) всех ампликонов генома каждого штамма ВНО, а также рассчитали общее филогенетическое дерево для обоих гидролизатов (рис. 26). Сравнивая полученные дендрограммы (рис. 24-26), можно заключить, что они имеют общие черты. Так, дендрограммы имеют тенденцию к образованию трех групп штаммов ВНО: африканские, азиатские и штаммамы ВНО alastrim. Штаммы ВНО alastrim, для которых обнаружены наибольшие отличия от остальных штаммов ВНО, образуют общую группу с высокой надежностью на всех трех деревьях по результатам перестановочного анализа, при этом наибольшее сходство наблюдается между штаммами Brazil-128 и Butler. Для африканских штаммов ВНО выявлена высокая степень гомологии как между штаммами Congo-9 и Congo-2, так и между штаммами Helder и Rw-18 (рис. 24-26). Штаммы ВНО, выделенные от больных во время завозной вспышки натуральной оспы в Москве (табл. 5), объединяются с азиатскими штаммами во всех трех дендрограммах (рис. 24-26). Следует отметить, что на всех филогенетических деревьях азиатские штаммы, имеют тенденцию формировать две подгруппы (рис. 24-26): первая включает в себя штаммы M-Sur-60, M-N-60, Ind-3a, Wzim-Ahmed и Taj-Barin; вторая -штаммы M-Abr-60, M-Gavr-60, M-Bl-60, M-A-60 и Ind-4a.
