Содержание к диссертации
Введение
CLASS 1. Обзор литературы 1 CLASS 0
1.1 Общая характеристика флавивирусов 10
1.1.1 Общий план строения и трансляции генома флавивирусов 13
1.1.1.2 Структура генома 13
1.1.1.3 Репликация РНК 15
1.1.1.4 Трансляция и процессинг 16
1.1.1.5 Стратегия вирусного генома 19
1.1.2 Белки флавивирусов и их функции 20
1.1.2.1 Структурные белки флавивирусов 20
1.1.2.2 Неструктурные белки флавивирусов 25
1.2 Филогения различных изолятов вируса Западного Нила 34
1.3 Исследования ВЗН, проведенные в лаборатории Молекулярной генетики института Вирусологии РАМН 36
1.4 Этиология и эпидемиология 44
1.5 Клиника заболевания 52
1.6 Резервуар вируса среди позвоночных 53
1.7 Переносчики вирусной инфекции 54
1.8 Сохранение вирусной популяции в межэпизоотический период 58
1.9 Ареал распространения заболевания за рубежом 59
1.10 Ареал распространения заболевания в России и странах СНГ 61
2. Материалы и методы 64
2.1 Место сбора и объем полевого материала 64
2.2 Методы сбора, транспортировки, хранения и подготовки полевых материалов 67
2.3 Методы молекулярно-биологических исследований 67
2.3.1. Выделение тотальной РНК из осветленной клеточной или тканевой суспензии 67
2.3.2 Реакция обратной транскрипции 67
2.3.3 Проведение полимеразной цепной реакции 68
2.3.4. Электрофорез ДНК 70
2.3.5. Секвенирование ДНК 71
2.4 Компьютерная обработка данных 71
3. Собственные исследования 71
3.1.Определение полноразмерных нуклеотидных последовательностей геномов штаммов вируса ЗН LEIV-AstOO-986- human и LEIV-Vlg99-27889-human 71
3.2. Создание ОТ-ПЦР тест системы для обнаружения РНК вируса ЛЗН в клинических образцах и пробах полевого материала 77
3.3 Определение специфичности и чувствительности ОТ-ПЦР тест - системы, лабораторная модификация системы 78
3.4 Исследование комаров и клещей Астраханской области на наличие вируса ЗН при помощи ОТ-ПЦР системы 88
3.4.1. Анализ зараженности видового состава комаров 89
3.5. Нуклеотидный и филогенетический анализ 5'-концевой области генома вируса ЗН из полевых изолятов 93
3.6. Обсуждение 96
Выводы 98
- Филогения различных изолятов вируса Западного Нила
- Резервуар вируса среди позвоночных
- Методы молекулярно-биологических исследований
- Исследование комаров и клещей Астраханской области на наличие вируса ЗН при помощи ОТ-ПЦР системы
Введение к работе
Вирус ЗН принадлежит к семейству флавивирусов {Flaviviridae ) p. Flavivirus. Семейство флавивирусов ( Flaviviridae ) включает в себя ряд инфекционных вирусов, вызывающих опасные заболевания у человека и животных.
Актуальность проблемы. Эпидемические вспышки лихорадки Западного Нила (ЛЗН) различного масштаба и интенсивности регистрируются практически каждый год в странах Африки и Ближнего Востока, реже в Европе и Индии, иногда в Средней Азии (Львов, 2000; Murgue et al., 2002).
Обширная эпидемическая вспышка ЛЗН возникла в июле-октябре 1996 г. в Юго-Восточной Румынии в южном течении Дуная. Заболеваемость достигла 12,4 на 100 тыс. и охватила 7 областей, включая Бухарест.
Вспышки лихорадки Западного Нила описывались в Израиле в период с 1950 по 1970 гг., однако продолжающиеся по сей день серологические и эпидемиологические исследования показывают, что циркуляция вируса в этом регионе продолжается. (Hindiyeh, 2001)
Эпидемическая вспышка ЛЗН совершенно неожиданно возникла в конце июля-сентября 1999г. с пиком во второй половине августа в Нью-Йорке и его окрестностях. (Lancotti et al., 1999). В общей сложности выявлено 56 случаев (31 подтвержден лабораторно), из которых 7 с летальным исходом (12,5%). Вирус ЗН обнаружен в комарах Culex pipiens, отловленных в сентябре-октябре в Нью-Йорке, и округах Нассау и Суффолк, а с помощью ПЦР положительный результат получен с комарами Culex spp. и Aedes vexans, собранных в середине сентября в округе Хадсон, Нью Джерси. С помощью ПЦР положительные результаты получены при обследовании мозга погибших птиц из Нью-Йорка (Бронис, Бруклин, Манхэттен, Квинс, о.Статен, а также из округов Нассау,Оранж,Рокленд,Саратога,Суффолк и Вестчестер), в штате Нью-Джерси (12 округов), в штате Коннектикут (три округа). (Ebel, 2001) (Lanciotti, 2002)
Начиная с 1999 г. существенно обострилась эпидемическая ситуация по лихорадке Западного Нила на юге России (Lvov, 2004). Возникшие в последние 4 года на юге России вспышки лихорадки Западного Нила (ЛЗН), свидетельствуют о приоритетной значимости проблемы новых и возвращающихся инфекций в системе биобезопасности. (Львов, 2000).
В связи с широким распространением заболевания возникает необходимость исследования причин. Все это обусловило необходимость разработки программы комплексного изучения природных и синантропных очагов инфекции.
Инфекция ЛЗН относится к природно-очаговым зоонозам поскольку имеет выраженный очаговый характер (Львов и др., 1989). Природная циркуляция вируса ЗН в очаге происходит в системе «птицы - комары - птицы», при этом комары также эффективно заражают и других теплокровных, в том числе человека. Зараженность вирусом ЗН комаров является важным показателем активности природного очага и позволяет прогнозировать развитие эпидемической ситуации.
В связи с широким распространением заболевания возникает необходимость исследования причин. Все это обусловило необходимость разработки программы комплексного изучения природных и синантропных очагов инфекции.
Цель и задачи работы. Целью данной работы явилась разработка молекулярно-биологических подходов к обследованию полевых материалов и оценка эпидемической ситуации распространенности вируса ЗН в дельте Волги и Волго-Ахтубинской пойме
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи: Задачи:
Определение полноразмерной нуклеотидной последовательности штаммов LEIV-AstOO-986-human и LEIV-Vlg99-27889-human вируса ЗН, выделенных во время эпидемических вспышек 1999г. и 2000г., с целью использования этих данных при дизайне праймеров для ОТ-ПЦР диагностической тест-системы.
- Разработка ОТ-ПЦР системы для чувствительной и специфичной детекции РНК вируса ЗН в биологических образцах.
- С использованием разработанной ОТ-ПЦР системы исследовать пробы полевого материала (комары и клещи), собранные в местах вспышки ЛЗН (дельта Волги и Волго-Ахтубинская пойма в 2001-2004гг.), на наличие в них РНК вируса Западного Нила, определение процента зараженности переносчиков.
- Нуклеотидный анализ фрагментов геномов вируса ЗН из проб полевого материала. На основании полученных нуклеотидных последовательностей с целью проведения филогенетического анализа и определения генетических характеристик выделенных штаммов вируса ЗН, циркулирующих в популяциях переносчиков в период вспышек 2001-2004гг.
Положения, выносимые на защиту
- Полные нуклеотидные последовательности геномов штаммов вируса ЗН, полученных от человека LEIV-AstOO-986-human и LEIV- Vlg99-27889-human.
- Разработка и оптимизация ОТ-ПЦР тест-системы для обнаружения РНК вируса ЗН в полевых образцах.
- Определение общего и видового процента зараженности вирусом ЗН комаров и клещей, обитающих в дельте Волги
- Типирование штаммов ЗН, циркулировавших среди переносчиков в период вспышек 2001-2004г. с помощью филогенетического анализа фрагментов РНК.
Практическое значение.
В результате проведенной работы были определены полные нуклеотидные последовательности геномов двух штаммов вируса, выделенных на территории Астраханской и Волгоградской областей, предоставленных институтом вирусологии им. Д. И. Ивановского.
Созданная в процессе работы ОТ-ПЦР тест-система является высокочувствительной и достаточно проста в применении, что позволит использовать эту систему непосредственно в местах сбора полевого материала. Разработанная тест-система способна детектировать РНК вируса ЗН, относящиеся ко всем четырем филогенетическим группам. Таким образом это обеспечило максимально возможную, на данный момент, универсальность тест -системы. Разработанная тест - система «Способ обнаружения вируса лихорадки Западного Нила» защищена патентом РФ №2199589 от 27.02.2003. (авторы изобретения: Воронина А.Г., Прилипов А.Г., Львов Д.К., Самохвалов Е.И., Садыкова Г.К., Альховский СВ.,)
Впервые в России проведено масштабное исследование зараженности вирусом ЗН членистоногих переносчиков в природных очагах дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы с использованием ПНР. Всего обследовано 284308 комаров и 7303 клещей, собранных как в диких, так и в антропогенных биоценозах за 2001-2004гг. Согласно полученным результатам, средний уровень зараженности вирусом ЗН за 2001-2004гг. среди комаров - 0,028%, среди клещей - 0,74%. Также, в результате филогенетического анализа положительных ПЦР-фрагментов, были сделаны выводы относительно групповой принадлежности обнаруженных штаммов вируса ЗН. Нами было определено, что на обследуемой территории циркулировали 79 штаммов (91,86%) относящихся к 1-му генотипу, 4 штамма (4,65%) - ко II генотипу, ни одного к III, и 3 штамма (3,49%) относятся к IV генотипу.
Филогения различных изолятов вируса Западного Нила
Широкое распространение вируса ЗН практически по всем континентам поставило задачу типирования его различных географических вариантов. Первоначальные исследования, в которых использовались различные серологические методики, позволили выделить несколько обособленных групп вируса. Так, было показано, что африканский и индийский изоляты имеют разную кинетику торможения геммаглютинации (Hammam et al., 1966; Hammam and Price, 1965). Несколько групп вируса было выделено при анализе профилей рестрикции кДНК/РНК гетеродуплексов и изучении антигенных свойств штаммов с использованием моноклональных антител (Besselaar and Blackburn, 1988; Mathiot et al., 1990). На основании этих исследований штаммы вируса ЗН были разделены в две большие серогруппы: африканскую (топотипный штамм EglOl, выделенный в Египте) и индийскую (топотипный штамм 192266 из Юго-Восточной Индии). К африканской серогруппе относятся штаммы, выделенные в Северной, Восточой и Центральной Африке, Средней Азии, все штаммы выделенные в Европе. К этой же серогруппе относятся почти все изоляты из Южной Африки и с острова Мадагаскар. К индийской серогруппе относят штаммы изолированные в различных частях Индии, часть изолятов из Южной Африки и с острова Мадагаскар (Львов, 2000). Определение нуклеотидных последовательностей и анализ этих последовательностей генома различных изолятов позволило получить значительно более полную картину межштаммовых филогенетических отношений. Одной из первых подобных работ было исследование К. Porter с соавт. (Porter et al., 1993). В этой работе был проведен анализ части гена NS3 восьми различных изолятов вируса ЛЗН из разных стран, причем использовались изоляты как индийской, так и африканской групп. Дивергенция между изолятами составляла от 92% до 98%. Хотя авторы не обнаружили корреляции степени дивергенции от места, времени или источника выделения, изоляты были сгруппированы в три "категории" (Porter et al., 1993). В то же время, было показано, что нуклеотидная последовательность 3 -конца гена белка NS5 и части З -НТР прототипного штамма EglOl обнаруживает до 22% дивергенции от штаммов выделенных в Нигерии (Pierre et al., 1994). Основополагающей стала работа F. Berthera с соавт. (1997). Здесь, исследование строилось на анализе нуклеотидной последовательности части гена оболочечного белка Е (участок, кодирующий приблизительно от 150-ой по 250-ую а/к от N-конца белка). Выбор был продиктован высокой вариабельностью данного региона, ответственного за формирование ряда антигенных детерминант.
Кроме того, в этой области находится единственный для данного белка потенциальный сайт гликозилирования, который у некоторых штаммов может быть делетирован. В результате, изоляты (в работе использовался 21 штамм) были разделены в две группы, с дивергенцией между группами до 29% . Гомология между штаммами внутри групп составляла минимум 87%) для I группы и 80,5%) для П-ой. Важно отметить, что 1-ой группе были отнесены все штаммы из северной Африки и Европы, а также некоторыми изоляты из западной и центральной Африки. Во П-ую группу вместе с основной массой изолятов из западной и центральной Африки вошли все штаммы из восточной Африки и с острова Мадагаскар. Подобная классификация на основе сравнения небольшой части гена Е оказалась весьма удачной, и, как показали дальнейшие исследования, соответствует наиболее достоверному сравнительному анализу полноразмерных последовательностей генома. В последующих работах число штаммов вируса ЛЗН используемых для анализа значительно возросло и подобное разделение на две группы стало общепринятым. Важную роль сыграли работы J.Scherret (2001; 2002), в которых данные о филогенетических взаимоотношениях штаммов ВЗН были в значительной мере обобщены и структурированы. Помимо прочего, в этих работах было показано, что вирус Кунджин является австралийским субтипом вируса ЗН. К группе I относят штаммы, выделенные в США, Европе, Среднем Востоке, Центральной, Северной и Западной Африке. Отметим, что к этой группе отнесены штаммы, вызвавшие все крупные эпидемии последних лет в Израиле, Румынии, России и США. К этой же группе относят австралийские изоляты Кунджин и изоляты из Индии. Группа II включает в себя вирусы из Центральной, Восточной и Западной Африки и с острова Мадагаскар. (Berthtet et al.,1997; Burt et al., 2002; Lanciotti et al.,1999; Scherret et al., 2002;). Однако, отнесение индийских изолятов к первой группе не является бесспорным. 1.3 Исследования ВЛЗН, проведенные в лаборатории Молекулярной генетики института Вирусологии РАМН На момент проведения данной работы полноразмерные нуклеотидные последовательности были определены только для четырех изолятов вируса ЛЗН : Кунджин MRM61C (GenBank #D00246), WN-Wengler (GenBank #M 12294) и двух штаммов (HNY-99, NY99-flam) выделенных в 1999 г. в Нью-Йорке (табл.1) В связи с эпидемией лихорадки Западного Нила, неожиданно возникшей в летне-осенний период 1999 г в России, возникла насущная необходимость охарактеризовать штаммы вируса ЗН, вызвавшие данную вспышку заболевания и проанализировать причины возникновения этих событий. Таким образом, первой задачей исследований, произведенных в нашей лаборатории, явился подбор оптимальных праймеров для получения и амплификации кДНК фрагмента генома вируса ЗН, содержащего ген белка Е (рис.2). С этой целью было проведено сравнение полноразмерных нуклеотидных последовательностей ВЗН, опубликованных в базе данных DDBJ/EMBL/GenBank (табл.1), с использованием пакета компьютерных программ DNASTAR. В результате проведенных в нашей лаборатории исследований мы получили обширные данные о молекулярно-генетических характеристиках штаммов вируса ЗН.
В рамках настоящей работы из музея штаммов НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского были использованы ранее выделенные изоляты ВЗН. Eg 101 - Выделен в 1951 г. в Египте из крови больного человека. Ig 2266 - Выделен в 1958 г. в Индии из комаров Culex vishnui Нр-94 - Выделен в 1963 г. в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов из преимаго клещей Hyalomma margenatum (старое название H.plumbeum), собранных в Астраханской области. LEIV-Az67-1628rush - Выделен сотрудниками Института Вирусологии в 1967 г. в Азербайджане из проб органов черных дроздов. LEIV-Az67-1640-nathatch - Выделен сотрудниками Института Вирусологии в 1967 г. в Азербайджане из проб органов поползня. LEIV-Az70-72icks - Выделен в 1970 г. в Азербайджане из клещей Ornitodorus capensis Ast99-901-human - Выделен сотрудниками Института Вирусологии в 1999 г. из крови больного лихорадкой Западного Нила - жителя Астраханской области. Штамм получен на уровне 5-го пассажа. AstOO- 986-human - Выделен сотрудниками Института Вирусологии в 2000 г. из крови больного лихорадкой Западного Нила - жителя Астраханской области. Штамм передан на уровне 3-го пассажа. LEIV-Vlg99-27889-human - Выделен в 1999 г из ткани мозга умершего больного Волгоградской области. LEIV-VlgOO-27924-human- Выделен в 2000 г. из ткани мозга умершего больного Волгоградской области. LEIVaj77-1304ern - Выделен в 1977 г. в Таджикистане из проб органов малой крачки. LEIVur73-2914icks - Выделен в 1973 г. в Туркмении из клещей H.detritum LEIV-Ukr80-3266-rook - Выделен в 1980 г. в Львовской области из проб органов грача. LEIV-Krnd88-190icks - Выделен в 1988 г. в Новороссийске из клещей Dermacenter marginatus. На следующем этапе исследования были изучены полученые нуклеотидные последовательности и проведен на их основе филогенетический анализ (Рис.4). После того, как были определены нуклеотидные последовательности фрагментов кДНК генома LEIV-Vlg99-27889-human и LEIV-AstOO- 986-human, было проведено их сравнение как между собой, так и среди других штаммов ВЗН при помощи компьютерной программы DNASTAR. На основе данных филогенетического анализа было построено филогенетическое древо штаммов вируса Западного Нила, использовавшихся в нашем исследовании (см. рис. 3). Таким образом, благодаря использованию современных методов молекулярной биологии, определена и проанализирована нуклеотидная последовательность наиболее вариабельной области генома (области гена Е) более чем 35 штаммов вируса Западного Нила.
Резервуар вируса среди позвоночных
Основное значение в циркуляции вируса в природных очагах среди позвоночных животных имеют птицы. В различных частях ареала вирус многократно, в том числе и в нашей стране, изолирован от птиц, принадлежащих к различным видам, родам, семействам и отрядам птиц. В эксперименте установлены высокие титры виремии на протяжении 3-7 дней после подкожного заражения птиц. В ряде случаев развивается персистирующая инфекция, в процессе которой время от времени возникает виремия, титры которой достаточны для заражения комаров. При титрах 1,7 log /0,02 мл заражается около 10% комаров, а при титре 4,7 log /0,02 мл - до 93% . Антитела выявлены повсеместно в пределах ареала ЛЗН от 10 до 53%), а на северной границе ареала в Чехословакии в 1,4-9,7%). Особенно высокие показатели заражаемости выявлены у ворон, галок, горлиц, пустельги, уток, лысух, дроздов (Березин В.В.,1971). Млекопитающие не играют существенной роли в поддержании природных очагов ЛЗН. Об этом свидетельствуют данные их экспериментального заражения (69%). Однако среди лошадей выявлены эпизоотии, протекающие с явлениями энцефаломиелита во Франции и в Египте. Возникающие у млекопитающих уровни виремии недостаточны для заражения комаров. Это относится к домашним и диким животным. Исключение из этого правила редки. У Мадагаскарских лемуров при заражении мадагаскарскими штаммами ВЗН развивается виремия титрах, достаточных для заражения комаров. Среди африканских грызунов выявлена чувствительность только у видов рода Aethomys, а для видов родов Mystomys, Mastomys, Otomys, Arvicanthis, Rabdomys получены отрицательные результаты. У зараженных людей титры вируса в крови, как правило, недостаточны для заражения комаров, что исключает антропонозный цикл инфекции (Львов Д.К. 1995). 1.7. Переносчики вирусной инфекции. Передача вируса позвоночным осуществляется в основном орнитофильными видами комаров рода Culex, в Африке и Израиле основное значение принадлежит С. univittatus, что показано в полевых наблюдениях и при экспериментальном изучении. Экспериментально установлено большое значение внешних температур на скорость репродукции вируса в комарах. При заражении С. univittatus вирус накапливается в слюнных железах в количестве, достаточном для передачи через укус при 14 через 58 дней, при 18 через 22 дня и при 23,5-30 через 11-15 дней. В Израиле, в полевых условиях и в эксперименте, установлена эффективная передача вируса комарами C.pipiens molestus. Этот вид может иметь серьезное эпидемическое значение в городах, где он может развиваться в подвалах, причем кладки могут производить самки, не питавшиеся кровью. Вид очень агрессивен по отношению к человеку и одновременно обладает выраженной орнитофильностью (Savage Н. М.,1999).
В Индии основными переносчиками являются комары комплекса C.vishnul и С. Fetigans . Таким образом, основной цикл вируса в природе происходит между птицами и орнитофильными комарами рода Culex, которые также реализуют эффективное заражение домашних животных, прежде всего птиц, и человека. Птицы осуществляют межконтинентальную интродукцию вирусных популяций ВЗН. Наибольшая численность комаров рода Culex наблюдается в июле-августе. В этот же период происходит подъем заболеваемости среди людей, которому обычно предшествуют эпизостии среди диких, а затем домашних и синантропных птиц. Цикл отношений между вирусом и переносчиком складываются из четырех основных стадий: а. Наполнение кишечника зараженной кровью и инфицирование вирусом кишечного эпителия; Ь. Выход вируса, после репликации, из клеток эпителия в кровяное русло переносчика; с. Инфицирование слюнных желез переносчика; d. Секреция вируса со слюной при повторном питании на восприимчивом позвоночном хозяине. Основным фактором, детерминирующим способность комаров или клещей быть переносчиком того или иного вируса, является восприимчивость кишечного эпителия к инфицированию и, соответственно, первичной репликации вируса. Кроме того, необходимо отметить, что на трансмиссивную способность должны влиять и другие, менее заметные факторы. Такие как форма питания личинки или ко-инфекция с другими инфекционными агентами, например микрофилярией. В последнем случае возможны повреждения кишечно-эпителиального барьера и проникновение вируса, без первичной репликации, непосредственно в кровяное русло, а затем и в слюнные железы. Высвобождение вируса из слюнных желез в слюнную жидкость комаров происходит в процессе прокалывания тканей хозяина при питании. Ферменты, содержащиеся в слюне, играют большую роль в питании комаров, в частности предотвращая свертывание крови и образования микрогематом в месте укуса. При этом выделяемый вместе со слюной вирус распространяется по близлежащим тканям. Нужно учитывать, что выделение слюны происходит практически непрерывно в процессе питания, поэтому в месте укуса вирус накапливается в количествах превышающих его титр в слюне. В результате возникает первичная (вероятно незначительная) репликация вируса в месте инокуляции, откуда по лимфатическим каналам вирус проникает в региональные лимфатические узлы, откуда следует выход вируса в кровоток и развитие виремии.
В дельте Волги основное значение в циркуляции вируса в природных очагах имеет вид C.modestus, а в населенных пунктах C.p.pipiens, питающийся на диких, синантропных и домашних птицах, нападая и на человека. Основной цикл вируса ЗН в природе происходит между птицами и орнитофильными комарами рода Culex, которые также эффективно заражают домашних животных, птиц и человека. Наибольшая численость комаров рода Culex наблюдается в июле-августе. В этот же период происходит подъем заболеваемости среди людей, которому обычно предшествуют эпизоотии среди диких, а затем домашних и синантропных птиц (Львов,2000). В связи со всем вышеизложенным нужно заметить, что исследование членистоногих переносчиков (табл.2) инфекции представляет первоочередную задачу в условиях эпидемической вспышки. Этот этап исследований представляет большую сложность в связи с низким титром вируса в переносчиках и требует разработки высокочувствительной и специфичной тест-системы, позволяющей обнаруживать РНК вируса в комарах-переносчиках. 1.8. Сохранение вирусной популяции в межэпизоотический период. Комары рода Culex перезимовывают в фазе имаго. Вирус изолирован в зимнее время от напитавшихся осенью кровью самок. Сохранение вируса в зимующих комарах является одним из механизмов переживания вирусной популяции в межэпизоотическом периоде. Но основное значение в сохранении вирусной популяции в неблагоприятные для нее периоды (засушливый и зимний периоды) играют аргасовые и иксодовые клещи. Показано возникновение стойких очагов вируса за счет его адаптации к клещам Ornithodoros capensis (Львов и др., 1989) Их роль в сохранении вирусной популяции доказана многократно в полевых и в экспериментальных исследованиях. Показано возникновение стойких очагов вируса ЛЗН на юге России за счет адаптации вируса к клещам Ornithodoros coniropa обитающим в гнездовьях чаек и крачек в бассейне Каспийского моря. После окончания гнездового периода птицы разлетаются по руслам рек, разнося вирусную популяцию по речным долинам, где в циркуляцию включаются комары рода Culex, создавая предпосылки для развития эпизоотии и эпидемических вспышек (Березин 1971 ). Кроме этого, нужно отметить, что определенное значение в экологии ВЗН могут играть земноводные. В частности показано, что в неблагоприятные периоды вирусная популяция может сохраняться в лягушках (Львов и др., 1989) 1.9. Ареал распространения заболевания за рубежом. Ареал вируса охватывает практически весь африканский континент , Юго-Западную и Южную Азию , Южную Европу , включая и некоторые ее центральные части . Спорадическая заболеваемость и эпидемические вспышки регулярно происходят повсеместно на африканском континенте, особенно в ЮАР, из азиатских стран - в Израиле, Пакистане, Индии, а в европейских странах - во Франции, в Румынии. (Львов Д. К ,.1995).
Методы молекулярно-биологических исследований
К 200 мкл суспензии добавляли 200 мкл. лизирующего раствора (4 М гуанидин изотиоцианат, 0,5% саркозил, ЮОмМ меркаптоэтанол, 25мМ цитрат натрия), перемешивали на вортексе. Добавляли 200 мкл. насыщенного водой фенола, 100 мкл. хлороформа и 40 мкл. ацетата натрия (2М, рН4,5), вортексировали и инкубировали 20 мин. при 4С. Центрифугировали при 13000g 20 мин. Отбирали водную фазу и добавляли к ней равный объем изопропанола (400мкл). Инкубировали ночь при -20С. Преципитат осаждали центрифугированием (13000g 20 мин), осадок промывали 70 % этанолом и растворяли в 20 мкл. деионизированной воды. 2.3.2.Реакция обратной транскрипции Реакцию обратной транскрипции проводили в 0.5 мл пробирках для ПЦР, объём реакционной смеси составлял 5 мкл. В пробирку вносили 2,65 мкл РНК и денатурировали её при 70С в течении 1,5 мин на водяной бане и сразу же переносили в лед. В пробирку с денатурированной РНК добавляли 2,35 мкл "мастерской" смеси следующего состава: (приведены конечные концентрации реагентов) 50мМ Трис-HCl, рН 8.3, 3 мМ MgCl2, 75 мМ КС1, 10 мМ DTT, по 0.5 мМ каждого дНТФ, 25 пМ праймера #650R (GTGCACCAACAGTCGATGTCTTC), 6 ед. ингибитора РНКаз (Promega, США) и 50 ед. обратной транскриптазы M-MLV (Promega, США). Смесь инкубировали в течении 60 мин при 37С. Для инактивации обратной транскриптазы реакционную смесь прогревали 15 мин при 95С. 2.3.3 Проведение полимеразной цепной реакции. Полимеразную цепную реакцию в 2001-2002гг. проводили в объёме 25 мкл на амплификаторе «Терцик» фирмы ДНК-Технология "полу-гнездовым" методом. Состав ПЦР-смеси был следующий: 50 мМ КС1, 10 тМ Трис-HCl (рН 9.0 при 25С), 0.1% Triton Х-100, 1.5 mM MgCb, по 0.2 мМ каждого дНТФ, по 25 пМ прямого и обратного праймеров для первого раунда амплификации: #518R (TCGGTAGCATTTACCGTCATCAT) и #1F (AGTAGTTCGCCTGTGTGAGCTGA), и для второго раунда амплификации: #26F (AACTTAGTAGTGTTTGTGAGGA) и #518R (TCGGTAGCATTTACCGTCATCAT), 2,5 мкл комплементарной ДНК и 5 ед. Taq- полимеразы.
На реакционную смесь наслаивали минеральное масло и амплифицировали ДНК при следующих условиях: а) первый раунд амплификации: 94С/1 мин - 1 цикл, 94С/30 сек, 60С/30 сек, 72С/30 сек - 25 циклов, 72С/7мин - 1 цикл б) второй раунд амплификации: 94С/1 мин - 1 цикл, 94С/30 сек, 65С/30 сек, 72С/30 сек - 35 циклов, 72С/7мин - 1 цикл. Полимеразную цепную реакцию в 2003-2005гг. проводили в объёме 25 мкл на амплификаторе «Терцик» фирмы ДНК-Технология "гнездовым" методом (nested). Состав ПЦР-смеси был следующий: 50 мМ КС1, 10 тМ Трис-HCl (рН 9.0 при 25С), 0.1% Triton Х-100, 1.5 тМ MgCl2, по 0.2 мМ каждого дНТФ, по 25 пМ прямого и обратного праймеров для первого раунда амплификации: #518R (TCGGTAGCATTTACCGTCATCAT) и #1F (AGTAGTTCGCCTGTGTGAGCTGA), и для второго раунда амплификации: #26F (AACTTAGTAGTGTTTGTGAGGA) и #326R (GCTGTTTGTTTGTTCACACCTCTCCA), 2,5 мкл комплементарной ДНК и 5 ед. Taq- полимеразы. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло и амплифицировали ДНК при следующих условиях: а) первый раунд амплификации: 94 С/1 мин - 1 цикл, 94С/30 сек, 60С/30 сек, 72С/30 сек - 25 циклов, 72С/7мин - 1 цикл б) второй раунд амплификации: 94С/1 мин - 1 цикл, 94С/30 сек, 65С/30 сек, 72С/30 сек - 35 циклов, 72С/7мин - 1 цикл. Предложенный метод является высокочувствительным и высокоспецифичным к вирусу лихорадки Западного Нила и позволяет достоверно определять наличие РНК вируса в пробах крови больных, образцах секционного материала и в переносчиках арбовирусных инфекций. Электрофорез препаратов ДНК проводили в 1 - 2 % агарозном геле в трис - ацетатном буфере (ТАЕ) следующего состава: 0,04 М трис - ацетат, 0,002 М ЭДТА рН 8,0 в течении 1-2 часов при 100 В. Перед нанесением пробы на гель к ней добавляли 0,1 объем буфера для нанесения содержащего 50 % глицерина и 0,1 % бромфенолового синего. Для визуализации ДНК гель прокрашивали в течении 10-20 минут в растворе бромистого этидия (5 мкг/мл в ТАЕ). Учет результатов проводили в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм. Размер фрагментов ДНК определяли при сопоставлении электрофоретической подвижности продукта амплификации с фрагментами ДНК известной молекулярной массы. 2.3.5.Секвенирование ДНК. Секвенирование полученных ПЦР - фрагментов проводили на автоматическом секвенаторе фирмы "AppliedBioSystems" согласно инструкциям фирмы - изготовителя. 2.4. Компьютерная обработка данных Используемые для подбора праймеров и сравнения нуклеотидные последовательности изолятов вируса ЗН были получены в базе данных DDBJ/EMBL/GenBank. Нуклеотидные последовательности анализировали с использованием пакета программ "DNASTAR V 3.12", производства "Lasergen Inc."(Madison, WI). Подбор праймеров проводился с использованием программ "Megalign" и "Amplify". Сравнение нуклеотидных последовательностей и построение филогенетических деревьев проводили методом ClustalW с помощью программы "Megalign". Глава 3. Собственные исследования. 3.1. Определение полноразмерных нуклеотидных последовательностей геномов штаммов вируса ЗН LEIV-AstOO-986-human и LEIV-Vlg99-27889-human. Нами были определены полноразмерные нуклеотидные последовательности штаммов вируса ЗН LEIV-AstOO-986-human и LEiV-Vlg99-27889-human, выделенные во время эпидемических вспышек 1999г. и 2000г. в Волгоградской и Астраханской областях. Для проведения этих исследований необходимым условием явился подбор оптимальных праймеров для амплификации фрагментов генома вируса ЗН.
С этой целью было проведено сравнение полноразмерных нуклеотидных последовательностей штаммов вируса ЗН, опубликованных в базе данных DDBJ/EMBL/GenBank, с использованием пакета компьютерных программ DNASTAR. К началу нашего исследования полноразмерные нуклеотидные последовательности были известны только для четырех изолятов вируса ЗН : Кунджин MRM61C (GenBank #D00246), WN-Wengler (GenBank #M 12294) и двух штаммов HNY-99 (GenBank #AF260869), NY99-flam (GenBank #AF196835), выделенных в 1999 г. в Нью-Йорке. (Табл. 5) Также нужно отметить, что в базе данных не было опубликовано ни одного отечественного изолята. В результате проведенного анализа были определены участки нуклеотидной последовательности, которые соответствовали сформулированной задаче и отличались значительной степенью гомологии (до 100 %) среди всех четырех штаммов вируса ЗН. Выбранные консервативные участки в 3" области генома и в первой трети 5 конца использовали для конструирования праймеров. В результате были выбраны праймеры (3594R, 10960R), которые мы использовали для получения кДНК штаммов вируса ЗН при помощи обратной транскриптазы AMV. (Здесь и далее номерное обозначение праймера соответствует позиции его посадки на геноме вируса ЗН. Буквами R и F обозначаются праймеры обратной и прямой (соответственно) посадки). Полученные препараты кДНК хранили на -70С в отдельных аликвотах. Препараты кДНК использовали в реакциях ПЦР с экспериментальными праймерами, комплементарными наиболее консервативным областям генома вируса ЗН. Таким образом было получено 11 (для штамма LEIV-Vlg99-27889-human) и 9 (для штамма LEIV-AstOO-986-human) перекрывающихся фрагментов генома вируса ЗН, которые содержали полную нуклеотидную последовательность генома (Рис.6). На рисунке отражена стратегия определения полной нуклеотидной последовательности наших штаммов. В центре рисунка - схематичное расположение геномной вирусной РНК (11 kb). Стрелки указывают расположение на геноме праймеров для получения кДНК. В верхней части рисунка расположены фрагменты, полученные для штамма LEIV-AstOO-986-human, в нижней части рисунка расположены фрагменты, полученные для штамма LEIV-Vlg99-27889-human. Пунктиром изображены фрагменты, полученные при амплификации кДНК, синтезированной с праймера 3594R.
Исследование комаров и клещей Астраханской области на наличие вируса ЗН при помощи ОТ-ПЦР системы
Для 86 проб из 147, дававших положительный сигнал в ОТ-ПЦР, была определена частичная нуклеотидная последовательность. Сопоставление этих последовательностей с данными литературы позволило установить, что: во-первых: все положительные ПЦР - пробы содержали действительно фрагмент последовательности вируса ЗН и не являлись ложно-положительными результатами ПЦР-анализа; во-вторых: практически все последовательности хотя бы минимально отличались друг от друга, что указывает на их независимый первичный источник и отсутствие контаминации при проведении молекулярно-биологических манипуляций с материалом; В-третьих: впервые показано на пробах полевого материала (пулы комаров и клещей) возможность разработанной ранее ОТ-ПЦР тест-системы выявлять наличие РНК вариантов вируса ЗН, относящихся ко второй и четвертой группам. При обработке данных нуклеотидных последовательностей пакетом программ DNASTAR было установлено, что циркулирующий в дельте Волги и Волго-Ахтубинской пойме вирус ЗН относится к первому, второму и четвертому генотипам. При этом основная масса образцов была отнесена к I генотипу (91,86%), штаммы II и IV генотипов встречались значительно реже (4,65% и 3,49% соответственно), а также мы не обнаружили ни одного штамма вируса ЗН, относящегося к III генотипу. Возникшие в последние 4 года на юге России вспышки лихорадки Западного Нила (ЛЗН) свидетельствуют о приоритетной значимости проблемы новых и возвращающихся инфекций в системе биобезопасности (Львов, 2000). Данные по эндемичности территорий по ЛЗН в северной части Каспийского бассейна накапливались на протяжении около 40 лет (Чумаков и др., 1964; 1968; 1969, Бутенко и др., 1964; 1968; 1969). Однако эпидемическая вспышка, возникшая в 1999г. отличалась массивной заболеваемостью и высокой смертностью (Львов и др., 2000а; 2000в). На основании предшествующих исследований можно предположить, что основным природным очагом инфекции в России является дельта Волги. К началу эпидемии было известно о 3х генетических вариантах вируса: двух африканских и одном индийском. Сбор репрезентативного полевого материала в этом регионе и его последующей обработкой вирусологическими, серологическими и молекулярно-генетическими методами может дать объяснение возникшей здесь эпидемической вспышки с необычными параметрами.
Наравне с использованием патологоанатомических (Львов Д.К., Джаркенов А.Ф., и др. 2002.) , вирусологических и серологических методов исследования, широко применяются и молекулярно-генетические методы определения вирусной РНК в ОТ-ПЦР. Метод ОТ-ПЦР должен использоваться наряду с другими методами для изучения степени активности вируса ЛЗН в природных очагах. Кроме того, он позволяет выявлять генетические характеристики циркулирующих вирусных популяций. Настоящая работа посвящена молекулярно-генетической характеристике штаммов вируса Лихорадки Западного Нила, представленных в коллекции Института Вирусологии. Также проведено исследование зараженности членистоногих переносчиков ЛЗН (комаров), обитающих в данном регионе. 1. Первым этапом нашей работы стало определение полноразмерных нуклеотидных последовательностей двух различных штаммов вируса ЗН (LEIV-AstOO-986-human и LEIV-Vlg99-27889-human) из коллекции Института вирусологии им. Д. И. Ивановского. 2. В дальнейшем, исходя из результатов данной работы, была сконструирована ОТ-ПЦР система для детекции РНК вируса ЗН. Данная система была отлажена и успешно используется для детекции полевого материала (в том числе пулов комаров и клещей). 3. Другой важной частью нашей работы являлись исследования полевого материала при помощи сконструированной нами ОТ-ПЦР тест- системы. Задачей этого этапа исследования было установление процента зараженности членистоногих переносчиков дельты Волги и Волго-Ахтубинской поймы и филогенетическая характеристика циркулирующих здесь вариантов вируса ЗН посредством анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генома ВЗН в области 5"НТР. Полученные результаты свидетельствуют о высокой активности циркуляции вируса ЗН среди членистоногих, обитающих в этом регионе. Итого процент зараженности членистоногих переносчиков (комаров) за 2001 г. - 0,026%, за 2002 г. - 0,036%, за 2003 г. - 0,016%, а также за 2004 г. - 0,047%. Суммарный процент зараженности комаров за 2001-2004 гг. - 0,032%.
