Введение к работе
Вирус Гета (Getah virus), относящийся к роду Alfavirus семейства Togaviridae, был впервые выделен в Малайзии в 1955 г от комаров Culex gehdus Многочисленные штаммы были впоследствии изолированы в странах Азиатско-Тихоокеанского региона от комаров родов Culex, Anopheles и Aedes Антитела против вируса Гета часто обнаруживались у птиц и млекопитающих, в том числе у людей, в странах Азии и в Австралии (Львов с соавт., 1989, Tesh et al, 1976, Wekesaa et al, 2001) В России вирус был впервые изолирован на юге Дальнего Востока в 1972 г., антитела были обнаружены у населения Приморского края, Средней и Восточной Сибири (Чумаков с соавт, 1974) В 2000 г были опубликованы данные о распространении вируса Гета в различных, в том числе и крайних северных, граничащих с арктической тундрой, ландшафтных поясах Северо-Восточной Азии (Львов с соавт, 2000)
Представители антигенного комплекса Семлики, к которому относится и вирус Гета, распространены в Северо- и Юго-Восточной Азии, Австралии и Океании, Африке и Южной Америке Некоторые (например вирусы Чикунгунья, Росс-Ривер и О'Ньонг-Ньонг) способны вызывать обширные эпидемические вспышки среди людей, другие имеют значение в патологии домашних и диких животных Инфицирование человека альфавирусами из комплекса Семлики может протекать бессимптомно, либо в виде общелихорадочного заболевания (Гета, О'Ньонг-Ньонг), или сопровождаться лихорадкой, сьшью, артралгией (Росс-Ривер), геморрагическим синдромом (Чикунгунья) (Львов, 1994) Эти обстоятельства, а также экологическая связь вирусов антигенного комплекса Семлики с птицами, мигрирующими по восточно-азиатскому и, возможно индо-азиатскому руслу, определяют необходимость дальнейшего изучения роли вируса Гета в патологии человека и животных в Центральной, Восточной и Северо-Восточной Азии
Вирионы представляют собой сферические оболочечные частицы диаметром около 70 нм Геном представлен однонитевой РНК положительной полярности длиной ~11600 нуклеотидных оснований и имеет типичную
2 организацию генома альфавирусов. Альфавирусы, в том числе вирусы
Синдбис, Семлики и Сагияма, являющийся подтипом вируса Гета, активно
используются в качестве экспрессионных векторов, отличающихся высокой
продуктивностью (Yamaguchi et al, 2002) С этой точки зрения анализ генома
вновь изолированных штаммов вируса Гета представляет интерес в плане
поиска новых кандидатов для экспрессионных систем
Патогенез инфекции вируса Гета для позвоночных был описан в 1978 г, когда вирус был выделен во время вспышки заболевания, сопровождавшегося лихорадкой и характерной сыпью на различных участках тела у скаковых лошадей в Японии Также вирус способен вызывать эпизоотии среди свиней и поросят, у последних возможен летальный исход (Yago et al, 1987).
Вирусу Гета, как и другим представителям арбовирусных инфекций, присущ трансмиссивный путь передачи, вызываемое им заболевание относится к природно-очаговым зоонозам. При трансстадийной и трансовариальиой передаче членистоногие служат также резервуаром вируса в природных очагах и его постоянными хозяевами Хотя в экологии вируса Гета основную роль играют членистоногие переносчики, периодическое, кратковременное для существования вирусной популяции, включение в паразитарную систему 3-го члена - позвоночного, полезно для вирусной популяции, поскольку создает условия для обогащения ее генофонда (Львов с соавт , 1989)
Для диагностики заболевания и серологического мониторинга применяются различные вирусологические, серологические и молекулярно-биологические методы В целях исследования географического распространения различных штаммов вируса используется изоляция вируса из комаров путем внутримозгового заражения мышей-сосунков Быстрым, чувствительным и специфичным для детекции вируса является метод ОТ-ГЩР Геном вируса Гета полностью секвенирован, что облегчает подбор специфичных праймеров к различным участкам генома Анализ генома штаммов вируса Гета является достоверным источником данных об их филогенетических отношениях в плане географического распространения
з Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы является проведение молекулярно-
генетического анализа штаммов вируса Гета, циркулирующих на территории
Центральной, Восточной и Северо-Восточной Азии, а также определение и
анализ первичной структуры полного генома штаммов, наиболее характерных
для указанных регионов Для реализации этой цели были поставлены
следующие основные задачи
Провести определение первичной структуры участка геномной РБК штаммов вируса Гета из коллекции ГУ НИИ Вирусологии им Д И Ивановского, выделенных на территории России (Восточная Сибирь и Дальний Восток) и Монголии,
Разработать лабораторный вариант детекционной ОТ-ПЦР системы на основе анализа нуклеотидных последовательностей штаммов вируса Гета, депонированных в базе данных GenBank и исследованных штаммов,
3. Определить и проанализировать нуклеотидные последовательности полного генома штаммов LEIV 16275 Маг и LEIV 17741 MPR исследуемого вируса,
4 Провести филогенетический анализ штаммов вируса Гета, выделенных на территории России и Монголии, и остальных представителей комплекса Семлики по фрагменту геномной РНК, последовательности гена Е2, а также по полным геномам
Основные положения, выносимые на защиту.
1 Разработан и апробирован лабораторный вариант ОТ-ПЦР системы для детекции РНК вируса Гета в биологических образцах
2. На основе филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей участка геномной РНК (1627 но.) оценено генетическое разнообразие штаммов вируса Гета, изолированных в различных регионах Азии, выделены три обособленные генетические группы
3 Генетически охарактеризованы, на основе определенной нами первичной
структуры полного генома, первый российский (LEIV 16275 Маг) и монгольский (LEIV 17741 MPR) штаммы вируса Гета.
4 Сравнение результатов филогенетического анализа по гену Е2 и полным
геномам позволяет сделать заключение о правомерном использовании
последовательности гена Е2 для установления филогенетических
взаимоотношений штаммов в пределах антигенного комплекса Семлики
Научная новизна и практическая значимость,
В результате проделанной работы впервые в России была создана ОТ-ПЦР система для детекции вируса Гета в биологических образцах
В ходе выполнения настоящей работы было впервые проанализировано генетическое разнообразие штаммов вируса Гета, циркулировавших на территории Якутии, Магаданской области, Хабаровского края, Бурятии и Монголии, а также охарактеризованы пути заноса и распространения штаммов в Центральной, Восточной и Северо-Восточной Азии Показано наличие трех обособленных генетических групп штаммов вируса Гета, циркулирующих в различных ландшафтно-климатических зонах* тундре, лесотундре и северной тайге (1-я группа), в зоне степей и смешанных лесов (2-я группа), и исключительно в смешанных лесах (3-я группа)
Также в результате работы были впервые определены и проанализированы полные нуклеотидные последовательности штаммов вируса, выделенных на территории России и Монголии и характерных для соответствующих генетических групп (LEIV 16275 Маг и LEIV 17741 MPR) В результате филогенетического анализа последовательностей полного генома представителей антигенного комплекса Семлики и последовательностей гена поверхностного протеина Е2 сделан вывод о правомерном использовании последовательности гена Е2 для установления филогенетических взаимоотношений штаммов в пределах комплекса
Результаты исследования могут оказать содействие развитию системы экологического надзора, сопровождающегося систематическим обследованием
5 кровососущих членистоногих и позвоночных вирусологическими,
серологическими и молекулярно-биологическими методами, для определения
условий, предшествующих развитию эпизоотической ситуации, что даст
возможность принять специфические и неспецифические меры профилактики
Апробация работы.
Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела Молекулярной вирусологии, Экологии вирусов и Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ ГУ НИИ Вирусологии им Д И. Ивановского РАМН (13.09 07)
Объем и структура диссертации.
