Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. ортопоксвирусы: межвидовые и внутривидовые различия 15
1. Основы видовой дифференцировки ортопоксвирусов 15
2. Белооспинные мутанты ортопоксвирусов 20
3. Функциональная роль генов, расположенных в теломерных областях 23
3. 1 Молекулярные факторы вирулентности 23
3.1.1 Ингибиторы апоптоза инфицированных клеток 24
3.1.2 Ингибиторы воспалительных реакций 25
3.1.3 Ингибиторы действия интерферона 28
3.1.4 Модуляторы иммунного ответа 29
3.2 Гены круга хозяев 31
3.3 Семейство lfelch-белков... 32
4. Тельца включения типа А ортопоксвирусов 33
5. Внутривидовая вариабельность вируса оспы коров 36
6. Заключение по обзору литературы 39
Глава 2. Материалы и методы 42
1. Материалы 42
2. Методы 45
2.1. Очистка вируса и выделение вирусной ДНК 45
2.2. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции 45
2.3. Электроэлюция фрагментов ДНК из агарозного геля на ионообменную бумагу (диэтиламиноэтилцеллюлоза-81) 45
2.4. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля при помощи набора QIAquick фирмы «QIAGEN», Германия 45
2.5. Получение компетентных клеток. Трансформация Е.соїі 46
2.5.1. Приготовление компетентных клеток 46
2.5.2. Трансформация 46
2.6. Клонирование концевых фрагментов ВОК штамма GRI-90 46
2.7. Отбор клонов по гибридизации in situ 47
2.8. Выделение плазмидной ДНК 47
2.9.Секвенирование по методу Максама и Гилберта 48
2.9.1 Введение радиоактивного dNTP по З'-ОН концам фрагментов ДНК при помощи фрагмента Кленова ДНК полимеразы I E.coli.A%
2.9.2. Модификация азотистых оснований 48
2.9.3. Расщепление ДНК с помощью пиперидина 49
2.9.4. Электрофорез в денатурирующем ПААГ 49
2.10. Секвенирование на автоматическом секвенаторе 50
2.11, Компьютерная обработка расшифрованной последовательности геномной ДНК 50
Глава 3. Результаты и обсуждение 51
1. Создание и характеризация клонотеки фрагментов генома BOK-GRI.51
2. Секвенирование генома BOK-GRI 54
2.1. Секвенирование ДНК ВОК по методу Максама-Гилберта 54
2.2 Секвенирование ДНК ВОК на автоматическом анализаторе АВІ PRISM 310 56
3. Построение трансляционной карты генома 59
4. Сравнение геномов 61
4.1 Центральная область генома 96
4.2 Концевой инвертированный повтор (TIR) 97
4.3 Уникальная последовательность концевых видоспецифичных районов 102
4.3.1. Потенциальные гены круга хозяев 108
4.3.2. Семейство Kelch-белков 116
4.3.3. Молекулярные факторы вирулентности 119
4.3.4. Тела включения типа А... 132
Глава 4. Заключение 136
Выводы 139
Список использованной литературы 141
- Функциональная роль генов, расположенных в теломерных областях
- Внутривидовая вариабельность вируса оспы коров
- Электроэлюция фрагментов ДНК из агарозного геля на ионообменную бумагу (диэтиламиноэтилцеллюлоза-81)
- Секвенирование ДНК ВОК на автоматическом анализаторе АВІ PRISM 310
Введение к работе
27624 !
Актуальность темы. Существование природного резервуара ортопоксвирусов патогенных для человека, а также увеличение прослойки неиммунного к ортопоксвирусам населения, делает вероятным появление в природе эпидемически опасного для людей вируса, близкого к вирусу натуральной оспы по патогенности и контагиозности.
Выполненный ранее сравнительный анализ организации геномов вируса
натуральной оспы и вируса осповакцины позволил установить тот факт, что эти два
вируса обладают разными наборами генов, контролирующих свойства
патогенности и детерминирующих круг хозяев вируса. Было сделано предположение, что эти два вида ортопоксвирусов не могли произойти друг от друга, а независимо эволюционировали от общего предка.
Какой же из ныне существующих видов ортопоксвирусов наиболее близок к вирусу-предшественнику, и какими свойствами он должен обладать? По всей видимости, одним из таких свойств должен быть широкий круг хозяев среди диких животных, позволяющий вирусу длительно циркулировать в природе на большом ареале. Способность к длительной персистенции в организме хозяина будет также способствовать стабильному присутствию вируса в популяции чувствительных животных. Логично предположить, что вирус, имеющий наиболее протяженный геном, гораздо ближе расположен в эволюционном плане к вирусу-предшественнику. В полной мере всеми этими качествами обладает вирус оспы коров. Следовательно, несомненный научный интерес представляет определение нуклеотидной последовательности генома ВОК, исследование его генетической организации и установление эволюционных взаимосвязей между разными видами ортопоксвирусов.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было определение нуклеотидной последовательности ДНК вируса оспы коров штамм GRI-90, анализ организации его генома и сравнение с геномами других ортопоксвирусов. В ходе исследования решали следующие задачи:
получение библиотеки гибридных плазмид, несущих фрагменты генома ВОК штамм GRI-90, и ее характеризация; секвенирование вирусного генома;
получение карт потенциальных открытых рамок трансляции (ОРТ) геномных последовательностей ДНК;
выполнение компьютерного сравнительного анализа 5 полных ортопоксвирусных геномов (ВОК, штамм GRI-90, ВОК штамм Брайтон, ВЭ' штамм Москва, ВОВ штамм Копенгаген и ВНО штамм Индия); анализ взаимной гомологии генов и белков ортопоксвирусов разных видов; - выявление уникальных для ВОК генов и поиск по банку данных их функциональных аналогов.
Научная новизна и практическая ценность. Получена библиотека гибридных плазмид, несущих фрагменты генома ВОК штамм GRI-90 (BOK-GRI). Геном ВОК-GRI представлен в коллекции на 97.8% в виде клонированных фрагментов.
Определена полная нуклеотидная последовательность генома BOK-GRI. Последовательность нуклеотидов BOK-GRI аннотирована и сдана на хранение в
РОСцНАЦИОЛАЛЬНАЯ I БИБЛИОТЕКА /
Международный банк данных EMBL Data Library под регистрационным номером Х94355.
Впервые обнаружено, что вирус оспы коров обладает самым протяженным геномом и наиболее полным набором вирусных генов среди изученных ортопоксвирусов. На основании этих данных сделано предположение, что ВОК -наиболее древний среди изученных ортопоксвирусов, а такие виды как ВНО, ВЭ и ВОВ образовались в результате их независимой эволюции от общего ВОК-подобного вируса-прародителя.
Выявлена общая закономерность для всех видов ортопоксвирусов в отношении типа генов, разрушенных в процессе эволюции. Большинство делегированных или разрушенных генов BHO-IND, BOB-СОР и ВЭ-MOS принадлежат либо к генам анкирин-подобных белков, либо к kelch-тенам, либо к генам, продукты которых модулируют иммунный ответ инфицированного организма.
Обнаружено, что на фоне высокой внутривидовой гомологии штаммов ВОВ, ВНО и ВЭ внутривидовая гомология генов ВОК в концевых вариабельных областях генома невысока, что может указывать на большее внутривидовое разнообразие ВОК по сравнению с другими видами ортопоксвирусов.
Нуклеотидная последовательность генома BOK-GRI может быть использована для поиска специфичных для вируса оспы коров районов с целью разработки аналитичеких систем для диагностики ортопоксвирусов.
Коллекция плазмид со встроенными фрагментами генома BOK-GRI может быть использована для изучения биологических функций индивидуальных вирусных генов.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации вошли в 6 опубликованных статей и были представлены на международных конференциях: 11-th International Meeting on Poxviruses and Iridoviruses (Toledo, Spain 1996); 10-th International Congress of Virology (Jerusalem, Israel 1996); 5-th International Conference "AIDS, Cancer and Related Problems" (StPetersburg, Russia 1997); 12-th International Poxvirus Simposium (St. Thomas, USA 1998); 13-th International Poxvirus and Iridovjrus Symposium. (Montpellier, France. 2000).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста, включая 19 рисунков и 5 таблиц, и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащий 327 наименований.
Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично диссертантом в соавторстве с к.б.н. Рязанкиной О.И., д.б.н. Петровым НА., Гуторовым В.В., Тотмениным А.В. и Михеевым М.
Функциональная роль генов, расположенных в теломерных областях
Вирусы в процессе своей эволюции "освоили" различные молекулярные механизмы преодоления защитных реакций организма хозяина. Один из самых распространенных - уход от иммунного ответа с помощью изменения антигенных детерминант вирионных белков. Но в отличие от РНК-содержащих вирусов вирусы, чей геном представлен двухцепочечной ДНК, и, в частности, ортопоксвирусы лишены возможности быстрого накопления точечных мутаций в структурных белках, и потому незначительные изменения антигенных эпитопов не могут быть гарантией преодоления специфического иммунитета. Для эффективной циркуляции в природе вирус должен обладать системой защитных мер, позволяющих ему размножиться до уровня, обеспечивающего быструю передачу другому чувствительному хозяину. Для таких вирусов в первую очередь важна эффективная защита от ранних неспецифических реакций организма на инфекцию. Кроме того, развитие специфического иммунного ответа представляет собой сложную систему взаимодействия клеток иммунной системы между собой и множеством белковых факторов, так называемых цитокинов. Модуляция взаимодействий между компонентами этой системы может, если не предотвратить появление специфического иммунитета, то ослабить или замедлить его развитие. Эта временная отсрочка крайне благоприятна для вирусной репродукции и повышает шансы передачи вируса от больного животного здоровому. К аналогичным последствиям может привести подавление вирусными ингибиторами действия интерферона и ингибиторов апоптоза инфицированных клеток.
Одной из первых линий неспецифической защиты организма от инфицирующих агентов и, возможно, одной из самых древних является апоптоз - программируемая гибель клетки (Cohen etal., 1992; Williams and Smith, 1993; Уманский, 1996). Инфицирование клетки вирусом запускает сложную многофакторную систему апоптоза, которая приводит клетку к гибели и предотвращает тем самым размножение в ней вируса, а, следовательно, и инфицирование соседних клеток потомством этого вируса. Применительно к клеткам животных и человека апоптоз в большинстве случаев связан с протеолитическои активацией каскада каспаз - семейства эволюционно консервативных цистеиновых протеаз, которые специфически расщепляют белки после остатков аспарагиновой кислоты (Cohen, 1997). На правом конце генома ортопоксвирусов расположены два гена, кодирующие белки, относящиеся к семейству ингибиторов сериновых протеаз и названные SPI-1 и SPI-2. Белок SPI-2 является ингибитором клеточной протеазы ICE (interleukin-l(3 converting enzyme) (Ray et ai, 1992) и подавляет апоптоз клеток (Gagliardini et at, 1994). Белок SPI-1 идентичен SPI-2 на 47% и также оказался ингибитором апоптоза (Turner etal., 1995). На левом конце генома расположен ген (D4R у BHO-IND), кодирующий белок, отнесенный к быстро растущему семейству белков с так называемой последовательностью цинковых пальцев гена RING 1 человека. Это большое семейство включает в свой состав белки, участвующие в регуляции экспрессии генов, репарации и рекомбинации молекул ДНК, а также ингибировании апоптоза (Freemont et al., 1991; Lovering et al, 1993; Crook et al, 1993). Как было показано (Ruby et al, 1996) для ВЭ ген гомологичный D4R ВНО отвечает за ингибирование апоптоза, активируемого фактором некроза опухолей или лигандом для поверхностного антигена клеток CD40. Предполагают, что продукт гена D4R ВНО может конкурировать с сигнальными молекулами, которые связываются с цитоплазматическими доменами CD40 и рецептором фактора некроза опухолей после взаимодействия их внеклеточных доменов с лигандами и обусловливают передачу в ядро клетки специфичного сигнала, приводящего к индукции апоптоза. Двухцепочечные молекулы РНК, по-видимому, также могут быть одними из индукторов апоптоза. Этот вывод был сделан (Kibler et Ы.,1996) на основе изучения ВОВ, мутантного по гену E3L. Оказалось, что инактивация этого гена приводит не только к повышению чувствительности вируса к действию интерферона, но и к активации апоптоза инфицированных клеток.
Внутривидовая вариабельность вируса оспы коров
Сравнительное изучение свойств изолятов вируса оспы коров, полученных от различных носителей в разное время и в разных географических зонах, позволило выявить выраженную внутривидовую вариабельность вируса. Главным критерием отнесения изолята к этому виду было обязательное наличие 3 свойств: красные геморрагичные оспины на ХАО развивающихся куриных эмбрионов, тельца включения А-типа в инфицированных клетках и образование плотного геморрагического инфильтрата с центральным некрозом на коже кроликов. (Маренникова и Щелкунов, 1998; Fenner et at, 1989). В исслеодованиях Baxby (1975) с 18 штаммами вируса, выделенными от людей и коров в период с 1937 по 1971 гг., были обнаружены различия штаммов по нескольким фенотипичсским параметрам. Особенно демонстративными они были по показателям патогенности для мышей при интрацеребральном заражении: летальность при введении одной и той же дозы вируса колебалась для разных штаммов вируса от 0 до 100%. Марснниковой и соавторами (1975) были установлены различия штаммов по предельной температуре развития оспин на ХАО. Позже были выявлены существенные отличия штаммов и по их патогенности для белых и хлопковых крыс, особенно 3-5-дневиых белых крысят при интраназальном заражении, а также белых мышей (Шелухина, 1980). Внутривидовая вариабельность вируса оспы коров не исчерпывается только фенотипическими признаками. Baxby et aL, (1979) при сравнительном изучении изолятов от хищных семейства кошачьих и слонов обнаружили у них отсутствие полипептида 37 кДа, который имелся у референс-штамма вируса оспы коров Брайтон. В перекрестных опытах нейтрализации с теми же вирусами удалось выявить между ними определенные антигенные отличия. Как уже упоминалось выше, установлены различия между штаммами и при рестрикционном картировании фрагментов их ДНК.
Изоляты ВОК различались и по характеру внутриклеточных включений типа А: содержащие внутри многочисленные зрелые вирионы (V+), гомогенные без вирионов (V) и включения, где вирионы располагаются по его периферии (Vі) (Ichihashi and Matsumoto,1968; Baxby, 1975). Из II изученных по этому признаку вирусов шесть давали (V ) фенотип и лишь два фенотип (V+) (Маренникова и Щелкунов, 1998). У Baxby (1975), проводившего аналогичные исследования, большинство штаммов, выделенных от больных коров и заразившихся от них людей, формировало (У -включения (14 из 18). Возможно, в данном случае важен источник заражения, т.к. в предыдущем случае большая часть штаммов была выделена от грызунов и непосредственно от них заразившихся людей. При этом 2 штамма с фенотипом (V+) были выделены от людей, источник заражения которых остался невыявленным. Есть все основания полагать, что штаммы ВОК, имеющие фенотип (V) и (Vі), имеют меньшие шансы к длительной персистенции вируса в популяции чувствительных для него животных. Как уже отмечалось выше, три вирусных изолята, выделенные от грызунов, имеют протяженные делении в левой вариабельной области генома, где расположены такие жизненно важные для вируса гены как гены круга хозяев, буферные гены и гены, модулирующие специфические и неспецифические защитные реакции организма. Возможно, что утрата способности вируса давать (У+)-фенотип привела к селекции вируса с альтернативным механизмом его циркуляции в природе, как это произошло в свое время с вирусами, вообще не образующими телец включения А-типа, например с вирусом оспы обезьян. Повышение вирулентности вследствие разрушения буферных генов и адаптации вируса к защитным реакциям хозяина может быть таким потенциальным механизмом.
Как показали результаты исследования (Шелухина, 1980), большие песчанки и желтые суслики оказались высоковосприимчивыми к вирусу оспы коров штамм Турк-74, выделенному от дикоживущей песчанки. Это один из трех штаммов, упоминавшихся выше, с протяженной делецией в левой области генома и имеющих фенотип (V"). У больших песчанок при всех методах инфицирования, кроме накожного, развивалось острое заболевание, характеризующееся вялостью, истощением, в части случаев кашлем, одышкой и конъюнктивитом. Вирус можно было обнаружить в организме как выживших грызунов после исчезновения клинических симптомов, так и у оставшихся внешне здоровыми животных после заражения малыми дозами вируса. Спустя три недели вирус определялся в моче, через 5 недель после заражения (срок наблюдения) он был найден в ткани почек у части переболевших песчанок и желтых сусликов.
Следует отметить, что классический путь передачи оспы коров от больных коров человеку становится все большей редкостью даже в странах Западной Европы, где вспышки этой инфекции среди коров продолжают время от времени регистрироваться. Например, в Англии за 14 лет (1969-1983 гг.) из 16 случаев заболевания людей только 3 явились результатом контакта с больными коровами (Czerny et ah, 1991). От полного исчезновения отдельного вида вируса и популяции его основного хозяина спасает коэволюция противовирусных защитных механизмов животного и способов их преодоления вирусом. Попадание вируса к случайному хозяину может привести к серьезным последствиям. Так была обнаружена ранее неизвестная форма течения инфекции, вызванной вирусом оспы коров — легочная, которой болел ряд представителей семейства кошачьих. Легочная форма давала 100% летальность, причем животные умирали не позже 8 дня от начала заболевания (Маренниковой и др., 1975).
Электроэлюция фрагментов ДНК из агарозного геля на ионообменную бумагу (диэтиламиноэтилцеллюлоза-81)
Выделение проводили методом электроэлюции фрагментов ДНК на ионообменную бумагу (ДЭАЭ-81) в 0.02х ТБЕ буфере в течение 2 ч при напряжении 200В (Маниатис и соавт., 1988). Десорбцию фрагментов проводили раствором 1 М NaCl, содержащим 10 мМ ЭДТА, в течение 20 мин при 65С и центрифугировали для переноса элюента в пробирку. К вырезанной полосе агарозного геля, содержащей нужный фрагмент ДНК, добавляли трехкратный объем раствора QG для расплавления агарозы и помещали в термостат при 37С на 10 мин до полного растворения геля. Раствор наносили на сорбирующий слой колонки и центрифугировали при 9500 g 1 мин. Элюат удаляли и сорбирующий слой колонки промывали 750 мкл раствора, содержащего 1 ТЕ, 100 мМ NaCI и 80% этанола. ДНК-материал элюировали 40 мкл воды на 56С в течение 15 мин с последующим центрифугированием при 9500 g 2 мин. Несколько свежих колоний, выращенных на чашках Петри на агаризованной среде, засевали в 50 мл LB-бульона. Суспензию клеток инкубировали-при 37С до плотности D55o=0,8. Суспензию охлаждали во льду в течение 15 мин. Клетки осаждали центрифугированием при 1100 g в течение 15 мин. Супернатант тщательно удаляли.
Осадок ресуспендировали в 15 мл буфера RF-1 и инкубировали во льду в течение 15 мин. Клетки осаждали центрифугированием при 1100 g 15 мин. Супернатант тщательно удаляли. Ресуспендировали клетки в 3,5 мл буфера RF-2. Компетентные клетки размораживали во льду, добавляли 1 мкл раствора, содержащего плазмидную ДНК в концентрации около 0,5 мкг/мл, аккуратно перемешивали и инкубировали 15 мин во льду. Пробирки помещали в водяную баню с температурой 42С на 2,5 мин (тепловой шок), затем быстро охлаждали до 0С (во льду). В пробирки добавляли 350 мкл L-бульона, инкубировали в течение 1 ч при 37С. После этого клетки рассевали на чашках Петри. Клонирование концевого А/їиІ-фрагмента проводили следующим образом: АряІ-гидролизат вирусной ДНК денатурировали кипячением в течение 10 мин. и затем быстро охлаждали. При этом ренатурируют только концевые фрагменты, у которых цепи ДНК ковалентно связаны. Продукты ренатурации разделяли с помощью препаративного электрофореза в 0,6% агарозном геле. Концевой Крп\-фрагмент вырезали из геля и элюировали на диализную мембрану. Обработка фрагмента нуклеазой S1 в течение 2 мин. приводила к гидролизу одноцепочечных участков ДНК в районе концевой шпильки. Полученный препарат ДНК обрабатывали фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I Е. colt в присутствии всех четырех dNTP для "затупления" концов молекул ДНК, образованных после гидролиза S1, и после этого встраивали в состав векторной плазмиды pUC19, обработанной рестриктазой Smal.
Гибридизацию бактериальных клонов с меченными 33Р-зондами, а также фрагментов ДНК по методу Саузерна, осуществляли согласно (Маниатис и соавт., 1988). Индивидуальную колонию Е.соїі засевали в 5 мл L- бульона с соответствующими антибиотиками и растили ночь при 37 С. Осаждали клетки при 3000 g 2 мин. Осадок ресуспендировали в 200 мкл раствора I для выделения плазмидной ДНК. Добавляли 400 мкл раствора II для выделения плазмидной ДНК и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Добавляли 400 мкл раствора III для выделения плазмидной ДНК, встряхивали и инкубировали 30 мин на льду. Центрифугировали при 10 000 g 7 мин, супернатант осторожно отбирали и переносили в пробирку с 700 мкл изопропанола, встряхивали и центрифугировали при 10000 g 5 мин. Осадок растворяли в 50 мкл ТЕ, добавляли 50 мкл 5 М LiCI, инкубировали при -20 С в течение 20 мин, осаждали центрифугированием при 10 000 g 5 мин. К супернатанту добавляли 600 мкл изопропанола, осаждали центрифугированием при 10 000 g 5 мин. Осадок промывали этанолом, высушивали, растворяли в 200 мкл ТЕ.
Секвенирование ДНК ВОК на автоматическом анализаторе АВІ PRISM 310
Отсутствующий в кл о потеке район, а также центральную консервативную область 52283-137930 п.н, (85647 п.н.) секвенировали на автоматическом анализаторе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer ("РЕ Applied Biosystems", США). Секвенирование этих районов проводили на длинных ПЦР-фрагментах, предварительно полученных на геномной ДНК BOK-GRI и элюированных из агарозного геля. Первый этап состоял в расчете праймеров для длинного ПЦР. Праймеры расчитывали таким образом, чтобы соседние ГГЦР-фрагмснты перекрывались между собой в среднем на 1 т.п.н. Расчет праймеров проводили при помощи программы "Oligo" 6.31, используя в качестве расчетной матрицы нуклеотидную последовательность гомологичных областей BOB-СОР и BHO-IND. Длина праймеров составляла 30-40 нуклеотидов, а температуру отжига праймеров подбирали приблизительно одинаковой как для прямого, так и для обратного праймера в диапазоне 60-62С. В результате этой работы секвенируемая область была разбита на 9 районов, средняя длина которых состовляла 11 т.п.н. Амплификацию проводили в соответствии с указаниями фирмы производителя набора Gene Amp XL PCR Kit для получения длинных ПЦР-фрагментов (РЕ Applied Biosystems). Полученные ПЦР-фрагменты очищали электрофорезом в 1% агарозном геле с последующей элюцией фрагментов ДНК из геля с помощью наборов фирмы «QIAGEN» (Германия). Для секвенирования этих фрагментов расчитывали набор праймеров индивидуальный для каждого фрагмента.
Расчет проводили при помощи программы "01igo"6.31, используя в качестве расчетной матрицы нуклеотидную последовательность гомологичных областей ВОВ-СОР и BHO-IND. Длина праймеров составляла в среднем 25 нуклеотидов, а температура отжига лежала в диапазоне 49.5-51 С. Положения соседних праймеров как на плюс, так и на минус цепи ДНК секве пируем ого фрагмента были разнесены друг от друга в среднем на 300 н.п. Секвенирование ПЦР-фрагментов проводили с использованием набора BigDye TCSK ("Qiagen GmbH", Германия) на автоматическом анализаторе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer ("РЕ Applied Biosystems", США) в соответствии с указаниями фирмы производителя. Данные о нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК генома вируса BOK-GRI, полученные в результате секвенирования на автоматическом анализаторе Genetic Analyzer и секвенирования по методу Максама-Гилберта, были объединены с помощью программы ALIGNMENT SERVICE в единую непрерывную последовательность ДНК. Эта последовательность представляет собой полную нуклеотидную последовательность ДНК генома BOK-GRI, за исключением 30-35 нуклеотидов в районе концевых шпилек (рис. 3) . Эти районы были утрачены после обработки концевых фрагментов S1 нуклеазои и последующей достройки одноцепочечных районов ДНК-полимеразой I Е. coli (см. Материалы и методы). Длина расшифрованной геномной ДНК BOK-GRI составила 223666 пар нуклеотидов (п.н.). Компьютерный анализ геномной последовательности ДНК позволил выявить 2 потенциальных неперекрывающихся открытых рамок трансляции (ОРТ) размером от 60 аминокислотных остатков (ак) и более. Кодирующая область генома составила 220881 п.н. Вирусные ОРТ обозначали исходя из буквенного названия соответствующего Hindltt- фрагмента генома, в котором ОРТ инициируется или находится целиком. ОРТ BOK-GRI нумеровали в каждом фрагменте по порядку - слева направо. Буквами L (left) или R (right) обозначали соответственно направление ОРТ - справа налево или слева направо (рис. 4). Была составлена аннотация, содержащая последовательность нуклеотидов BOK-GRI, названия и координаты инициирующего и терминирующего код она каждой из 211 ОРТ, а также их аминокислотные последовательности, полученные с помощью компьютерного анализа. Файл, содержащий эту аннотацию, был отправлен в Международный банк данных EMBL Data Library на хранение и ему был присвоен регистрационный номер Х94355.
