Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Молекулярно-биологическая организация ортопоксвирусов 9
1.2. Организация генома ортопоксвирусов 12
1.3. Гены круга хозяев 17
1.4. Молекулярные факторы вирулентности ортопоксвирусов 19
1.5. Структурные перестройки в геномах ортопоксвирусов 22
1.6. Модели возникновения дупликаций, транспозиций и делений концевых последовательностей 29
1.7. Гомологичная рекомбинация. 31
2. Материалы и методы 33
2.1. Материалы 33
2.2. Выделение и анализ плазмидной ДНК 35
2.3. Получение компетентных клеток E.coli 36
2.4. Трансформация компетентных клеток E.coli 37
2.5. Получение геномных библиотек в космидном векторе 37
2.6. Компьютерный анализ данных секвенирования 38
3. Результаты и обсуждение 39
3.1. Создание плазмидных и космидных клонотек фрагментов ДНК ВНО тамма Индия-1967. 39
3.1.1. Получение и характеризация коллекций гибридных плазмид, содержащих НіпйШ- и ^Yftol-фрагменты ДНК ВНО штамма Индия-1967 39
3.1.2. Получение и характеризация библиотеки космид, содержащих «dill-фрагменты ДНК ВНО штамма Индия-1967 48
3.1.3. Использование полученных клонотек фрагментов ДНК ВНО-ИНД для секвенирования полной кодирующей последовательности генома данного вируса 53
3.2. Получение и характеризация коллекции гибридных плазмид, содержащих >А7ю1-фрагменты генома ВНО штамма Гарсия-1966 54
3.3. Создание международного репозитория гибридных плазмид, содержащих фрагменты ДНК ВНО 58
3.4. Организация генома вируса variola major ВНО-ИНД 61
3.5. Сравнение геномов вирусов ВНО major и ВОВ 66
3.6. Организация генома штамма Гарсия-1966 ВНО minor alastrim 72
3.7. Сравнение геномов вирусов ВНО и вируса оспы верблюдов 79
3.8. Сравнение организации молекулярных факторов вирулентности ВНО,ВОВиВОВБ 83
3.9. Интегральная схема преодоления вирусом натуральной оспы защитных барьеров организма 101
3.10. Молекулярная эволюция ортошжсвирусов 106
3.10.1. Различия в нуклеотидных последовательностях ДНК вирусов натуральной оспы и осповакцины 106
3.10.2. Механизмы рекомбинационных перестроек ортопоксвирусных ДНК 129
4. Выводы 134
5. Приложение 1 135
6. Список литературы 178
- Молекулярные факторы вирулентности ортопоксвирусов
- Модели возникновения дупликаций, транспозиций и делений концевых последовательностей
- Получение и характеризация коллекции гибридных плазмид, содержащих >А7ю1-фрагменты генома ВНО штамма Гарсия-1966
- Интегральная схема преодоления вирусом натуральной оспы защитных барьеров организма
Введение к работе
Актуальность проблемы. В 1980г. Всемирная Ассамблея Здравоохранения известила мир о ликвидации оспы на земном шаре. Это достижение явилось результатом осуществлявшейся Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) и продолжавшейся свыше 20 лет беспримерной международной программы. Завершающим шагом этой программы предполагалось уничтожение хранящихся в двух лабораториях мира (Сотрудничающие центры ВОЗ по ортопоксвирусам Российской Федерации и США) штаммов вируса натуральной оспы (ВНО). Однако, в целях сохранения информации об этом уникальном вирусе ВОЗ сочла необходимым предварительно осуществить исследования по расшифровке структуры его генома.
До начала этих исследований не существовало научно обоснованных заключений об эволюционном происхождении и взаимосвязях ортопоксвирусов, патогенных для человека. Отсутствовала информация о молекулярных факторах патогенности ВНО. Большинство исследований в этом направлении были выполнены на вирусе осповакцины (ВОВ).
Наиболее прямым подходом к решению стоящих вопросов является секвенирование и сравнительный компьютерный анализ организации геномов ВНО и ВОВ.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования было создание и характеризация клонотек фрагментов ДНК высоко- и низковирулентного штаммов вируса натуральной оспы и выполнение работы по секвенированию и компьютерному анализу организации вирусных генов и их белковых продуктов.
В процессе работы решались следующие задачи:
-
Получение представительных клонотек фрагментов генома вируса натуральной оспы штаммов Индия-1967 (ВНО-ИНД) и Гарсия-1966 (ВНО-ГАР) в плазмидных и космидных векторах. Надежная консервация полученного банка клонов фрагментов ДНК двух изученных штаммов вируса натуральной оспы в составе Международного репозитория ДНК ВНО.
-
Проведение секвенирования полных последовательностей нуклеотидов геномов ВНО-ИНД и ВНО-ГАР.
-
Построение полных генетических карт геномов двух изученных штаммов ВНО.
-
Осуществление подробного сравнительного анализа структурно-функциональной организации изучаемых геномов вируса натуральной оспы и вируса осповакцины штаммов Копенгаген (ВОВ-КОП) и Вестерн Резерв (BOB-WR).
-
Выполнение детального сравнительного анализа внутривидовых и межвидовых структурных перестроек ДНК ортопоксвирусов и выявление эволюционных взаимосвязей ВНО и ВОВ.
Научная новизна и практическая значимость работы. Получена представительная библиотека гибридных плазмид и космид, несущих фрагменты генома ВНО-ИНД и ВНО-ГАР. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генома высоковирулентного (ВНО-ИНД) и низковирулентного (ВНО-ГАР) штаммов вируса натуральной оспы. Осуществлен подробный анализ организации геномов ВНО-ИНД и ВНО-ГАР и сравнение их с геномами вирусов осповакцины и оспы верблюдов. Выявлены потенциальные гены вирулентности ВНО. Выполнен детальный сравнительный анализ внутривидовых и межвидовых структурных перестроек ДНК ортопоксвирусов и сформулирована модель их возникновения. Впервые на основании анализа спектра коротких делеций в геноме
1 І РОС.,,ИАиИО»1ЛЛЬМЛЯ I
( БИБЛИОТЕКА {
СПетербург л а У
» 03 J0O
относительно ВОВ сделан вывод об их видоспецифичности и независимом эволюционном происхождении ВНО и ВОВ от общего прародителя. Проведена надежная консервация полученных клонотек фрагментов ДНК двух изученных штаммов вируса натуральной оспы в составе Международного репозитория ДНК ВНО, что дает возможность использовать их в последующих научных исследованиях.
Публикации и апробация работы. По материалы диссертации опубликованы 17 статей в реферируемых изданиях. Результаты работы были представлены на международных конференциях: 9-th International Conference on Poxviruses and Iridovi-ruses (Les Diablerets, Switzerland, 1992), 9th International Congress ofVirology (Glasgow, Scotland, 1993), 10th International Conference on Poxviruses and Iridoviruses (Banff, Alberta, Canada, 1994), 11th International Meeting on Poxviruses and Iridoviruses (Toledo, Spain, 1996), 12th International Poxvirus Simposium (St. Thomas, USA, 1998), International Conference on Bacterial and Viral Virulence Factors (Smolenice, Slovakia, 2000), 13th International Poxvirus andlridovirus Symposium (Montpellier, France, 2000)
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, раздела "Результаты и обсуждение", выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 216 страницах, содержит 26 рисунков, 5 таблиц и два приложения. Библиография включает 340 литературных источников.
Вклад автора. Создание и характеризация клонотек фрагментов геномной ДНК штаммов Индия-1967 и Гарсия-1966 ВНО, компьютерный анализ организации генома штамма Гарсия-1966 ВНО, анализ структурных' перестроек в нуклеотидных последовательностях ДНК вирусов натуральной оспы и осповакцины выполнены лично автором; анализ организации генома штамма. Индия-1967 ВНО выполнен автором совместно с В.М. Блиновым и сотрудниками лаборатории теоретической биологии и вирусологии. ГНЦ ВБ «Вектор»; секвенирование ДНК вирусов натуральной оспы выполнено сотрудниками отдела молекулярной биологии геномов и отдела молекулярной вирусологии ГНЦ ВБ «Вектор» при участии автора.
Молекулярные факторы вирулентности ортопоксвирусов
Поксвирусы, как указывалось выше, являются сложно организованными цитоплазматическими вирусами (раздЛ.1), с протяженным геномом, состоящим из двухцепочечнои ДНК, способным кодировать приблизительно 200 полипептидов (Goebel et al.y 1990). В процессе эволюции поксвирусы приобрели большое количество генов, кодирующих белки, способные нейтрализовать или модулировать ответ инфицированного организма на инфекцию (Smith, 1993). Большинство этих белков опосредуют неспецифические иммунные механизмы, такие как систему комплемента, интерфероны (IFNs) и воспалительные реакции, которые способны быстро индуцироваться и представляют собой первый ответ организма хозяина на инфекцию. Многие из этих поксвирусных белков имеют значительную структурную гомологию с иммунными факторами хозяина, что указывает на то, что поксвирусы "позаимствовали" в процессе своей эволюции и модифицировали гены хозяйского организма с целью подавить активность ключевых иммуномодуляторов.
Хотя и другие вирусы обладают разнообразными защитными системами, репертуар многочисленных иммуномодуляторных белков, имеющих гомологов в организме хозяина, демонстрируемый поксвирусами является беспрецедентным. Возможным объяснением этому является особенности инфекционного цикла поксвирусов. Для некоторых других вирусов характерен, в частности, латентный способ инфицирования, который позволяет уклониться от ответа иммунной системы хозяина и персистировать в организме в течение длительного периода времени. Напротив, цикл развития поксвирусов заканчивается лизисом клетки, что характерно для цитолитической инфекции, и таким образом их репликация происходит в условиях активизации иммунной системы хозяина, и поэтому требует более изощренных способов преодоления защитных систем организма.
Цитокины регулируют воспалительные и иммунные реакции и могут индуцировать устойчивый к инфицированию вирусом статус клетки (например, посредством синтеза различных интерферонов) или приводить к уничтожению инфицированной вирусом клетки (посредством, к примеру, фактора некроза опухолей - TNF). Следовательно, цитокины являются хорошей мишенью для иммуномодуляторных систем поксвирусов. Некоторые поксвирусные гены кодируют белки-гомологи внеклеточного связывающего домена клеточных цитокиновых рецепторов, у которых отсутствует трансмембранный и цитоплазматический домены их клеточного аналога. Эти белки секретируются, связывают соответствующий цитокин и влияют на его активность, препятствуя взаимодействию с клеточными рецепторами.
Другие вирусы также обладают системами подавления активности цитокинов. Герпесвирусы кодируют рецепторы хемокинов, которые являются мощными хемоаттрактантами клеток иммунной системы. В отличие от растворимых рецепторов ортопоквирусов, эти рецепторы хемокинов расположены на поверхности инфицированной клетки и, по-видимому, действуют по другому механизму (Ahuja et aL, 1994). Аналогичный ген, кодирующий хемокиновый рецептор, был обнаружен в геноме вируса оспы свиней (Massung et о/,, 1993). Вирус Эпштейна-Барра кодирует гомолог цитокина хозяина — интерлейкина-10 (IL-10), подавляющего различные стадии клеточного иммунного ответа (Hsu et al., 1990). Аденовирусы подавляют активность цитокинов подобных TNF посредством внутриклеточных белков, которые не обладают какой-либо гомологией с последовательностями известных клеточных факторов (Wold et ai., 1994).
Тот факт, что поксвирусы кодируют растворимые рецепторы цитокинов, таких как TNF, TL-IB, TFN-y и IFN-a/B, подчеркивает важность этих цитокинов в обеспечении иммунного ответа. Это также подтверждается существованием у поксвирусов дополнительных внутриклеточных систем подавления опосредованного IFN клеточного ответа и процесса синтеза и созревания IL-1B. Таким образом, изучение и характеризация цитокиновых рецепторов поксвирусов могут внести существенный вклад в понимание механизмов действия клеточных цитокинов и, более того, общих закономерностей функционирования иммунной системы в целом.
Модели возникновения дупликаций, транспозиций и делений концевых последовательностей
Исследование большого числа различных представителей ортопоксвирусов позволило выдвинуть концепцию строения вирусного генома, в соответствии с которой имеется общее "ядро" высоко консервативных генов в центре генома и высоковариабельные концы. Были предложены различные модели механизма возникновения наблюдаемых перестроек генома типа делеций/дупликаций. Так, выше было отмечено, что гомологичная рекомбинация между прямыми повторами в концевых районах генома может приводить к увеличению или уменьшению числа повторяющихся элементов. Два других основных механизма, которые необходимо учитывать, включают негомологичную рекомбинацию и взаимодействие между концами генома в процессе репликации. Анализ нуклеотидных последовательностей четырех вирусных вариантов, несущих делеции/душшкации, и их сравнение с не подвергшимися перестройкам последовательностями исходных вирусов (Pickup et ai, 1984) не обнаружил каких-либо областей, где могла бы произойти гомологичная рекомбинация. Простые делении могут возникать в результате негомологичной реципрокной рекомбинации между двумя правыми концами генома, ориентированными в одном направлении, но со сдвигом. Рекомбинация между правыми и левыми концами генома, ориентированных в разных направлениях, приводит к возникновению вариантов с делеци ям и/дупликациям и (Pickup et ah, 1984). Другая модель основывается на механизме нереципрокной рекомбинации, при которой происходит перенос генетического материала с одного конца на другой по типу генной конверсии (Pickup et at, 1984). Наконец, делеции в конкатамерных промежуточных продуктах репликации, ориентированных голова-к-голове или конец-к-концу, происходящие перед разрезанием генома и упаковкой, могли бы приводить к делециям и дупликациям генома зрелого вируса (Moyer and Graves, 1981). При определенных условиях некоторые гены могут выборочно амплифицироваться в ответ на изменения окружающей среды.
Примером является геи рибонуклсотидредуктазы ВОВ. Фермент рибонуклеотидредуктаза (RR), который был впервые описан в 1984 г. (Slabaugh et at,y 1984; Slabaugh and Mathews, 1984), состоит из двух субъединиц. Большая субъединица картируется в ЯшДНЫ-фрагменте в центральной части генома BOB (Tengel sen et а!., 1988), тогда как меньшая была картирована на левом конце генома в ///«dIII-F-фрагменте на границе последовательностей, случайным образом делегируемых у мутантов круга хозяев (Slabaugh et д/., 1988). Весьма вероятно, что по крайней мере меньшая из двух субъединиц не требуется для роста вируса в культуре клеток (Perkus et al., 1986; Slabaugh et al.t 1988). В вирусных мутантах, которые стали устойчивыми к гидроксимочевине, анализ последовательности выявил избирательную амплификацию (2-15 копий) гена меньшей субъединицы RR, причем копии были организованы в прямые тандемные повторы (Slabaugh et а/., 1988). Амплификация затронула только ген меньшей из двух субъединиц, что находилось в соответствии с данными, полученными для мутантов культивируемых клеточных культур. Механизмы такой селективной амплификации не известны (Slabaugh et al.t 1988). Подобные изменения структуры были также отмечены для Itkl-штамма ВОВ, сконструированного Ball (1987), у которого ТК-ген фланкирован прямыми повторами последовательностей ДНК фага X. В инфицированных поксвирусами клетках наблюдается высокий уровень рекомбинации (Fenner, Comben, 1958). Рекомбинация между концевыми последовательностями генома ортопоксвирусов может объяснить вариации в числе тандемных повторов (Moss et al., 1981), транслокации ДНК вирусов оспы кроликов (Моуег et дг/., 1980), оспы коров (Archard et al,y 1984; Pickup et al.y 1984), оспы обезьян (Esposito et cr/., 1981) и осповакцины (Kotwal, Moss, 1988b), а также так называемые зеркальные делеции (McFadden and Dales, 1979). Вирусный геном быстро элиминирует прямые повторы с образованием продуктов меж- и внутримолекулярной рекомбинации (Ball, 1987). Продукты одиночного и двойного кроссинговера, являющиеся результатом рекомбинации между трансфицированными плазмидами и вирусным геномом (Spyropoulos et al., 1988) и внутри- и межмолекулярные ф, рекомбинанты плазмидной ДНК или ДНК бактериофага лямбда (Evans et al.t 1988; Parks and Evans, 1991) были обнаружены в инфицированных ортопоксвирусами клетках. Для рекомбинации не требуются продукты экспрессии поздних генов и по-видимому существует тесная связь между рекомбинацией и репликацией (Merchlinsky, 1989). Были представлены доказательства обмена цепей ДНК, катализируемого белками из инфицированных вирусом осповакцины клеток и была предложена рекомбинационная модель, являющаяся производной модели репликации фага Т4 (Zhang and Evans, 1993). Очевидно, что для создания корректной модели молекулярной эволюции всех ортопоксвирусов, патогенных для человека, и предсказания возможных изменений существующих в природе вирусов оспы коров и оспы обезьян необходимо продолжать работы по секвенированию, как минимум, видо-специфичных концевых районов, а лучше - полных геномов этих вирусов.
Получение и характеризация коллекции гибридных плазмид, содержащих >А7ю1-фрагменты генома ВНО штамма Гарсия-1966
Следующим этапом изучения структурно-функциональной организации генома вируса натуральной оспы явилось клонирование, секвенирование и анализ организации генома слабовирулентного (variola minor alastrim) штамма Гарсия-1966 ВНО (ВНО-ГАР). Штамм ВНО-ГАР был выделен д-ром J.Noble в Бразилии во время вспышки оспы алястрим в 1966 г. из кожных поражений девочки 14 лет с интенсивной сыпью титрованием на ХАО РКЭ. От д-ра П.Гринэвея (Портон-Даун, Англия) нами была получена коллекция гибридных плазмид, содержащих часть //mdIII-фрагментов ДНК этого штамма ВНО. Данная коллекция не позволяла осуществить секвенирование протяженных концевых районов вирусного генома. Поэтому перед нами стояла задача создания более полной клонотеки. Учитывая результаты предыдущего этапа работы по созданию клонотек фрагментов генома ВНО штамма Индия-1967, мы решили осуществить клонирование Xhol-фрагментов ДНК ВНО-ГАР. После выделения вирус прошел два пассажа на ХАО РКЭ, после чего был изолирован из отдельной оспины и использован для инфицирования культуры клеток FL. Вирусную ДНК выделяли методом цитоплазматической экстракции (Esposito et al.t 1981) после третьего пассажа вируса на клетках FL. Препарат ДНК данного вируса был наработан в 1985 году в Национальном центре инфекционных заболеваний (Атланта, США) и любезно предоставлен нам д-ром Дж.Эспозито в 1991 году.
Геном ВНО штамма Гарсия-1966 представлен линейной двухцепочечной молекулой ДНК размером около 190 т.п.н., цепи которой соединены на концах ковалентнои связью. При гидролизе ДНК данного вируса рестриктазой XhoX с последующим электрофорезом в агарозном геле было идентифицировано 19 фрагментов ДНК размером от 0,5 т.п.н. (Xhol-R- и -R -фрагменты) до 42 т.п.н. (Л7ш1-А-фрагмент) (рис.7). Размер крупных Xhol-A- и
В- фрагментов слишком велик для того, чтобы они могли быть клонированы в составе плазмидного вектора. Концевые фрагменты генома Xhol-R- и -R (0,5 т.п.н.) несут на одном из концов терминальную шпильку, в силу чего их клонирование обычными методами затруднено и требует специальных подходов. Следовательно, в составе плазмидного вектора могли быть клонированы все А7го1-фрагменты генома, за исключением очень крупных Xhol-A- и -В- , а также концевых Xhol-R- и -R . Задачей данного этапа работы было получение клонотеки АТіоІ-фрагментов генома ВНО-ГАР в составе плазмидного вектора pUBS20. Вектор pUBS20 (Приходько и др., 1990) был получен из вектора pMTL20 (Chambers et al.7 1988) введением в полилинкерную область сайта рестрикции для рестриктазы Bse2\lt что упрощает процедуру секвенирования клонированных фрагментов.
ДНК ВНО-ГАР, гидролизованную рестриктазой Xhol, лигировали с линеаризованной той же рестриктазой ДНК вектора pUBS20. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli JM109 и на среде с ампициллином, X-gal и ИПТГ отбирали белые и светло-голубые колонии. Из колоний с таким фенотипом выделяли плазмидную ДНК и анализировали ее на наличие встроек клонированных Х/їОІ-фрагментов ДНК ВНО. Анализ около 200 независимых клонов позволил сформировать плазмидную клонотеку АТшІ-фрагментов ДНК ВНО штамма Гарсия-1966. Последующий рестрикционный и гибридизационный анализ позволил выявить в составе этой клонотеки все Xhol-фрагменты генома ВНО за исключением А7ЇОІ-А, В, R и R , которые принципиально не могли быть клонированы с использованием данной векторной системы (рис. 7, табл. 3).
На основании полученных данных далее строили подробные рестрикционные карты клонированных АТюІ-фрагментов, которые в свою очередь использовали для разработки общей стратегии секвенирования и для оптимального варианта субклонирования конкретных фрагментов. Полученные субклоны передавали далее непосредственно для определения первичной структуры ДНК. Используя имеющиеся в нашем распоряжении коллекции гибридных плазмид, были секвенированы протяженные районы генома ВНО-ГАР, в сумме имеющие размер 141 т.п.н. Оставшаяся часть генома ВНО-ГАР была секвенирована J.J.Esposito и соавторами (CDC, Атланта, США). В совокупности размер генома ВНО-ГАР составил 186 986 п.н.
Интегральная схема преодоления вирусом натуральной оспы защитных барьеров организма
На рис. 23 суммирована информация, накопленная к настоящему времени по основным молекулярным факторам, обеспечивающим вирусу натуральной оспы высокие патогенные свойства. Функции приведенных на рис.23 белков описаны выше. Пока не идентифицирован вирусный белок (или белки), подавляющий созревание гликопротеидов главного комплекса гистосовместимости класса I и тем самым снижающий эффективность представления на поверхности инфицированной клетки вирусных антигенов специфичным цитотоксическим Т-лимфоцитам (Smith, 1993). На эффективность диссеминации (распространения) вируса в организме хозяина, по-видимому, могут влиять такие белки как вирусный фактор роста, белки оболочки внеклеточных вирионов (прежде всего, гем агглютинин) и анкиринподобные белки (белки, определяющие круг хозяев вируса). Выше упоминалось, что ВНО заметно отличается от ВОВ по структуре VGF, гем агглютинина и ряда анкиринподобных белков. Радикальные отличия ВНО от ВОВ наблюдаются для гомологов белка kelch (см. выше). Все ОРТ данного семейства в геноме ВНО мутационно разрушены, в то время как ВОВ кодирует несколько полноразмерных белков рассматриваемого семейства. Возможно, утрата этих генов вирусом натуральной оспы является одним из факторов его высокой патогенности in vivo. Если сделанное заключение верно, то гены семейства kelch можно отнести к так называемым "буферным" вирусным генам, роль которых состоит в нейтрализации негативных эффектов, развивающихся в организме в процессе инфекции.
С эволюционной точки зрения наиболее приспособленным является вирус, который поддерживает баланс между патогенным воздействием на организм хозяина и возможностью продуктивного развития вируса в организме в течение относительно длительного периода. Такой вирус способен эффективно передаваться от животного к животному в условиях невысокой плотности их популяции. Среди ортопоксвирусов такие свойства наиболее ярко проявляет вирус оспы коров. Некоторое сходство с ВОК имеет ВОВ, хотя последний не является природным вирусом, а возник в процессе вакцинации против оспы, причем исходным вакцинирующим вирусом был ВОК. При анализе геномов ВНО и ВОВ (см. приложение 1) бросается в глаза тот факт, что значительное число ОРТ у ВНО за счет мутационных изменений имеет меньшие размеры (разрушены) по сравнению с ВОВ (например, A38R-A50L и B2L-B12R для ВНО-ИНД, см. приложение 2). Предположено, что по крайней мере некоторые из этих генов являются "буферными". Для одного из генов возможность такого регулирования взаимодействия вирус-хозяин показана экспериментально. Обнаружено, что нарушение гена BOB-WR, кодирующего IL-ip-связывающий белок (изолог B16R ВОВ-КОП), приводит к более раннему появлению симптомов заболевания и гибели подопытных мышей по сравнению с исходным вирусом (Alcami and Smith, 1992). В случае ВНО данный ген нарушен (см. приложение 1). Суммируя имеющиеся данные можно заключить, что вирус натуральной оспы и другие ортопоксвирусы обладают беспрецедентным по сравнению с вирусами других семейств набором генов, белковые продукты которых эффективно модулируют многочисленные защитные функции организма хозяина.
