Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ОРГАНИЗАЦИЯ И ДИВЕРГЕНЦИЯ ДНК ПОЗВОНОЧНЫХ 7
I. Использование нуклеотидного состава ДНК как таксономического признака 7
II. Принципы организации полинуклеотидных последовательностей различной степени повторяемости в ДНК позвоночных II
1. Быстрореассоциирующие последовательности 12
2. Среднеповторяющиеся последовательности 16
3. Медленнореассоциирующие (уникальные) последовательности 23
4. Принципы чередования уникальных и повторяющихся последовательностей в геномах позвоночных 27
III. Молекулярная ДНК-ДНК гибридизация как критерий оценки дивергенции нуклеотидных последовательностей генома позвоночных 38
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 55
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДА 55
1. Объекты исследования 55
2. Выделение и очистка препаратов ДНК 58
3. Определение нуклеотидного состава 59
4. Исследование организации геномов 60
а) Получение фрагментированных ДНК 60
б) Исследование кинетики реассоциации фрагментов ДНК 61
в) Обработка прореассоциировавших дуплексов ДНК S1 -нуклеазой с последующим фракционированием полученных продуктов 63
г) Плавление прореассоциировавших дуплексов ДНК 64
5. Молекулярная ДНК-ДНК гибридизация 64
а) Получение меченых препаратов реперных ДНК методом тритиевого обмена 64
б) Нанесение полимерной ДНК на нитроцеллюлозные фильтры 65
в) Проведение реакции гибридизации на нитроцеллюлозных фильтрах 66
г) Оценка термостабильности гибридных ДНК-ДНК дуплексов 67
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 68
I. Нуклеотидный состав и внутригеномная гетерогенность ДНК по составу у птиц 68
II. Принципы организации генома двух видов птиц из отряда Anseriforraes 75
II. Организация геномов степной черепахи (Testudo horsfieldi ) и европейского хариуса ( Thymal- lus thymallus ) 87
Дивергенция среднеповторяющейся ДНК у представителей ряда отрядов птиц 102
Дивергенция среднеповторяющейся ДНК представителей отряда Anseriformes 106
ВЫВОДЫ 132
Литература 134
- Использование нуклеотидного состава ДНК как таксономического признака
- Исследование кинетики реассоциации фрагментов ДНК
- Нуклеотидный состав и внутригеномная гетерогенность ДНК по составу у птиц
Использование нуклеотидного состава ДНК как таксономического признака
Сравнительное изучение ДНК ведется в основном на протяжении двух последних десятилетий (Белозерский, Антонов, 1972; Антонов, 1974; Антонов, 1980). Используемые методы до недавнего времени ограничивались в основном определением содержания ДНК на клетку, методами определения нуклеотидного состава ДНК (хроматографическими, по температуре плавления ДНК, центрифугированием в градиенте плотности CsCl ), определением частоты встречаемости пиримидиновых и пуриновых изоплитов, изучением кинетики ренатурации ДНК и принципов расположения в геноме нуклеотидных последовательностей различной степени повторяемости, молекулярной ДНК-ДНК гибридизацией. Сейчас эти методики могут быть дополнены анализом полных нуклеотидных последовательностей клонированных участков генома, рестриктазным анализом ДНК. Набор методов для сравнительного изучения ДНК позволил вскрыть существенные особенности организации как отдельных генов, так и целых групп последовательностей и степень их дивергенции.
Раньше всего для целей геносистематики стали использовать определение нуклеотидного состава ДНК. Большое, а зачастую решающее значение изучение нуклеотидного состава имеет при решении вопросов таксономии и систематики микроорганизмов (Стейниер и др., 1979). Именно при работе с ДНК микроорганизмов было предложено использовать результаты определения нуклеотидного состава в качестве таксономического признака. Впоследствии эта характеристика генома широко использовалась при изучении самых разнообразных ДНК. Были получены обширные данные об особенностях нуклеотидного состава ДНК различных позвоночных и о степени его варьирования в пределах таксонов разного ранга.
По мере накопления данных по нуклеотидному составу предпринимались попытки обобщения результатов и рассмотрения их в сравнительно-систематическом аспекте. Было установлено, что количественное содержание ГЦ-пар нуклеотидов в ДНК позвоночных практически всегда меньше 50 молярных процентов, то есть все они относятся к АТ-типу. Содержание ГЦ-пар в ДНК позвоночных варьирует от 35 до 45 мол# (Антонов, 1972). По сравнению с изученными ДНК растительного происхождения или выделенных из тканей беспозвоночных животных, ДНК позвоночных содержит мало 5-ме-тилцитозина - от I до 3$. Отмечено,что оно может быть различным в ДНК организмов, содержащих равное количество ГЦ-пар (Антонов, 1965; Vanyushin et al. , 1970) и, следовательно, применимо при оценке специфичности ДНК позвоночных. Нуклеотидный состав ДНК позвоночных по сравнению с ДНК других эукариот варьирует мало, что ограничивает его использование в качестве таксономического признака. По-видимому, совершенно бесполезно пытаться использовать данные по нуклеотидному составу для установления различий между видами у позвоночных. Однако, для ряда таксонов более высокого ранга установлены достоверные различия по этому признаку. Было, например, показано, что виды, относимые к разным, хотя и родственным родам сиговых рыб, достоверно отличаются по содержанию ГЦ-пар в ДНК ( Booke , 1968). Достоверно различаются также средние значения нуклеотидного состава в ДНК рыб различных отрядов (Попов, Антонов, 1974). Различия в содержании ГЦ-пар обнаружены в ДНК представителей различных отрядов млекопитающих ( Arrighi et al. , 1968а, 1970, 1972; Hennig , Wal -ker , 1970). Эти авторы установили, что как сам нуклеотидный состав, так и степень его варьирования у представителей разных отрядов могут быть различными. По-видимому, максимальная изменчивость состава характерна для ДНК грызунов и насекомоядных. Значительной вариабельности достигает также нуклеотидный состав у рукокрылых, у которых найдены достоверные различия по этому признаку между видами, относящимися к различным подотрядам (Arrighi , 1972).
Исследование кинетики реассоциации фрагментов ДНК
Исследование кинетики реассоциации фрагментов ДНК проводили по методу Бриттена ( Britten et al., 1974). Аликвоты фрагментов ДНК денатурировали нагреванием и инкубировали до различных величин Got (Со -начальная концентрация ДНК в молях нуклеотидов на литр, t - время инкубации в секундах), используя фосфатные буферы различных концентраций. Время инкубации, необходимое для отжига до разных значений Got , определялось концентрацией фрагментов и концентрацией используемого фосфатного буфера и рассчитывалось исходя из того, что при концентрации ДНК 83 мкг/мл значение Got =1 достигается за I час. Инкубация происходила в запаянных стеклянных ампулах; температуру инкубации рассчитьшали исходя из содержания ГЦ-пар в исследуемой ДНК и концентрации фосфатного буфера, в котором проводили реакцию. По окончании инкубации реакцию останавливали быстрым охлаждением в смеси из жидкого азота и ацетона и хранили в замороженном состоянии до разделения. Пробы, содержащие около 80 мкг ДНК, переводили в 0,12 М фосфатный буфер и наносили на колонки объемом 0,3-0,5 мл ГАП,а, уравновешенные тем же буфером при температуре 60С. Затем смывали несвязавшуюся однонитчатую ДНК 0,12 М ФБ в количестве пяти объемов колонки. Двунитчатую ДНК элюировали 0,4 М ФБ в том же объеме при 60С в случае коротких фрагментов (до 600 н.п.) и 0,12 М ФБ при 97С в случае более длинных.
Количество одно- и двунитчатой ДНК во фракциях определяли, измеряя поглощение элюатов против соответствующих контролей. В случае температурной элюции для учета светорассеяния брали разницу между поглощениями при значениях длин волн 260 нм и 320 нм. Кривые кинетики реассоциации получали, откладывая долю реассо-циировавшей ДНК в процентах против соответствующих значений в логарифмическом масштабе. Разбивку кривых реассоциации на кинетические компоненты осуществляли, откладывая экспериментальные значения в нормализованной, то есть приведенной к 100$ шкале и сравнивая полученную кривую с идеальной кривой второго порядка ( Leird , McCarthy , 1969). Выбирали тот вариант, при кото - 63 -ром экспериментальная кривая лучше совпадает с теоретической кривой.
Нуклеотидный состав и внутригеномная гетерогенность ДНК по составу у птиц
В первой части работы было предпринято изучение нуклеотид-ного состава ДНК птиц. Результаты определения содержания ГЦ-пар и внутригеномной гетерогенности ДЖ по составу представлены в таблицах 2 и 3. Изучена ДНК 48 ввдов птщ, относящихся к 10 отрядам. Результаты исследований показали, что содерясание ГЦ-пар в ДНК птиц варьирует от 39,1 до 48,3 мол$. Коэффициент вариации со-деркания ГЦ-пар равен 4,5.
Пределы варьирования нуклеотидного состава ДІЖ птщ близки к тем значениям, что были получены для представителей других классов позвоночных - рыб, амфибий, рептилий, млекопитающих (Антонов, Белозерский, 1970; Arrighi et al, 1970; Попов и др., 1974; Hudson et al , 1980; Olmo, 1981; см. литературный обзор). Значение коэффициента вариации нуклеотидного состава птщ также близко к значениям, полученным для других классов позвоночных. Рассчитанный нами на основании данных Хадсона (Hudson et al , 1980) коэффициент вариации нуклеотидного состава 33 видов рыб составляет величину 4,23; для 97 видов рыб, чей нуклеотидный состав был изучен методом хроматографии кислотных гидрализатов ДНК на бумаге (Попов, Антонов, 1974), коэффициент вариации равен 7,72. Коэффициент вариации содержания ГЦ-пар в ДНК 93 ввдов млекопитающих, определенного по плавучей плотности ДЖ в градиенте плотности CsCl (Arrighi et al 1970), составляет 3,1.
Похожие диссертации на Организация генома и дивергенция ДНК в классе птиц
