Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. История открытия вируса оспы обезьян 10
1.2. Оспа обезьян у животных 13
1.3. Оспа обезьян у человека 18
1.3.1. Вспышки оспы обезьян у человека 19
1.3.2. Клинические проявления оспы обезьян у человека 28
1.3.3. Эпидемиология и экология BOO 30
1.4. Биологические свойства вируса оспы обезьян 34
2. Материалы и методы 44
2.1. Материалы 44
2.2 Методы 51
3. Результаты и обсуждение 56
3.1. Создание клонотеки рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты геномной ДНК штамма ZAI-96-I-16 вируса оспы обезьян 56
3.2. Создание клонотеки рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты геномной ДНК штамма Congo-8 вируса оспы обезьян 63
3.3. Расшифровка нуклеотидных последовательностей генома BOO 66
3.4 Анализ организации генома вируса оспы обезьян 67
3.4.1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генома двух штаммов BOO 70
3.4.2. Сравнительный анализ последовательностей из генома BOO с гомологичными последовательностями из геномов других ортопоксвирусов 71
4. Заключение 104
5. Выводы 107
6. Приложение 1 109
7. Приложение 2 130
8. Список литературы 148
- Клинические проявления оспы обезьян у человека
- Биологические свойства вируса оспы обезьян
- Создание клонотеки рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты геномной ДНК штамма Congo-8 вируса оспы обезьян
- Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генома двух штаммов BOO
Введение к работе
Оспа обезьян - зоонозная инфекция, циркулирующая в тропических лесах Центральной и Западной Африки. Причиной заболевания является вирус из рода Orthopoxvirus - вирус оспы обезьян (BOO), который поражает широкий круг млекопитающих и является патогенным для человека.
Заболевание оспой обезьян для людей нередко оканчивается летальным исходом (до 15%). Клинические проявления оспы обезьян у человека сходны с таковыми для натуральной оспы и на протяжении последних тридцати лет неоднократно ставился вопрос об опасности адаптации BOO к человеческому организму и переходу BOO в ВНО-подобный вариант (Breman and Henderson, 1998). Оспа обезьян с гораздо меньшей эффективностью передается от человека к человеку, чем натуральная оспа. В отличае от ВНО вирус оспы обезьян способен поражать широкий круг животных разных видов.
С момента открытия в 1970 году оспы обезьян у человека случаи этого заболевания у людей регулярно регистрировали в Африке. Подавляющее число случаев было обнаружено в Демократической Республике Конго (ДРК - ранее Заир). Недавно вспышка оспы обезьян у людей была зафиксирована вне африканского континента - в США в 2003 году.
Вследствие прекращения после 1980 г. вакцинации людей против натуральной оспы за истекшие годы сформировалась большая прослойка людей, не защищенных от ортопоксвирусной инфекции, что обеспечивает возможность распространения в человеческих популяциях зоонозных ортопоксвирусов, таких, например, как BOO. Таким образом, вирус оспы обезьян в настоящее время представляет реальную угрозу жизни и здоровью людей.
В связи со всем вышесказанным важно было выявить отличия и сходства в организации геномов BOO и ВНО, оценить возможный потенциал эволюционного преобразования BOO. Наиболее прямым и информативным подходом для решения подобных задач является расшифровка нуклеотидной последовательности генома вируса и сравнение его с геномами близкородственных вирусов. К началу нашего исследования сведения о структуре протяженных участков ДНК BOO отсутствовали.
Целью данного исследования было изучение организации генома BOO.
В процессе работы решались следующие задачи:
Получение библиотек рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты генома BOO штаммов ZAI-96-I-16 и Congo-8;
Секвенирование полной последовательности генома штамма ZAI-96-I-16 и концевых вариабельных участков генома штамма Congo-8;
Построение трансляционных карт генома BOO;
Сравнение организации вариабельных участков генома двух штаммов BOO;
Сравнение организации генома BOO и других патогенных для человека ортопоксвирусов, таких, как вирусы натуральной оспы, оспы коров и осповакцины.
Научная новизна и практическая значимость работы. Получены представительные библиотеки рекомбинантных плазмид, несущих фрагменты генома BOO-ZAI-96-I-16 и BOO-Congo-8. Впервые определена^ полная нуклеотидная последовательность ДНК генома штамма BOO-ZAI-96-1-16 и нуклеотидная последовательность ДНК вариабельных районов штамма BOO-Congo-8. Проведен сравнительный анализ гомологичных районов двух штаммов. Осуществлен подробный анализ организации генома BOO-ZAI-96-1-16 и его сравнение с геномами BHO-IND, BOB-СОР и BOK-GRI. Изучена структура гена, кодирующего вирусный комплементсвязывающий белок для
пяти центральноафриканских штаммов BOO, двух западноафриканских и впервые показано что BOO кодирует либо укороченную форму VCP (центральноафриканский подтип вируса), либо ген, кодирующий этот белок, делегирован (западноафриканский подтип BOO). Так же для ряда штаммов BOO изучена структура двух генов, кодирующих внутриклеточные факторы устойчивости ортопоксвирусов к действию интерферона и впервые обнаружено, что у BOO видоспецифичным образом нарушены гены C3L и F3L, кодирующие внутриклеточные факторы устойчивости ортопоксвирусов к действию интерферона. На основании полученных данных и проведенного анализа сделан вывод о том, что BOO не является эволюционным предшественником ВНО и наоборот.
Вклад автора. Клонирование фрагментов ДНК двух штаммов BOO осуществлено автором совместно с д.б.н. Петровым НА. и к.б.н. Рязанкиной О.И.; секвенирование фрагментов генома BOO выполнено автором совместно с д.б.н. Петровым Н.А., к.б.н. Сафроновым П.Ф., Гуторовым В.В. Клонирование и секвенирование генов C3L и F3L BOO осуществлено лично автором. Компьютерный анализ генома BOO выполнен автором при участии к.б.н. Тотменина А.В. и к.б.н. Сафронова П.Ф.
Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 5 статей в реферируемых изданиях. Результаты работы представлены на международных конференциях: 12th International Poxvirus Symposium (StThomas, USA 1998), International Conference on Bacterial and Viral Virulence Factors (Smolenice, Slovakia 2000), 13th International Poxvirus and Iridovirus Symposium (Montpellier, France. 2000), 15th International Poxvirus and Iridovirus Conference (Oxford, UK. 2004).
Основные положения, выносимые на защиту:
Охарактеризованные библиотеки рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты генома вируса оспы обезьян (BOO) штаммов ZAI-96-I-16 и Congo 8.
Полная нуклеотидная последовательность ДНК 196858 п.н. BOO
штамма ZAI-96-I-16. Последовательности 28659 п.н. из концевых
вариабельных последовательностей генома BOO штамма Congo-
8.
Большая степень идентичности (>99%) гомологичных последовательностей ДНК двух штаммов BOO ZAI-96-I-16 и Congo-8.
BOO кодирует либо укороченную форму VCP (центральноафриканский подтип вируса), либо ген, кодирующий этот белок, делегирован (западноафриканский подтип BOO).
У BOO видоспецифичным образом нарушены гены C3L и F3L, кодирующие внутриклеточные факторы устойчивости ортопоксвирусов к действию интерферона.
Вирус оспы обезьян представляет собой вид с множественными
отличиями по структуре ДНК от вируса натуральной оспы и
других ортопоксвирусов, патогенных для человека.
Клинические проявления оспы обезьян у человека
Клинические признаки оспы обезьян сходны с таковыми натуральной оспы, но их проявления более умеренные. Основной отличительным признаком оспы обезьян от натуральной оспы является лимфаденит, который выявляли в 90% случаев в Африке (Fenner et al., 1988) и в 47% случаев во время вспышки в США (MMWR, 2003а). Инкубационный период инфекции составляет около 12 дней. Заболевание начинается с лихорадки, головной боли, болей в спине и мышцах, лимфаденита, слабости и истощения организма. Пик температуры наблюдается на второй день и достигает 38,5-40,5С. Лихорадка сопровождается сильными головными болями, болями в спине и общим недомоганием. Головная боль (иногда фронтальная, но главным образом генерализованная) является самым распространенным симптомом и у некоторых пациентов предшествует лихорадке. У многих пациентов лимфаденопатия развивалась до появления сыпи. Локализация лимфаденитов варьирует (подчелюстные шейные, подмышечные, паховые): иногда они двусторонние, иногда односторонние. В 11% случаев лимфадениты носят локальный характер, в 63,9% случаев развивается генерализованная лимфаденопатия (Jeek et al, 1987; Jezek and Fenner, 1988). Через 1-3 дня после начала лихорадки у заболевшего появляется сыпь, которая сначала локализуется чаще всего на лице, реже на других частях тела (MMWR, 2003). Как и при натуральной оспе, высыпания отмечаются и на слизистых оболочках, и на языке. Кожные повреждения проходят в развитии несколько стадий (папулы - везикулы - пустулы - корки). После отшелушивания корок на коже остаются депигментированные участки, на месте которых формируются отчетливые, но неглубокие рубцы или гиперпигментированные пятна (Foster et al., 1972; Ladnyi et al., 1972; Jezek et al., 1983). Болезнь обычно длится 2-4 недели. У большинства пациентов степень лихорадки, сложность симптомов и продолжительность заболевания были пропорциональны количеству кожных повреждений (Jeek et al., 1987). Встречается также субклиническая форма оспы обезьян. О наличии этой формы судят по появлению антител у лиц, имевших контакт с больными. Субклиническую форму выявляли у 3,7% невакцинированных персон, тесно контактировавших с больными оспой обезьян (Jezek et al., 1986; Jezek and Fenner, 1988). Был зарегистрирован случай врожденной оспы обезьян у младенца, мать которого незадолго до родов перенесла заболевание.
Среди осложнений, вызванных оспой обезьян, чаще встречаются вторичная бактериальная инфекция кожи, бронхопневмония, диарея, дегидратация, кератиты (Маренникова, Щелкунов, 1998). В Африке смертность от оспы обезьян составляла от 3% до 10% заболевших. Смертность наблюдалась лишь в возрастной группе до 10 лет (Foster et al., 1972; Jezek et al., 19886). Вакцинация против натуральной оспы защищает и от оспы обезьян, однако, как и в случае с натуральной оспой, защита не является абсолютной: вакцина эффективна на 85%. Устойчивость к вирусу у вакцинированной прослойки населения убывает со временем. Так, 7% заболевших имели вакцинальные рубцы, при этом 27% из этих заболевших тяжело переносили заболевание, тогда как у никогда не вакцинированных этот показатель составлял 61,6% (Jezek and Fenner, 1988; Fine et al., 1988). Несмотря на то, что клиническая характеристика оспа обезьян идентична на натуральной оспе, ее эпидемиологические характеристики совершенно иные. Так как единственным хозяином для вируса натуральной оспы является человек, то не существует его резервуара в дикой природе. Вирус оспы обезьян, напротив, имеет широкий круг хозяев и поиск исследователями природного резервуара имеет свою богатую историю. Первоначальные усилия по поиску следов BOO в Юго-Восточной Азии не увенчались успехом (см разд. 1.1.). Очень долго не удавалось обнаружить BOO и в Африке. Отчасти это объясняется тем, что исследовали сыворотки приматов из тех регионов Африки, в которых никогда ни до ни позже не сообщалось о случаях оспы обезьян (Fenner et al., 1989). Косвенным подтверждением того, что резервуар вируса следует искать в Африке, стало открытие оспы обезьян у человека в ДРК в 1970. Усилия исследователей сконцентрировались на регионах, в которых сообщалось о случаях оспы обезьян у людей. В 1971-1973 годах в четыре этапа были обследованы местности, в которых ранее наблюдались случаи заболевания. С помощью РТГА в 14 образцах сывороток из 81, выделенных от обезьян были обнаружены антитела к ортопоксвирусам. В тоже время, в нейтрализующем тесте антитела обнаружены в 11 сыворотках из 65 (Маренникова и др., 1975). В середине 70-х годов XX века также исследовали сыворотки из Западной Африки: с помощью нейтрализующего теста и РТГА теста были проверены 206 сывороток, полученных от приматов из 26 различных районов в Мали, Буркина-Фасо (Верхняя Вольта) и на Берегу Слоновой кости. Географически были представлены саванны, леса и джунгли (Breman et al., 1977). Из 195 сывороток 15 (8%) оказались положительными при использовании РТГА теста, 44 (23%) - в нейтрализующем тесте. Три положительные в РТГА сыворотки протестировали иммунофлуоресцентным анализом и выявили специфичные к BOO антитела (Gispen et al., 1976). Кроме того, описаны два случая заболевания у человека после контакта с больным животным (Маренникова и др., 1984; Manshande and Kabaya, 1983). Сообщалось и о других серологических исследованиях сывороток от африканских обезьян (Jezek and Fenner, 1988), в этих исследованиях были обнаружены видоспецифичные антитела к BOO (Fenner and Nakano, 1988). Кроме того, при обследовании неприматов видоспецифические антитела к BOO были обнаружены у белок из родов Funisciurus и Helioscurus (Ходакевич, 1990). Серологические данные свидетельствовали о циркуляции вируса среди различных видов грызунов и приматов в зоне тропических лесов центральной и западной Африки. Решающим доказательством этого стало бы выделение вируса от его носителя в дикой природе. Так как при поиске природного резервуара оспы коров было обнаружено, что лишь 0.18% из обследованных грызунов были носителями заболевания (Ладный и др., 1975), то поиски сосредоточили на животных в острой стадии заболевания с выраженными кожными повреждениями. И в 1985 г. в зоне Бумба была найдена больная белка Funisciuru anerythrus, от которой был выделен вирус оспы обезьян.
Биологические свойства вируса оспы обезьян
Вирус оспы обезьян входит в состав рода Orthopoxvirus семейства Poxviridae. Поксвирусы являются самыми крупными вирусами позвоночных, их вирионы можно увидеть в световой микроскоп после фиксации и окраски препаратов. Семейство поксвирусов делится на два подсемейства: Chordopoxviridae и Entomopoxviridae. Представители первого подсемейства размножаются в клетках позвоночных, а второго - насекомых. Вирусы семейства Chordopoxviridae подразделяются на восемь родов (табл. 4) (Fenner, 2000).
В род Orthopoxvirus входит десять видов вирусов, краткая характеристика которых представлена в таблице 5. Четыре вида из рода Orthopoxvirus являются патогенными для человека: вирус натуральной оспы, вирус оспы обезьян, вирус оспы коров и вирус осповакцины.Одной из основных характеристик семейства Poxviridae являются вирионы кирпичеобразной или округлой формы. Вирионы BOO при электронно-микроскопическом исследовании не отличаются ни по размеру, ни по структуре от вирионов других ортопоксвирусов (Nakano, 1985; Маренникова и др., 1990). В отличие от других вирусов позвоночных, имеющих в качестве генома ДНК, поксвирусы реплицируются в цитоплазме клеток. Геном Poxviridae представлен однокопийной двуцепочечной молекулой ДНК длинной 130-220 т.п.н. На концах молекулы находятся длинные инвертированные концевые повторы (terminal inverted repeats TIR) (Garon et al., 1978; Wittek et al., 1978), содержащие короткие тандемные повторы (Wittek and Moss 1980) и две уникальные последовательности NR1 и NR2. Цепи ДНК ковалентно замкнуты на концах и образуют концевые шпильки (Baroudy et al., 1982). Длина шпильки варьирует в пределах нескольких нуклеотидов и составляет 102-104 п.н. (Baroudy et al., 1983; Massung et al, 1994; Goebel et al, 1990). Шпилька является высококонсервативной последовательностью и характеризуется высоким содержанием А-Т пар и неполным спариванием, существует в двух формах - F-форма является инвертированной комплементарной последовательностью S-формы (Baroudy et al., 1982). Последовательности NR1 и NR2 консервативны (идентичность 93-98%). Количество тандемных повторов в двух блоках варьирует не только у различных видов вирусов, но и у различных штаммов одного вида и даже у субклонов одного штамма (Fenner et al., 1989). Центральная часть генома ортопоксвирусов высококонсервативна и составляет около 100 т.п.н., в этой части располагаются гены, кодирующие почти все жизненно важные для вируса функции. Основные видо- и штаммоспецефичные различия в геномах ортопоксвирусов обнаруживаются в вариабельных концевых районах (рис. 4).
Репродукция в куриных эмбрионах и культурах клеток. При введении BOO на ХАО 12-дневных куриных эмбрионов и их инкубации при 35 С в течение 72 часов формируются беловатые оспины 0.4-1 мм в диаметре с геморрагиями в центре. При наличии на оболочке множества дискретных и полусливных оспин они приобретают слегка розоватый оттенок. Около 1% оспин - более крупные белые и без геморрагии. При описанных условиях культивирования оспины BOO хорошо отличаются от «красных» оспин вируса оспы коров и белых оспин вируса натуральной оспы. Меньший размер оспин, неотчетливая их выпуклость и наличие центральных геморрагии являются основными признаками поражений на ХАО, характерных для BOO при сравнении с оспинами, формируемыми ВНО. При снижении времени инкубации до 48 часов или увеличении температуры инкубации на 2-2.5С оспины BOO практически неотличимы от ВНО (Marennikova etal, 1973; Gispen and Brand-Saathof, 1972/
При заражении на ХАО вирус накапливается в очень больших концентрациях ( 8 lg ООЕ/мл) как при первичном выделении, так и при пассировании (Marennikova et ai, 1973). Вирус оспы обезьян летален для куриных эмбрионов в той же степени, что вирус оспы коров и эктромелия, и занимает по этой способности промежуточное место между вирусом осповакцины и вирусом натуральной оспы (Bedson and Dumbell, 1961). BOO способен реплицироваться и достигать высоких титров во многих культурах клеток, как человека, так и животных (McConel, 1962).
Исследование ДНК различных штаммов вируса оспы обезьян с помощью рестриктазного картирования. Простые, быстрые и относительно дешевые методы рестриктазного картирования (анализа) имеют огромное значение для работ по исследованию геномов и филогенетических связей различных организмов. Получающиеся в результате такого исследования карты указывают расположение сайтов рестрикции для одной или нескольких эндонуклеаз рестрикции на молекуле ДНК. Такая карта является лишь грубой схемой, которая, однако, может являться хорошей основой для разработки стратегий клонирования и секвенирования. Кроме того, на основе сравнения рестриктных карт гомологичных участков ДНК близкородственных организмов можно рассчитать генетическое расстояние между этими организмами и построить филогенетическое дерево.
В ранних работах (Esposito and Knight, 1985) рестриктазным анализом проанализировали 38 образцов ДНК восьми видов ортопоксвирусов, в том числе клинические изоляты и хорошо описанные лабораторные штаммы. Были проанализированы 20 штаммов BOO, 10 штаммов ВНО, по одному штамму эктромелии, вируса оспы коров, вируса оспы верблюдов, вируса оспы енотов, Tatera poxvirus, три штамма вируса вакцины.
Создание клонотеки рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты геномной ДНК штамма Congo-8 вируса оспы обезьян
Штамм BOO Congo-8 был выделен от человека в 1970 году в ДРК (Marennikova et al., 1972). Его история описана в главе «Обзор литературы». ДНК этого штамма была выделена в CDC и предана нам доктором Дж Эспозито. Штаммы ZAI-96-I-16 и Congo-8 происходят из одного географического региона и выделены с интервалом в 26 лет. Таким образом, представлялось интересным сравнение нуклеотидных последовательностей концевых вариабельных районов генома данных вирусов. Так как именно в этих районах располагаются сравнительно небольшие /fmdIII-фрагменты, которые удобно клонировать в векторных плазмидах, то для штамма Congo-8 создавали только НшсІШ-клонотеку рекомбинантных плазмид. Препарат вирусной ДНК подвергали гидролизу ШпдШ. ДНК лигировали с линеарезованной той же рестриктазой ДНК векторной плазмидой (pMGC20 или pZero-2.1), затем лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli штамма XL-blue. Плазмиды, содержащие в своем составе фрагменты генома BOO-CNG, выявляли рестриктазным анализом при скрининге 300 плазмид. Сначала проводили гидролиз эндонуклеазой Hindlll и отбирали плазмиды, содержащие вставку нужной длины. Затем отобранные плазмиды расщепляли эндонуклеазой, которую выбирали с помощью компьютерного анализа структуры гомологичных фрагментов других ортопоксвирусов. В таблице 9 представлены плазмиды, составляющие клонотеку фрагментов ДНК штамма Congo-8. В результате описанных процедур не удалось получить рекомбинантные плазмиды, содержащие в своем составе самые длинные фрагменты - #mdIII-A- и Я/wdIII-B (56,5 и 27,3 т.п.н. соответственно), J-фрагменты (6,3 т.п.н.), содержащие концевую шпильку, и Hindlll-G фрагмент (9 т.п.н.). Библиотека фрагментов ДНК BOO штамма Congo-8 (Табл.9, рис 7) представлена 24 рекомбинантными плазмидами. В сумме они содержат 103,8 т.п.н. из генома BOO штамма Congo-8, и таким образом, в библиотеке представлена большая часть генома, в том числе вариабельные районы, за исключением концевых 12,6 т.п.н. При анализе рекомбинантных плазмид для обоих штаммов были обнаружены плазмиды, содержащие небольшие фрагменты (0,28 т.п.н. и 0,7 т.п.н. соответственно), не описанные ранее (Esposito and Knight, 1985).
Эти фрагменты получили название Hindlll-R и i// «dIII-S, соответственно, их принадлежность геному BOO была позднее доказана секвенированием. Секвенирование большинства клонированных в составе гибридных плазмид фрагментов BOO штаммов ZAI-96-I-16 (BOO-ZAI) и Congo-8 (ВОО-CNG) проводили с помощью метода химической модификации и деградации нуклеиновых кислот по Максаму-Гилберту (Maxam and Gilbert, 1980). Небольшой фрагмент (1300 п.н.) из левой части Hindlll-A фрагмента генома BOO штамма BOO-ZAI не удалось получить в составе ни одной гибридной плазмиды. Структуру ДНК этого фрагменты определили с помощью процедуры автоматического секвенирования на приборе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer. Стратегия секвенирования приведена на рис. 8. С помощью компьютерного анализа в структуре этой последовательности обнаружен промоторо-подобный район для РНК-полимеразы E.coli. Ранее в нашей лаборатории на примере клонированных фрагментов ДНК ВЭ и ВОВ показано, что АТ-богатые последовательности ортопоксвирусных ДНК часто содержат промоторо-подобные районы, с некоторых из которых может эффективно инициироваться транскрипция (Щелкунов и др., 1992). В ряде случаев такая транскрипция может приводить к утрате плазмид из бактериальных клеток. Неудача в клонировании рассматриваемой последовательнсти ДНК BOO, по-видимому, связана с наличием в ее структуре промоторо-подобного района для РНК-полимеразы E.coli Используя полученную коллекцию гибридных плазмид нами в итоге была секвенирована непрерывная последовательность 196858 п.н., представляющая полный геном BOO-ZAI за исключением нескольких нуклеотидов, входящих в состав концевых шпилек, которые были потеряны при обработке ДНК нуклеазой S1. Последовательность ДНК BOO-ZAI была аннотирована и депонирована в GenBank под номером AF 380138. Из правого и левого концевых вариабельных районов генома BOO штамм Congo-8 суммарно было секвенировано 28659 п.н.: определены последовательности Hindlll-D, #ш Ш1-Р, ЯшёШ-О, #wdIII-N и ЯгЫШ-К -фрагментов. Одним из первых результатов анализа генома BOO стало уточнение его ЯшёШ-рестриктционной карты (рис. 9). Оказалось, что /fwdlll-N фрагмент находится только в правой части генома, хотя ранее (Esposito and Knight, 1985) считалось, что его копия есть также на левом конце генома. При анализе первичной структуры этого фрагмента было выявлено, что на левом конце геномов BOK-GRI и ВОВБ-CMS, а также самого BOO-ZAI есть последовательности гомологичные последовательностям из Hindlll-N фрагмента. Район BOO-ZAI 1-160 п.н. Hindlll-N фрагмента идентичен району 7525-7888 п.н. из генома ВОВБ-MOS, внутри гомологичного района обнаружена вставка в последовательности ВОВБ-CMS - 204 п.н.; идентичность фрагментов 92%. Последовательность BOO-ZAI 1185 - 2770 п.н. /fwdlll-N фрагмента идентична последовательности 885 п.н. из начала #/ wdIH-D фрагмента BOO-ZAI - эта последовательность входит в TIR (см. ниже). При сравнении последовательности, гомологичной Hindlll-N фрагменту BOO-ZAI, с левой концевой последовательностью из генома BOK-GRI выявляются шесть районов высокой иденичности (Табл. 10).
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генома двух штаммов BOO
При анализе гомологичных последовательностей из левого (20591 п.н.) и правого (8162 п.н.) концевых районов геномов двух штаммов BOO-ZAI и BOO-CNG выявили, что их нуклеотидные последовательности идентичны на 99,83%. Обнаруженные мутационные события описаны в таблице 11. Все делеции/вставки обнаружены в межгенных областях. Самая крупная из них - 20 п.н. - находится в Hindlll-D фрагменте. Из 18 замен нуклеотидов 11 обнаружены внутри ОРТ; три такие замены приводят к замене аминокислотного остатка. Замена дезоксигуанозина на дезоксиаденозин во втором положении триплета 90 в ОРТ D7L приводит к замене в полипептиде аланина на валин. Замена дезоксиаденозина на дезоксицитидин во втором положении триплета 21 в ОРТ D9L приводит к замене изолейцина на серии. Замена тимидина на дезоксицитидин в первом положении триплета 136 в ОРТ 02L приводит к замене аспарагина на аспартат. Рамки D7L и D9L кодируют анкирин-подобные белки (Shchelkunov et al, 1993b), OPT 02L функционально не охарактеризована (Morgan and Roberts, 1984). Таким образом, выявлена высокая идентичность изученных районов концевых вариабельных последовательностей ДНК двух центральноафриканских штаммов BOO, разделенных по времени выделения периодом 26 лет. Полученные данные указывают на низкую скорость накопления мутаций в геноме BOO. Районы инвертированных терминальных повторов (TIR) BOO-ZAI составляют 6379 п.н. Последовательность одной цепи концевой шпильки определена полностью за исключением четырех нуклеотидов, которые были потеряны при обработке вирусной ДНК нуклеазой S1 (рис. 10). Последовательности NR1 (85 п.н.) и NR2 (322 п.н.) разделены двумя блоками тандемных повторов длиной 70 п.н.. Находящаяся за последовательностью NR1 область, необходимая для разрешения конкатамерных промежуточных продуктов репликации ДНК (TRT - Telomere Resolution Target), идентична таковой для BHO-BSH и BOB-СОР (рис. 10). Между последовательностью NR2 и началом первой ОРТ (J1L) располагаются последовательности повторов -одна длиной 70 п.н. и две длиной 54 п.н.
В районе TIR на правом конце генома располагается четыре ОРТ, они продублированы и в районе левого TIR (J1L, J2L, J3L, D1L). Эти ОРТ гомологичны ОРТ D1L, D2L, D3L и C1L BOK-GRI. Консервативная часть генома BOO. Консервативная часть генома BOO ограничена ОРТ C10L-A25R и имеет размер 101466 п.н.. Идентичность этого района аналогичным районам других ортопоксвирусов составляет: 96,2% - относительно BHO-IND, 97,4% - относительно ВОВ-СОР, 97,6% -относительно BOK-GRI, 96,6% - относительно ВОВБ-CSM. Именно в этом районе располагаются все необходимые для жизнедеятельности вируса гены, кодирующие вирусные ферменты, отвечающие за биосинтез ДНК и РНК, а также большинство генов структурных белков. Идентичность аминокислотных последовательностей белков, кодируемых в этом районе, как правило, превышает 90 % (Приложение 2) для ортопоксвирусов, патогенных для человека. В то же время для нескольких ОРТ из центрального района генома наблюдаются видоспецифичные отличия. ОРТ ВОВ-СОР кодирует один из ортопоксвирусных белков, обеспечивающих устойчивость вируса к действию интерферона (Chang et ah, 1992; Rivas et ah, 1998). Аминокислотная последовательность, кодируемая гомологичным геном BOO F3L, имеет идентичность 85,6% с ОРТ E3L BHO-IND, 86,3% - с F3L BOK-GRI и 96,3% - с E3L ВОВ-СОР. Более подробный анализ ОРТ BOO F3L приведен ниже в разделе «Ингибиторы действия интерферона». Белки, которые кодируют ОРТ A5L и A13L BOB-СОР (ОРТ A4L и A14L BOO), являются вирионными и в их структуре также наблюдаются отличия.Продукт ОРТ A5L является иммунодоминантным белком (Мао and Esteban 1987; Williams et al, 1999), a A13L - белком поверхностной мембраны внутриклеточного зрелого вириона (IMV)(Takahashi et al, 1994; Salmons et al, 1997). Исходя из полученных данных можно предположить, что различия в этих белках появились в результате адаптации к различным организмам-хозяевам. Основные видоспецифичные отличия BOO от других ортопоксвирусов располагаются в вариабельных концевых районах. В геноме ZAI-96-I-16 не обнаружено уникальных генов, в то же время по сравнению с геномом ВОК-GRI отсутствуют 25 потенциальных ОРТ, а по сравнению с BHO-IND - 19 ОРТ. Для части отсутствующих ОРТ функция не известна, однако в геноме BOO не обнаружен ряд генов, отвечающих за круг хозяев, вовлеченных в пролиферацию клеток, отсутствуют также некоторые гены, кодирующие модуляторы защитных реакций организма на инфекцию. В геноме ВОВ обнаружены две ОРТ, содержащие D-мотивы фосфорилазы: продукт гена F13L необходим для формирования внеклеточного вируса и для успешной передачи вируса от клетки к клетке; продукт гена K4L участвует в репликации вируса и культуре тканей, но не является строго необходимым (Blasco and Moss, 1991; Cao et al, 1997; Sung et al, 1997). У BOK к этим двум генам добавляется ген фермента, необходимого для липидного метаболизма, который является гомологом лизофосфолипазы (Antonie et al, 1988). В геноме BOO обнаружены все три ОРТ, кодирующие такие гены (C4L, C5L и C19L), аминокислотная последовательность этих ОРТ идентична последовательностям аналогичных ОРТ BOK-GRI более чем на 97%. Белки-иммуномодуляторы. Коэволюция «вирус-хозян» привела к развитию комплексной иммунной системы позвоночных и специфических вирусных стратегий, позволяющих вирусу избегать и преодолевать защитные реакции организма хозяина. Для поксвирусов как для агентов, вызывающих острую инфекцию, более важным является подавление ранних неспецифичных реакций организма на инфекцию. Поксвирусы обладают, пожалуй, самой сложной среди изученных вирусов системой модуляции иммунного ответа (Smith, 1993; Seet et al., 2003).
