Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8,
1.1. Lemnaceae: морфологическая, таксономическая и генетическая характеристика 8.
1.1.1. Ботаническая и таксономическая характеристика Lemnaceae 8.
1.1.2. Современная систематика и классификация семейства Lemnaceae 8.
1.1.3. Морфо-физиологическое описание представителей семейства Lemnaceae 9.
1.1.3.1. VojuLemna 10.
1.1.3.2. Род Spirodela 13.
1.1.3.3. PoRLandoltia 14.
lA.3.4.~PonWolffiella 14.
1.1.3.5. Род Wolffia 14.
1.1.4. Пути распространения Lemnaceae 15.
1.2. Использование Lemnaceae 15.
1.3. История филогении, систематики и таксономии Lemnaceae 16.
1.3.1. Таксономические и филогенетические отношения Lemnaceae 19.
1.3.2. Филогенетическое родство Lemnaceae и Агасеае
Существующие представления о возможном общем происхождении Lemnaceae и рода Pistia семейства Агасеае 24.
1.4. Геном растений и методы его исследования 28.
1.4.1. Уникальные последовательности генома растений 28.
1.4.2. Характеристика основных семейств генов растительного генома 29.
1.4.2.1. Семейство генов устойчивости растений 29.
1.4.2.2. Семейство MADS-box генов 31.
1.4.2.3. Семейство генов MYB транскрипционных факторов растений 31.
1.4.3. Молекулярные методы анализа растительного генома 32.
1.4.3.1. Метод AFLP-анализа 32.
1.4.3.2. Метод RAPD-анализа 33.
1.4.3.3. Метод DDP-анализа 33.
1.5. Исследование полиморфизма хлоропластного генома для определения таксономии и филогении растений 34.
1.6. Исследование полиморфизма митохондриального генома для определения таксономии и филогении растений 38.
Глава 2. Материалы и методы 41.
Глава 3. Результаты и обсуждение 47.
3.1. Молекулярный анализ ядерного генома Lemnaceae 47.
3.1.1. Анализ генома Lemnaceae RAPD методом 48.
3.1.2. Анализ генома Lemnaceae AFLP методом 52.
3.1.2.1. Подбор AFLP-комбинаций праймер/фермент, выявляющий внутри- и межвидовой полиморфизм у представителей Lemnaceae 52.
3.1.2.2. AFLP маркирование представителей Lemnaceae 53.
3.1.3. Комплексный анализ генетического разнообразия представителей Lemnaceae с использованием AFLP- и RAPD- систем молекулярного маркирования 55.
3.1.4. Молекулярный анализ основных адаптивно-значимых семейств
генов у представителей семейства Lemnaceae 58.
3.1.4.1. Молекулярный анализ семейства генов резистентности у
представителей Lemnaceae 58.
3.1.4.1.1. Подбор NBS-комбинаций праймер/фермент, выявляющий внутри- и межвидовой полиморфизм у представителей Lemnaceae 58.
3.1.4.1.2. NBS маркирование представителей Lemnaceae 59.
3.1.4.2. Молекулярный анализ семейства MADS-box генов и их аналогов у представителей Lemnaceae 63.
3.1.4.3. Молекулярный анализ семейства генов MYB факторов транскрипции у представителей Lemnaceae 67.
3.1.5. Сравнительный анализ полиморфизма адаптивно-значимых семейств генов и селективно-нейтральной части ядерного генома Lemnaceae 70.
3.1.6. Анализ полиморфизма гена рибосомального оперона J8Sy
представителей Lemnaceae 72.
Обсуждение полученных результатов 75.
3.1.7. Оценка внутривидовой полиморфизма Lemnaceae 82.
3.2. Анализ полиморфизма последовательностей хлоропластного генома Lemnaceae 87.
3.2.1. Полиморфизм последовательностей интрона гена rpSl 6 Lemnaceae 88.
3.2.2. Полиморфизм последовательностей спейсера trnT-trnY Lemnaceae 94.
3.2.3. Полиморфизм последовательностей спейсера trnT-trnL Lemnaceae 100.
3.2.4. Полиморфизм последовательностей спейсера trnh-tmF Lemnaceae 105.
3.2.5. Внутривидовой полиморфизм хлоропластного генома Lemnaceae на примере вида Spirodela polyrhiza 108.
3.2.6. Комбинированный анализ данных четырех областей хлоропластного генома Lemnaceae
(спейсеры trnT-trnL, trnT-trnY, trnL-trnFw интрон гена rpS16) 110.
Обсуждение полученных результатов по четырем областям хпДНК Lemnaceae 111.
3.3. Анализ полиморфизма последовательностей митохондриального генома Lemnaceae 117.
3.3.1. Характеристика протяженных инсерций в интроне Ъ/с гена nadl Lemnaceae 118.
3.3.2. Характеристика последовательности Ь/с интрона видов Lemnaceae 123.
3.3.3. Внутривидовой полиморфизм митохондриального генома у представителей Lemnaceae 125.
3.3.4. Анализ доменов интрона nadl представителей Lemnaceae 125.
3.3.5. Филогенетическое родство Lemnaceae и Агасеае на основе анализа полиморфизма интрона Ь/с гена nadl
митохондриального генома 129.
3.4. Филогенетические отношения у анализируемых видов Lemnaceae: данные молекулярного анализа ядерного, хлоропластного и
митохондриального геномов 134.
Заключение 136.
Основные выводы 139.
Список литературы
- Ботаническая и таксономическая характеристика Lemnaceae
- Семейство генов MYB транскрипционных факторов растений
- Подбор AFLP-комбинаций праймер/фермент, выявляющий внутри- и межвидовой полиморфизм у представителей Lemnaceae
- Полиморфизм последовательностей интрона гена rpSl 6 Lemnaceae
Введение к работе
Семейство Lemnaceae (рясковые) объединяет самые мелкие цветковые растения. Его представители отличаются значительной редукцией вегетативных и генеративных органов. Растения этого семейства формируют один листоподобный орган (от 0.3 мм до 12 мм), называемый фрондом. Небольшие размеры фронда, отсутствие четко дифференцированных вегетативных и генеративных органов ограничивает число ясно различимых таксономических дескрипторов.
Многие виды Lemnaceae космополитичны, ареал распространения их довольно широк, что создает дополнительные трудности в определении межвидовых и даже межродовых границ. К тому же, рясковые обладают нестабильным кариотипом, представители одного и того же вида могут иметь разный хромосомный набор (Landolt, 1986), исключая возможность определения видовых границ по кариотипу. В связи с вышесказанным, семейство Lemnaceae относят к одному из самых сложных в систематике цветковых растений (Stockey et al., 1997).
До сих пор до конца не определен таксономический статус самих Lemnaceae. Так, многими систематиками (Daubs.,1965, Stockey et al., 1997; Davis,1995, Duvall et al., 1994, French et al., 1995., Rothwell et al., 2004) Lemnaceae рассматривается как обособленный таксон внутри родственного семейства Агасеае (при этом сохраняя за Lemnaceae его таксономическое название с суффиксом, характерным для обозначения семейств растений) Согласно другим классификациям (Kimura.,1956, Cronquist, 1968, 1988, Hutchinson., 1973, Thorn., 1992) Lemnaceae присваивается статус семейства.
Помимо затруднений, возникающих при определении статуса Lemnaceae, существует ряд проблем по установлению филогенетических отношений внутри семейства, а также таксономических границ видов и родов, что было подтверждено недавним выделением из состава рода Spirodela вида S. punctata в отдельный род Landoltia (Les and Crawford., 1999). Кроме того, значительная редукция вегетативных и генеративных органов, возможная гибридная природа некоторых видов затрудняет определение видовых границ и видового состава Lemnaceae.
Данные трудности связаны с тем, что долгое время таксономии и филогении Lemnaceae не уделялось должного внимания, а представители рясковых использовались, в основном, в качестве внешних групп в таксономических и филогенетических исследованиях родственных семейств, таких как Агасеае. До настоящего времени не был оценен внутривидовой и межвидовой полиморфизм представителей Lemnaceae. Как было сказано выше, из-за отсутствия четко различимых дескрипторов оценка потенциального генетического разнообразия и реконструкция филогенетических отношений внутри
семейства на основе только лишь морфологии невозможна, что делает особенно актуальными молекулярные исследования, в том числе изучение нуклеотидного полиморфизма последовательностей ядерного и цитоплазматических геномов. Однако подобные исследования полиморфизма генома Lemnaceae практически не проводились. Две работы (Les et aL, 2002, Rotwell et al., 2004), основанные на оценке вариабельности нескольких участков хлоропластного генома (последовательности генов malK и rbcL, интроны генов trnK и грПб и спейсер IrnL-tmF), дали неоднозначные результаты, которые, как отмечали сами авторы, нуждаются в дальнейших исследованиях.
С учетом такой малой изученности семейства Lemnaceae, целью данной работы явился комплексный молекулярный анализ, охватывающий различные участки как ядерного, так и хлоропластного и митохондриального геномов Lemnaceae. Данное исследование было сфокусировано в основном на видах, произрастающих на территории Российской Федерации.
Для достижения поставленных целей сформулированы следующие задачи: 1. Провести молекулярный RAPD и AFLP анализ вариабельности селективно-нейтральных областей ядерного генома, а также последовательностей адаптивно-значимых семейств генов (семейство NBS-генов устойчивости, семейство MADS-box-гомеозисных генов, семейство MYB-транскрипционных факторов) представителей 8 видов 4 родов семейства Lemnaceae, собранных на территории Российской Федерации. Определить уровни межродового, межвидового и внутривидового полиморфизма последовательностей ядерного генома.
На основе RAPD, AFLP и DDP маркирования провести комплексный анализ внутривидового полиморфизма ядерного генома L.minor, L.trisulca и S.polyrhiza для выявления возможной корреляции между степенью вариабельности нуклеотидных последовательностей и географической удаленностью образцов, а также природно-экологическими условиями.
Провести анализ полиморфизма хлоропластного генома 24 образцов 4 родов 9 видов Lemnaceae. Охарактеризовать последовательности трех межгенных участков (trnL-trnF, trnT-tmL, tmT-trnY) и интрона гена rpS16.
Провести анализ вариабельности интрона Ь/с гена nadl митохондриального генома Lemnaceae. Охарактеризовать основные домены и мотивы интрона Ь/с гена nadl рясковых, характерные для нитронов группы II и определяющие вторичную структуру.
На основе комплексного молекулярного анализа ядерного, хлоропластного и митохондриальных геномов провести оценку филогенетических отношений анализируемых видов и родов Lemnaceae.
Ботаническая и таксономическая характеристика Lemnaceae
Рясковые представляют собой один из крайних вариантов приспособления к водной среде обитания. Они утратили или сильно упростили большинство органов, характерных для основных представителей цветковых растений.
Представители семейства Lemnaceae - многолетние травянистые растения, плавающие на поверхности воды, как большинство рясковых или в толще воды, как ряска трехдольная (L. trisulca). При этом Lemnaceae способны существовать некоторое время (до нескольких дней) вне водной среды на дне пересохших водоемов, либо на оперении водоплавающих птиц (Landolt, 1997).
Вегетативное тело Lemnaceae представлено специфическим листоподобным органом, называемым фрондом, который не дифференцирован на лист и стебель. Окраска фронда может быть от бледной до темно-зеленой, нижняя сторона листовой пластинки у некоторых видов красновато-пурпурная из-за наличия антоциана.
Корневая система представлена одним (род Lemnd) или несколькими (род Spirodela, Landoltia) корнями. У некоторых представителей семейства (виды родов Wolffia и Wolffielld), корень вообще отсутствует.
В основании фронда имеется один или два зародышевых кармашка, служащих для вегетативного размножения, заключающегося в образовании дочерних фрондов. В зародышевых кармашках, кроме того, могут образовываться генеративные органы -соцветия, которые представляют собой початки, упростившиеся до нескольких мужских и одного женского цветка. Цветки не имеют околоцветника, мужские состоят из 1 или 2 тычинок, а женский - из одного пестика (рис. 1.2.).
Цветут Lemnaceae крайне редко (раз в несколько лет). Перед цветением, которое происходит во второй половине лета, образуются специальные, так называемые, плодущие листоподобные пластинки, отличающиеся меньшими размерами и более темной окраской. Опыление производят, по-видимому, мелкие насекомые (в начале цветения) и ветер (в конце цветения). Плоды округлые, снабженные на нижней стороне крыловидным выростом - килем, который облегчает плавание. Через некоторое время плоды разрушаются, а семена либо прорастают, либо погружаются на дно водоемов до весны. Так же перезимовывают и листовые пластинки, которые перед наступлением холодной погоды накапливают большое количество утяжеляющего их крахмала. Некоторые виды способны образовывать осенью мелкие темно-коричневые тельца — турионы, которые опускаются на дно водоемов и таким образом перезимовывают (herba.msu.ra/shipunov/autlior/shipunov2004b.pdf).
Данный род состоит из четырех секций, которые объединяют 14 видов (табл.1.1.). Вегетативное тело плоское (за исключением вида L.gibba), продолговато-округлое с 1-3 жилками, обычно 2-5 мм в длину (у L.trisulca — до 10 мм).
L.minor (рис. 1.2.А.). Фронд плоский, гладкий, овальной формы, обычно симметричный, 2-4 мм в длину, имеет три жилки и один корень. Правильная симметрия листовой пластинки и отсутствие красноватой антоциановой окраски на внутренней поверхности фронда являются отличительными признаками, по которым, как считается, можно различить L.minor от негиббоидных форм вида L.gibba.
На поверхности воды растения L.minor плавают одиночными фрондами или соединенными по 3-5 пластинок. Вид L.minor является видом-космополитом с широчайшим ареалом обитания охватывающий оба полушария (рис. 1.2.Б). Вид L.minor широко распространен на территории Северной и Южной Америки, Европы, Азии, в том числе и России, Австралии и Новой Зеландии (интродуцированы).
L.minor (стрелкой указан цветок). Б Карта распространения L.minor (www.mobot.org/ j wcross/duckweed/) L.trisulca. Наиболее морфологически легко отличимый вид из рода Lemna (рис. 1.3.) Вегетативное тело L.trisulca уплощенное, фронд ланцетовидной формы, длиной 6-10 мм, 3 жилки, средняя из которых наиболее заметна. Растения часто соединены между собой тонкими стеблями в ветвистую цепь по 10-30 штук, формируя спутанный клубок, плавающий в толще воды. Корни отсутствуют или может присутствовать один корень. Данный вид произрастает в районах с прохладным климатом, обитает в прохладных реках, прудах и болотах, часто встречается в водоемах, расположенных в горных низинах. L.trisulca широко распространенный вид, ареал которого охватывает территории Европы, Африки, Азии и Австралии. Интересно, что на территории Южной и Северной Америк L. trisulca встречается только на Аляске. Рис. 1.3. Ltrisulca.
L.gibba. Фронд округлый, 3-5 мм в длину, с тремя жилками, часто асимметричен, имеет антоциановую окраску на внутренней стороне, с одним корнем. Главным отличительным признаком данного вида является наличие на внутренней поверхности фронда клеток аэренхимы с большими воздухоносными полостями (до 0.3 мм), что придает нижней стороне листовой пластинки горбатую (гиббоидную) форму (рис. 1.4.А). Степень гиббоидности может зависеть от условий окружающей среды. Негиббоидные формы L.gibba трудноотличимы от L.minor, что создает трудности при идентификации этих видов. Вид широко распространен в областях с теплым умеренным и тропическим климатом, включая Северную и Южную Америку, Европу, Африку и Азию (рис. 1.4 Б.). Рис. 1.4. A. Lgibba. Б. Карта распространения L.gibba (//wwwmobot.org/jwcross/duckweed/) L.turionifera. Фронд плоский, округлой или овальной формы, 2-4 мм в длину. Наружная поверхность листовой пластинки обычно блестящая, темно-зеленой окраски, покрытая мельчайшими узелками вдоль средней линии (рис. 1.5.А). Растения L.turionifera осенью образуют мелкие темно-зеленые или коричневые дочерние пластинки - турионы, которые в дальнейшем отделяются от материнского растения. Вид широко распространен на территории Северной Америки (США и Канада) и имеет ограниченные ареалы на территории России (Дальний Восток, Центральная и Западная Сибирь) (рис. 1.5
Семейство генов MYB транскрипционных факторов растений
Метод детекции полиморфизма длин амплифицированных фрагментов - AFLP (amplified fragment length polymorphism) позволяет исследовать обширную, преимущественно селективно нейтральную, часть генома, представленную, главным образом, уникальными и умеренноповторяющимися последовательностями.
В качестве ДНК-матрицы для амплификации используются фрагменты геномной ДНК, предварительно рестрицированньте двумя различными эндонуклеазами и лигированньте с соответствующими адаптерами (Vos et al., 1995).
AFLP-метод отличается высокой разрешающей способностью. Применение лишь одной праймерной комбинации позволяет маркировать в среднем от 50 до 150 полиморфных ДНК локусов. AFLP-система маркирования считается доминантной, хотя была показана возможность идентификации и гетерозигот (Каїр and Edwards, 1997).
В настоящее время AFLP-метод является наиболее широко используемым методом молекулярного анализа и маркирования генома растений. Так метод AFLP применяется, прежде всего, для определения молекулярной систематики, включающей идентификацию видов и определения таксономических границ, выявления филогенетических отношений у различных таксонов растений, а также для анализа геномного полиморфизма, определения структуры популяций (Syed et al., 2006, Chen et al., 2006, Pellmyr., 2007, Hipp, Weber., 2008, Warwick et al., 2008, Pleines, Blattner., 2008, Liu, Zhang., 2008, McKinnon et al., 2008). Кроме того, AFLP-маркеры применяются в анализе меж- и внутривидовых различий у ботанически сложных таксонов с возможностью выявления полиплоидных комплексов (Bottini et al., 2002).
RAPD {random amplified polimorphic DNA) - метод произвольно амплифицированной полиморфной ДНК, аналогично AFLP-методу позволяет исследовать главным образом селективно-нейтральные уникальные и умеренно повторяющиеся последовательности генома. Благодаря простоте исполнения, метод получил весьма широкое распространение и используется для анализа генетического разнообразия различных растительных таксонов (Loarce et al., 1996; Кочиева и др., 2002, Kocsis et al., 2005, Zhang et al, 2008, Stuart et al., 2008, Ebraliimi et al., 2009), в популяционных и эволюционных исследованиях, а также при построении филогении, решения вопросов систематики растений (Троицкий, 1999, Sharma, Jana, 2002, Garkava-Gustavsson, Nybom., 2007, Jacobson and Hedren., 2007, Karatas and Agaoglu., 2008, Ercisli et al., 2008) и для целей генетического картирования (Grattapaglia, 1994, Binelli, Bucci, 1994, Barreneche et al., 1998, Brown, Myers , 2002, Oliveira et al., 2004, Masuzaki et al., 2008).
Метод домен направленного маркирования - DDP (domain directed profiling) и его модификации - методы NBS-маркирования (NBS-profih ng), MADS-маркирования (MADS-box profiling) и маркирования MYB транскрипционных факторов (MYB-profiling), основаны на использовании при селективной амплификации специфических 20-24-нуклеотидных вырожденных праймеров, гомологичных последовательностям консервативных доменов таких как, например, NBS-домен генов устойчивости, MADS-box домен гомеозисных генов или же MYB-домен транскрипционных факторов (van der Linden et al., 2002,2004, Syed et al., 2006).
В отличие от вышеперечисленных методик, маркирующих в основном селективно нейтральные последовательности генома, метод DDP позволяет исследовать совершенно иную его часть, представленную, главным образом, адаптивно-значимыми, и подверженными давлению отбора, последовательностями основных семейств генов растений (van der Linden et al., 2004). Так как данный метод разработан недавно и, в первую очередь, с целью исследования генов резистентности растений, наибольшее распространение получила именно методика NBS-маркирования (Linden et al., 2004).
В настоящее время NBS-анализ используется в исследованиях генетического разнообразия локусов устойчивости (RGA-локусов) сортов многих культурных растений (картофель, томат, пшеница, салат и др.), а также их дикорастущих родственных видов (van der Linden et al., 2002, 2004, Calenge et al, 2005, Syed et al., 2006, Mantovani et al., 2006, Кочиева и Рыжова., 2009). К тому же NBS-маркирование представляет собой
интерес в контексте исследования влияния интрогрессии и потока генов от культурных форм в дикорастущие, что было показано на популяциях салата и цикория (Syed et al., 2006). DDP метод используется для изучения эволюции генов резистентности видов обладающих различным статусом в отношении устойчивости к патогенам, характеристике коллекции генбанков (Mantovani et al., 2006), а так же для разработки кодоминантных специфических маркеров и насыщения генетических карт (van der Linden et al., 2002, Syed et al., 2006).
В настоящее время вариабельность последовательности хлоропластной ДНК является одной из основных источников определения филогении растений, что может конкурировать только с полиморфизмом ITS последовательностей рибосомального оперона ядерного генома (Baldwin., 1992, Baldwin et.al., 1995, Alwarez and Wendel, 2003).
Подбор AFLP-комбинаций праймер/фермент, выявляющий внутри- и межвидовой полиморфизм у представителей Lemnaceae
Помимо анализа вариабельности случайных, как правило, селективно-нейтральных участков генома, представляло интерес исследование адаптивно-значимых семейств растительных генов у представителей Lemnaceae. Новая система молекулярного анализа, методика домен-направленного маркирования (DDP-domain directed profiling) (Van der Linden et al., 2004), позволяет селективно амплифифицироватъ определенные семейства генов ядерного генома с использованием специфических праймеров, гомологичных последовательностям их консервативных доменов.
Как было отмечено ранее (гл. 1), на основе метода DDP-профайлинга для семейств растительных генов, характеризующихся присутствием консервативных специфических доменов, были разработаны его модификации - методы маркирования семейства генов резистентности (NBS-профайлинг), гомеозисных генов (MADS-box профайлинг) и маркирования генов MYB-транскрипционных факторов (MYB - профайлинг).
Исследование генетического полиморфизма адаптивно-значимых семейств генов, особенно генов резистентности и гомеозисных генов, у представителей рясковых представляет интерес не только с позиций теоретического интереса, но также с практической точки зрения оценки адаптивности и пластичности генома растений Lemnaceae, способных выживать и размножаться в крайне агрессивных средах (загрязнение ракетным топливом, солями тяжелых металлов, отходами химической промышленности) при значительной редукции практически всех вегетативных органов до одной листоподобной пластины-фронда.
Кроме того, представляло интерес определение филогенетических отношений Lemnaceae, установленное на основе анализа данных вариабельности трех семейств генов и исследование вопроса, в какой степени, полученные дендрограммы, отражающие филогенетическое родство Lemnaceae будут конгруэнтньь или неконгруэнтны таковым, построенным по данным маркирования случайных последовательностей генома.
Первым этапом проведения NBS маркирования семейства генов резистентности бьш подбор NBS-комбинаций праймер/фермент, позволяющий выявлять внутри- и межвидовой полиморфизм генома Lemnaceae. Так же как и при AFLP, подбор праймерных комбинаций и рестрицирующих эндонуклеаз проводился на выборке из 10 образцов ДНК, включающих представителей видов Lemna minor, Lemna trisulca, Spirodela polyrhiza, Landoltia punctata, Wolffia arrhiza.
В качестве праймеров были использованы последовательности, гомологичные двум основным консервативным мотивам NBS-домена: Р-петли и киназы-2, позволивпгае маркировать как 3 -, так и 5 - области (рис.3.7). Так, праймеры NBS1 и NBS3 маркировали последовательность Р-петли NBS-домена и обеспечивали амплификацию в 5 -направлении, включающем последовательности TIR/nonIR доменов. Праймеры NBS5A и NBS6, в свою очередь, были гомологичны последовательности мотива киназы-2 и приводили к амплификации NBS-фрагментов,- главным образом, включающих 3 -конец NBS-домена (рис.3.7).
В результате проведенного предварительного анализа были получены воспроизводимые спектры NBS-фрагментов для следующих четырех комбинаций NBS-праймер/фермент: NBSl/Rsal, NBS3/MseI, NBS5A/MseI и NBS6/MseI. Наибольшим количеством воспроизводимых спектров (105) характеризовалась комбинация праймер/фермент NBS5 A/Msel, которая и была отобрана для дальнейшего анализа.
3.1.4.1.2. NBS маркирование представителей Lemnaceae.
В анализ были взят тот же набор образцов ДНК 84 представителей Lemnaceae, (табл. 2.1.), как для RAPD/AFLP анализа. Для проведения NBS профайлинга было использовано сочетание праймер/фермент NBS5A/MseI. Длины полученных NBS фрагментов варьировали в пределах 70-550 п.н. (рис. 3.8).
Всего было-получено 118 полиморфных NBS-фрагментов. Детальный анализ NBS-спектров позволил выявить ряд видо- и образецспецифичных фрагментов. Что касается Lemna, то для этого рода было обнаружено всего два родоспецифичньгх фрагмента. Поскольку взятые в исследование образцы видов (L.minor, L.trisulca, L.aequinoctialis, L.turionifera, L.japonicd), а в особенности L.aequinoctialis, обладали достаточно большим видовым полиморфизмом, общих родоспецифичньгх фрагментов для всех пяти видов Lemna было выявлено мало. Также были обнаружены фрагменты, общие для представителей видов Lemna trisulca и Spirodelapolyrhiza, а также общие для всех Lemnaceae.
В результате проведенного анализа было показано, что каждый вид рясковых характеризовался определенным набором NBS-фрагментов. Наиболее полиморфными и богатыми специфическими фрагментами были NBS-спектры образцов L. trisulca. Нужно отметить, что для образцов Ljaponica, так же как и в случае RAPD и AFLP анализа, специфичных фрагментов идентифицировано не было. Представители Ljaponica не отличались видоспецифичностью спектров от образцов L.turionifera и в дальнейшем эти два вида рассматривались как комплекс видов L.japonica/L.lurionifera. Хотелось бы особо подчеркнуть, что образцы видов L.japonica/L.turionifera были бедны видоспецифичными фрагментами и, практически всегда, спектр их фрагментов совпадал с набором фрагментов образцов L.minor. Эти два вида обнаружили только два общих для комплекса L.japonica/L.turionifera специфичных фрагмента.
В результате полученных данных по NBS-маркированию Lemnaceae была рассчитана матрица генетических расстояний (GD) (таблица 3.3). Было установлено, что внутривидовой полиморфизм исследовавшихся видов рясковых варьировал в пределах от 0.02 (образцы видов L.turionifera/L.japonica) до 0.10 (образцы L.aequinoctialis). В свою очередь, межвидовое разнообразие семейства Lemnaceae, как правило, варьировало в пределах от 0.16 (L.minor-L. turionifera) и до 0.31 (L.minor - L.aequinoctialis).
Так же как и при RAPD и AFLP анализе значения GD между L.aequinoctialis и остальными видами Lemna (0.26-0.31) были велики и сравнимы со значениями межродовых генетических различий в парах Spirodela - Landoltia, Spirodela - Lemna, Landoltia - Lemna, которые достигали значений 0.20-0.30 (0.25); 0.19-0.31 (0.26); 0.25-0.35 (0.31), соответственно. Род Landoltia, как следует из полученных значений генетических расстояний, так же как и в случае AFLP и RAPD, обнаруживал большее генетическое сходство со Spirodela. По результатам анализа вариабельности генов резистентности род Wolffia оказался ближе к Spirodela и Landoltia, чем к Lemna.
Полиморфизм последовательностей интрона гена rpSl 6 Lemnaceae
Результаты, полученные с использованием методов, анализирующих функционально различные области ядерного генома, значительно коррелировали между собой. Значения генетических различий на разных таксономических уровнях как селективно-нейтральных, так и в основном генных областей генома Lemnaceae совпадали. Так, и по RAPD данным, и по данным AFLP и DPP анализа значения межродовых расстояний (GD) варьировали в пределах О 17-0 32, межвидовых (внутри родаХепзиа) 0.12-0.32 и внутривидовых 0.01-0.10.
Полученные результаты показали, что уровень межродового полиморфизма у Lemnaceae ниже, чем у родственного семейства Araceae. Так, проведенный ранее AFLP анализ межродового родства представителей пяти родов Araceae [Caladium, Protarum, Hapaline, Alocasia, Xanthosoma), относящихся к двум подсемействам (Aroideae и Colocasioideae), показал, что межродовые генетические расстояния варьируют в пределах 0.83-0.90 (Loh et al., 2000).
Низкий уровень родства (GD 0.92) также был обнаружен и при AFLP анализе геномного полиморфизма шести других родов Araceae (Spathiphyllum, Alocasia, Dieffenbachia, Pliylodendron, Anthyrium, Aglonema), представляющих три подсемейства (Chen et al., 2006).
Такая огромная разница в значениях может объясняться тем, что Araceae является обширнейшим семейством, включающее более 100 родов, 8 подсемейств, объединяющих более чем 3700 видов, морфо-физиологически крайне разнообразных, и взятые в исследование представители различных родов Araceae представляли разные и достаточно отдаленные друг от друга подсемейства Тогда как Lemnaceae является относительно немногочисленным (2 подсемейства, 5 родов, 38 видов) семейством, к тому же с очень специфической морфологией органов, приспособленной только к водной среде обитания.
Как было сказано выше, выявленные межвидовые различия у представителей рода Lemna составили 0.12-0.32 Проведенный анализ межвидового родства четырех видов Caladium (Агасеае) выявил более высокий уровень генетического разнообразия (GD 0.26-0.84), чем у Lemna (Loh et al., 2000). Однако авторами было показано, что такое значительное варьирование в значениях GD произошло вследствие входящего в состав Caladium вида С. lindenii, который в прошлом относился к роду Xanthosoma, в то время как геномные различия между остальными тремя родами не превышали значения 0.26 (Loh et al., 2000), то есть были сопоставимы с данными по Lemna.
Исходя из того, что почти все рясковые размножаются вегетативно, было интересно сравнить внутривидовую вариабельность у Lemnaceae с самоклональной вариабельностью 19 сортов семи видов Syngonium (AFLP метод) (Chen et al., 2006). Самоклоны Syngonium характеризовались низким уровнем вариабельности (GD 0.01-0.02), тогда как значения внутривидовой вариабельности видов L.minor (0.02-0.15), L.trisulca (0.01-0.17) и S.polyrhiza (0.04-0.16) варьировали в более широких пределах Таким образом, на основании AFLP, RAPD и DDP маркирования была впервые проведена оценка полиморфизма ядерного генома Lemnaceae. Анализ геномного полиморфизма рясковых позволил определить степень генетического разнообразия как на межродом и межвидовом, так и внутривидовом уровнях
Оценка полиморфизма адаптивно-значимых семейств генов и возмоэюностъ использования метода DDP- профайлинга для решения таксономических и филогенетических задачу Lemnaceae.
Впервые проведенный анализ вариабельности трех адаптивно значимых семейств генов (MADS-box гены, семейство MYB транскрипционных факторов, семейство NBS генов устойчивости) у Lemnaceae показал, что данные генные семейства могут с успехом применяться для оценки генетического разнообразия и филогенетических отношений на разных таксономических уровнях. Метод DDP-профайлинга и его модификации (MADS-box-профайлинг, MYB-іірофайлинг, NBS-профайлинг) является относительно новым методом изучения геномного полиморфизма таких растений как картофель, томат, ячмень, латук (van der Linden et al., 2004) и поэтому на сегодняшний день вариабельность этих семейств генов у большинства видов практически не изучена. Существует относительно небольшое количество исследований, посвященных изучению полиморфизма генных семейств (Mantovani et al., 2004; van der Linden et al., 2004; Calenge et al., 2005; Кочиева и др., 2007; Zhang et al., 2007).
В настоящее время наибольший интерес привлекает анализ вариабельности генов устойчивости. Поэтому, анализ вариабельности семейства генов устойчивости и поиск новых источников устойчивости в геномах различных как культурных, так и дикорастущих видов, представляет одну из ключевых задач при изучении молекулярных основ формирования резистентности к патогенам у растений, взаимосвязи патогенного фона, процессов видовой специализации, а также взаимосвязи степени полиморфизма NBS локусов и адаптивности видов (van der Linden et al., 2004; Кочиева и Рыжова, 2009).
Так, в работе П.Мантовани с соавторами (Mantovani et al., 2004) была проведенена сравнительная оценка вариабельности 58 образцов T.durum, проведенная методами NBS, AFLP и SSR маркирования. Также как и при анализе Lemnaceae, построенные дендрограммы были конгруэнтны и показана существенная корреляция между значениями генетических расстояний, определенных с использованием различных методов маркирования. Как отмечали авторы, полученные результаты ясно свидетельствуют, что метод NBS маркирования может успешно применяться в дальнейших исследованиях оценки генетического разнообразия и выявления филогенетических связей (Mantovani et al., 2004). Метод NBS-маркирования был использован для исследования вариабельности семейства генов устойчивости у дикорастущих и культивируемых видов рода Solarium (секц. Petota), а также у культурных и дикорастущих представителей вида перцев С.аппиит (Кочиева и др., 2007, Кочиева и Рыжова, 2009).
С использованием NBS-профайлинга была проведена таксономическая оценка сложного комплекса видов Solanum brevicaule, что позволило выделить внутри этого комплекса две видовые группы, приуроченные к географическим ареалам обитания (Ryzhova et al., 2007), что полностью совпало с данными AFLP и морфофизиологического анализа (van den Berg et al., 1998, Miller and Spooner, 1999, Spooner et al., 2005.)
