Содержание к диссертации
Принятые сокращения 3
ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Геном аденовирусов и его экспрессия 7
-
Строение генома аденовирусов ?
-
Экспрессия генома аденовирусов Ю
-
Ранняя фаза инфекционного цикла Ю
-
Поздняя фаза инфекционного цикла ^
1.1.3. Информационные РНК (мРНК) аденовирусов. . 19
1.2. Структурные белки аденовирусов 31
-
Физико-химические свойства 31
-
Иммунологические свойства 36
1.3. Трансляция мРНК эукариот в бесклеточных системах 39
-
Особенности мРНК эукариот 39
-
Системы бесклеточной трансляции 43
-
Бесклеточная трансляция мРНК аденовирусов 48
-
Трансляция мРНК аденовирусов в системах 51 in 7ҐІ7ГО
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 54
-
Материалы 54
-
Методы исследования 56
-
Получение бесклеточной системы из лизата ретикулоцитов 56
-
Выделение РНК вируса табачной мозаики . . 57
-
Выделение поздних мРНК аденовирусов ... 58
-
Выделение поли(А)-содерясащей фракции мРНК 59
-
Выделение глобиновой мРНК ... 60
-
Получение С и S-меченых in nw белков аденовирусов 60
-
Трансляция РНК в бесклеточной системе . . 61
-
Обработка проб после трансляции 62
-
Диск-электрофорез белков в полиакриламидном геле
2.2.10. Авторадиография 64
2.2.П. Очистка антигексоновых антител с помощью
иммуноаффинной хроматографии 64
2.2.12. Удаление примеси антител против гексона
из препарата антиотростковой сыворотки. . 65
-
Радиоиммунопреципитационный анализ. ... 65
-
Олигопептидный анализ гексонов аденовирусов бб
-
Электрофорез мРНК в полиакриламидном геле 67 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 69
3.1. Выделение поздних мРНК аденовирусов и их физико-
химическая характеристика 69
-
Получение препаратов РНК из клеток, зараженных аденовирусами ........... 69
-
Электронно-микроскопический и электрофоре-тический анализ мРНК 73
3.2. Бесклеточная трансляция мРНК аденовирусов ... 78
-
Оптимизация бесклеточной системы из рети-кулоцитов 78
-
трансляционная активность мРНК SA7 и AdI 85
3.3. Характеристика продуктов трансляции бесклеточ
ной системы из ретикулоцитов 89
-
Электрофоретический анализ продуктов трансляции 89
-
Олигопептидное картирование гексонов аденовирусов SA7 и AdI 97
-
Идентификация продуктов трансляции методом тп_ радиоиммунопреципитационного анализа . . . IUd
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 109
ВЫВОДЫ 122
ЛИТЕРАТУРА . ..... 123
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
РНК - рибонуклеиновая кислота
мРНК - информационная (матричная) РНК
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ГТФ - гуанозинтрифосфорная кислота
ДСН - додецилсульфат натрия
HEPES - (2-оксиэтил) пиперазин-^'-2-этансульфоновая кислота
РРО - 2,5-дифенилоксазол
ЭГТА - этиленгликоль бис- /У,-//-тетраацетат
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
ВТМ - вирус табачной мозаики
Мол.масса - молекулярная масса
ПААГ - полиакриламидный гель
Д,кД,мД - дальтон, килодальтон, мегадальтон
Трис - трис-(оксиметил)-аминометан
Н.п. - нуклеотидные пары
дЦМФ - дезоксицитидин монофосфорная кислота
ДСБ - ДНК - связывающий белок аденовирусов
ТБ - терминальный белок аденовирусов
ТХУ - трихлоруксусная кислота.
- Ц. -
Введение к работе
Среди значительного многообразия ДНК-содержащих вирусов особый интерес представляют аденовирусы. Это связано в первую очередь с широким спектром заболеваний, вызываемых аденовирусами не только у человека, но и у ряда сельскохозяйственных животных и птиц. Кроме того, геном аденовирусов обладает онкоген-ными и трансформирующими свойствами, что имеет большое значение для исследования процессов превращения нормальной клерки в опухолевую на молекулярном уровне. Аденовирусы являются также удобной экспериментальной моделью для выяснения механизмов экспрессии и репликации эукариотических геномов. Особенно важным в этом смысле представляется изучение продуктов экспрессии аденовирусного генома на разных стадиях инфекционного цикла.
Наибольший интерес из вирус-специфических продуктов трансляции поздних мРНК аденовирусов представляют главные капсидные белки аденовирусов гексон и отросток. Именно эти белковые компоненты, по-видимому, наиболее важны с точки зрения получения про-тивоаденовирусных вакцин и диагностикумов ввиду того, что не только индуцируют образование вирус-нейтрализующих антител, но и являются основными структурными белками аденовирусов, составляя в сумме более 60% массы белков аденовириона.
Разработка генно-иняенерных подходов к биотехнологии вакци-/Онных и диагностических препаратов открывает перспективу дешевого микробиологического синтеза безопасных и эффективных вакцин и диагностикумов в виде индивидуальных капсидных белков. Однако для этого требуется выяснить, обладают ли такие структурные полипептиды аденовирусов, как гексон и отросток, антигенной и им-муногенной активностью при условии их синтеза в рекомбинантных микроорганизмах. Одним из подходов к решению этой проблемы является изучение особенностей структуры и антигенной активности гексона и отростка в условиях, приближенных к микробиологическому синтезу. Поэтому синтезированные в бесклеточных системах полипептиды гексона и отростка могут являться вполне адекватными объектами для такого исследования.
Целью настоящей работы явилась идентификация продуктов бесклеточной трансляции поздних мРНК аденовирусов обезьян SA7 и человека Adl, а также сравнение их по физико-химическим и иммунологическим характеристикам с соответствующими капсидными белками аденовирусов.
В связи с этим в задачи исследования входило:
1) выделить и охарактеризовать биологически активные пре параты мРНК аденовирусов обезьян SA7 и человека Adl на поздней стадии инфекционного цикла;
2) провести в бесклеточной системе из ретикулоцитов кроли- у ка трансляцию поздних мРНК SA7 и Adl с полным и эффективным син тезом аденовирусных полипептидов;
3) провести сравнительный анализ структуры и антигенной активности полипептидов гексона аденовирусов, синтезированных in vivo и in vitro , а также полипептидов отростка, синтезированных in vivo и in Уі'ІґО .
В работе впервые проведен электронномикроскопический и электрофоретический анализ гетерогенной популяции молекул РНК аденовируса обезьян .SA7. Впервые показано наличие низкомолекулярных вирус-ассоциированных РНК у аденовируса обезьян А7.
Впервые проведен сравнительный анализ первичной структуры гексонов аденовируса обезьян 5А7 и аденовируса человека Adl, синтезированных in vivo и in vitro , что позволило подтвердить - б - адекватность синтезированного in vitro гексона нативному гексону.
Впервые прямо показано, что в бесклеточной системе из ре-тикулоцитов кролика гексон аденовирусов синтезируется в форме полностью завершенных мономеров, не обладающих антигенной активностью нативного гексона. Показано наличие антигенной активности у полипептида отростка 5А7, синтезированного в бесклеточной системе из ретикулоцитов.
Работа в общем носит теоретический характер, однако представленные в ней результаты могут быть использованы при разработке подходов к получению противоаденовирусных вакцин и диаг-ностикумов.
В результате проведения настоящего исследования на защиту выносятся следующие положения:
При трансляции в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика поли(А)-содержащих поздних мРНК аденовирусов человека Adl и обезьян Ш происходит синтез полноразмерных полипептидов гексона и отростка.
Проведенный в данной работе сравнительный анализ структуры и антигенной активности полипептидов гексонов SA7 и Adl, синтезированных In vivo и in vitro позволяет доказать идентичность размеров и первичной структуры гексоновых полипептидов А7, а также гексоновых полипептидов Adl. Синтезированный in vitro / полипептид гексона не обладает антигенной активностью нативного гексона и не способен к формированию тримеров.
3. Полипептид отростка SA7, синтезированный in vitro иден тичен по размеру, первичной структуре и антигенной активности отростку 5А7, синтезированному in Vivo . - ч -
