Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 12
2.1. Характеристика вируса клещевого энцефалита 12
2.2. Строение и свойства ВКЭ 18
2.3. Репликативный цикл флавивирусов 24
2.4. Генетическое разнообразие ВКЭ и географическое распределение генотипов 28
2.5. Клиническая характеристика КЭ 32
2.6. Клинические особенности заболевания в зависимости от генотипа ВКЭ 3 8
2.7. Молекулярные основы патогенности ВКЭ 41
2.8. Методы филогенетического и эволюционного анализа 48
2.9. Патогенные бактерии и простейшие, переносимые клещами 55
2.9.1. Клещевой боррелиоз 56
2.9.2. Клещевой эрлихиоз 58
2.9.3. Клещевой риккетсиоз 5 9
2.9.4. Клещевой бабезиоз 60
2.9.5. Клещевые бартонеллезы 61
2.10. Заключение 62
3. Материалы и методы 64
3.1. Химические реактивы, ферменты и наборы 64
3.2. Исследованные образцы 65
3.3. Пробоподготовка и выделение РНК, ДНК 67
3.4. Обратная транскрипция 67
3.5. Полимеразная цепная реакция 67
3.6. Электрофоретический анализ и выделение ампликонов из геля 71
3.7. Определение нуклеотидных последовательностей 71
3.8. Анализ последовательностей 71
3.9. Построение и анализ вторичных структур ДНК и белков, выявление потенциальных сайтов модификации белков 72
4. Результаты и обсуждение 74
4.1. Расчет олигонуклеотидных праймеров 74
4.2. Сравнение филогенетической значимости 5'-НТО и гена белка Е ВКЭ 77
4.3. Исследование клещей, собранных в городских и пригородных биотопах г. Томска 80
4.3.1. Встречаемость и генетическое разнообразие ВКЭ 80
4.3.2. Встречаемость и генетическое разнообразие Borrelia spp. 85
4.3.3. Встречаемость и генетическое разнообразие Rickettsia spp. 87
4.3.4. Встречаемость и генетическое разнообразие Ehrlichia spp. 90
4.3.5. Микст-инфекции 91
4.4. Вариабельность 5'-НТО вариантов ВКЭ, обнаруженных в г. Томске и его пригородах 92
4.5. Описание биологических свойств и анализ генома штамма Глубинное/2004 98
Заключение 116
Выводы 120
Список использованной литературы. 122
- Репликативный цикл флавивирусов
- Патогенные бактерии и простейшие, переносимые клещами
- Пробоподготовка и выделение РНК, ДНК
- Сравнение филогенетической значимости 5'-НТО и гена белка Е ВКЭ
Введение к работе
Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) был открыт в 1937 г. на Дальнем Востоке СССР (Зильбер, 1939) и является прототипным представителем одноименного серокомплекса, в который включают ВКЭ, вирус омской геморрагической лихорадки (ОГЛ), вирус Лангат, вирус Повассан (ВП), вирус Киассанурской лесной болезни, вирус шотландского энцефаломиелита овец и др. Основными переносчиками ВКЭ являются иксодовые клещи Ixodes persulcatus и Ixodes ricinus; заражение происходит при присасывании зараженного клеща, а также при употреблении молока от зараженных коров и коз (Погодина, 1958). ВКЭ вызывает у людей заболевание центральной нервной системы с уровнем смертности 1-30% (Погодина и др., 1986, Злобин и Горин, 1996), называемое клещевым энцефалитом (КЭ).
В Российской Федерации в период с 1990-х по 2000 год отмечен резкий подъем заболеваемости КЭ вплоть до 11000 случаев в год (Львов и Злобин, 2007). В настоящее время средняя заболеваемость КЭ в Российской Федерации снизилась, однако в ряде регионов Урала, Сибири и Дальнего Востока рост заболеваемости (до 30 случаев КЭ на 100 тыс. населения) наблюдается и в настоящее время (Львов и Злобин, 2007). По данным Роспотребнадзора, ежегодно в Российской Федерации регистрируется от 232 тыс. до 318 тыс. человек, пострадавших от укусов клещей (http://www.rospotrebnadzor.ru). Среди пострадавших доля привитых лиц составляет не более 7-9%, а экстренную серопрофилактику получает не более 53-57%. Роспотребнадзором РФ охват населения вакцинацией и экстренной профилактикой КЭ признан недостаточным. На низком уровне остаются также экстренная дифференциальная диагностика клещевых инфекций и мониторинг энтомологического состояния природных очагов.
Наряду с увеличением количества случаев КЭ также имеется тенденция к нарастанию тяжести заболевания с увеличением доли менингеальных и очаговых форм (Волкова и Образцова, 2002). Настороженность вызывает и возникновение новых форм КЭ, таких как КЭ с геморрагическим синдромом (Ternovoi et al., 2003).
Актуальными вопросами молекулярной эпидемиологии ВКЭ в настоящее время являются уточнение ареала распространения его генотипов, отслеживание изменений в географическом распространении генотипов, изучение вариабельности ВКЭ на уровне генотипа, а также изучение свойств штаммов, существенно отличающихся от основных 3 генотипов (Злобин и др., 2007).
Небольшое на сегодняшний день количество полностью определенных последовательностей вирусных РНК различных штаммов ВКЭ (менее 30 полноразмерных последовательностей, опубликованных в базе данных GenBank) не отражает широкого спектра генетического разнообразия вируса и не позволяет определить мутации, приводящие к повышению патогенности вируса. Определение полных нуклеотидных последовательностей и молекулярно-генетический анализ современных, в особенности - необычных штаммов ВКЭ, проявляющих высокую патогенность, является важной задачей для установления ключевых моментов в молекулярной биологии ВКЭ и патогенезе КЭ. Таким образом, детальный анализ генома нового высокопатогенного штамма Глубинное/2004 в сравнении с известными штаммами и природными вариантами ВКЭ также представляется важной научной задачей.
Еще одной актуальной проблемой молекулярной биологии ВКЭ в настоящее время является изучение роли нетранслируемых областей генома в репликации вируса. В ряде работ (Filomatori et al., 2006; Alvarez et al., 2008; Li et al., 2008) 5'-нетранслируемая область генома (5'-HTO) флавивирусов идентифицирована как промотор репликации. В опубликованных данных, однако, содержатся указания на то, что вариабельность 5'-НТО флавивирусов составляет до 55,5% (Casati et al., 2006), что может обуславливать адаптацию вируса к различным хозяевам (Gritsun et al., 2006а-с, Gritsun et al., 2007a-b, Khromykh et al., 2003). Исследования вариабельности 5'-HTO были проведены лишь для вариантов ВКЭ европейского генотипа, выделенных из клещей I. ricinus. Для сибирского и дальневосточного генотипов ВКЭ у клещей I. persulcatus и I. Pavlovskiy подобных данных не опубликовано. Томская область является регионом, высокоэндемичным по клещевым инфекциям, и в силу этого представляет большой интерес для изучения вариабельности 5'-НТО у природных вариантов ВКЭ и их генетического разнообразия.
Иксодовые клещи также являются переносчиками возбудителей многих других инфекционных заболеваний человека и животных (простейших, бактерий и вирусов): энцефалит Повассан, клещевой боррелиоз, клещевой риккетсиоз, моноцитарный эрлихиоз человека, бабезиоз и flp.(Alekseev et al., 2004), клинические проявления которых в ряде случаев могут ошибочно трактоваться как КЭ (Коренберг, 2002, Korenberg and Likhacheva, 2006). У иксодовых клещей выявляются также вирус Западного Нила (Львов и Ильичев, 1979, Москвитина и др., 2008) и возбудитель бартонеллеза (Morozova et al., 2004), однако роль клещей в передаче данных инфекций человеку не доказана.
В природных очагах (Европа и Европейская часть России, Урал, Сибирь, Дальний Восток, Казахстан, Япония) у клещей выявлено совместное наличие двух и более возбудителей инфекций и показано возникновение микст-инфекций у человека (Alekseev et al., 2004, Hilpertshauser et al., 2006, Majlathova et al., 2006, Shpynov et al., 2004, Shpynov et al., 2006, Tabara et al., 2007, Zamoto et al, 2004). Ценными в научном и клиническом плане являются сведения о степени распространенности различных возбудителей, а также их уточненный видовой состав в очагах клещевых инфекций на территории Российской Федерации (Злобин и др., 2007). Учитывая тот факт, что комплексных исследований встречаемости клещевых инфекций в Томской области до настоящего времени не проводилось, мы решили не ограничиваться ВКЭ в изучении спектра переносимых клещами патогенов.
Эти данные представляют практическую ценность для развития и совершенствования дифференциальной диагностики переносимых клещами инфекций у лиц, пострадавших от укусов клещей.
Цели и задачи исследования: Целями работы являлись изучение встречаемости и генетического разнообразия ВКЭ и других переносимых клещами инфекций в городских и пригородных биотопах г.
Томска, а также секвенирование и молекулярно-генетический анализ генома нового штамма ВКЭ, вызвавшего особо тяжелую быстротекущую форму заболевания энцефалитом (штамм Глубинное/2004).
В связи с этими целями, основными задачами исследования были:
1. Создание коллекции ДНК и РНК, выделенных из иксодовых клещей, собранных в городских и пригородных биотопах г. Томска.
2. Выявление РНК ВКЭ и ДНК бактерий и простейших в образцах иксодовых клещей, собранных в течение эпидемического сезона в г. Томске, и определение соотношения встречаемости данных патогенов в клещах.
3. Секвенирование и молекулярно-генетический анализ генома штамма ВКЭ Глубинное/2004.
4. Изучение генетического разнообразия 5'-НТО геномной РНК в природных вариантах ВКЭ и анализ нуклеотидных замен, появляющихся в процессе адаптации изолятов ВКЭ к клеткам почки эмбриона свиньи (РКЕ. cells).
5. Определение нуклеотидных последовательностей фрагментов геномов вновь выявленных вариантов ВКЭ, фрагментов ДНК бактерий и простейших и их молекулярногенетический анализ.
Научная новизна и практическая ценность работы:
1. Впервые комплексно определена встречаемость геномов ВКЭ, Borrelia spp., Rickettsia spp., Ehrlichia spp. (в том числе в виде совместных инфекций) в иксодовых клещах, собранных в течение эпидемического сезона в г. Томске и его пригородах.
2. На территории г. Томска обнаружены варианты ВКЭ дальневосточного генотипа.
3. Изучена изменчивость 5'-концевой (промоторной) области генома природных вариантов ВКЭ сибирского и дальневосточного генотипов при пассировании их на культуре клеток РКЕ.
4. Определена полная нуклеотидная последовательность нового высокопатогенного штамма ВКЭ Глубинное/2004, проведен молекулярно-генетический анализ его генома и описаны области генома, замены в которых, возможно, определяют его высокую патогенность для человека.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Методами ПЦР-анализа с последующим секвенированием установлено, что в исследованных образцах клещей встречаемость ВКЭ составила 6,5±1,9%, Borrelia spp.
• 8±3%, Rickettsia spp. -4,5±2,4%, Ehrlichia spp. -1,67%.
2. Уровень гомологии 5'-НТО геномной РНК ВКЭ составляет 95% для дальневосточного и 89% для сибирского генотипов. Среди исследованных вариантов ВКЭ мутации были выявлены в следующих участках Y-структуры 5'-НТО: А2 - у 20 вариантов (55,5%), СТ - у 18 (50%), С2 - у 12 (33,3%), CS В - у 9 (25%), А1 - у 5 (13,9%), CS А - у 3 (8%), В1 - у 1 (2,8%).
3. Штамм Глубинное/2004 относится к дальневосточному генотипу ВКЭ, формируя в нем отдельную ветвь, и по сравнению со штаммами 205 и Софьин несет соответственно 53 и 57 аминокислотных замен. Наибольшие изменения обнаружены в вирусных белках NS3 (10 и 12 аминокислотных замен, по сравнению со штаммами 205 и Софьин, соответственно), NS5 (по 16 замен) и CTHD (по 5 замен на последовательность в 20 а.о.)- Изменены сайты процессинга вирусного полипротеина C/CTHD, CTHD/prM, prM/M, E/NS1, NS2B/NS3. В участке Р Y-структуры 5'-НТО обнаружены замены Тзо—>С и Т35—»С. Вклад автора:
1. Создание коллекции образцов ДНК и РНК, выделенных из иксодовых клещей, собранных в городских и пригородных биотопах г. Томска.
2. Расчет и тестирование олигонуклеотидных праймеров для генодиагностики и генотипирования РНК ВКЭ и ДНК бактерий и простейших, переносимых иксодовыми клещами.
3. Выявление РНК ВКЭ и ДНК бактерий и простейших в образцах иксодовых клещей и определение нуклеотидных последовательностей выявленных вариантов.
4. Филогенетический анализ фрагментов геномов вариантов ВКЭ, бактерий и простейших, выявленных в городских и пригородных биотопах г. Томска.
5. Определение полной нуклеотидной последовательности и молекулярногенетический анализ генома штамма ВКЭ Глубинное/2004.
Апробация работы: По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в журналах, рекомендованных для опубликования основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук.
Результаты работы были представлены на конференциях: • Российско-британский семинар молодых ученых "Emerging Diseases: Tick- transmitted and influenza". Россия, г. Новосибирск, 2006.
• Юбилейная конференция, посвященная 70-летию открытия клещевого энцефалита. Россия, г. Владивосток, 2007.
• XIV International Congress of Virology, Турция, г. Стамбул, 2008.
Полученные в ходе выполнения работы нуклеотидные последовательности штамма Глубинное/2004 и фрагментов геномов ВКЭ, Borrelia spp., Rickettsia spp., Ehrlichia spp.
депонированы в базу данных GenBank (номера DQ862460, EU715139 - EU715174, EU919251 -EU919255, EU919256-EU919263, EU919248-EU919250, FJ640555).
Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы.
Работа изложена на 143 страницах, содержит 30 рисунков и 12 таблиц. Список использованной литературы включает 191 источник, в том числе 138 опубликованных в иностранных журналах.
Благодарности: Автор выражает благодарность своим коллегам, в тесном сотрудничестве с которыми была выполнена диссертационная работа, а именно: д.б.н., проф. СВ. Нетесову, д.б.н. В.Б. Локтеву, к.б.н. Н. Коноваловой, Ю.В. Кононовой, Н.Л. Першиковой, д.б.н.
Г.Н. Леоновой. Автор благодарен к.б.н. Е.В.* Протопоповой за помощь в части культивирования ВКЭ. Автор благодарен сотрудникам кафедры зоологии позвоночных и экологии Томского государственного университета: Н.С. Москвитиной, С. Москвитину, В.Н. Романенко, Н.В. Ивановой, Н.П. Большаковой, Н.В. Курановой, И.Г. Коробицину, СИ. Гашкову, О.Ю. Тютенькову за предоставленные образцы клещей.
Репликативный цикл флавивирусов
ВКЭ способен размножаться in vitro во многих клеточных линиях млекопитающих, членистоногих и птиц. Связывание с рецепторами клетки-хозяина происходит путем взаимодействия с рецепторами димеров белка Е. При помощи антител, имитирующих гемагглютинирующие эпитопы белка Е, показано, что в качестве специфических рецепторов ВКЭ на поверхности клеток выступает ламининовый рецептор человека (Protopopova et al., 1999). Также предполагается, что в организме сорбция и дальнейшее необратимое связывание вириона с клеткой может быть опосредовано СЗ компонентом комплемента, Fc-детерминантой иммуноглобулинов или участием специфических антител, когда их концентрации существенно ниже нейтрализующих (Rice, 1996). После прикрепления к клеточной поверхности вирионы вызывают впячивания клеточной мембраны, где происходит эндоцитоз. В эндосоме при пониженном рН белок Е претерпевает необратимые конформационные изменения, переходя из димерной формы в тримерную, и индуцирует слияние вирусной и эндосомальной мембран (Allison et al., 1995).
После стадий связывания с клеткой, эндоцитоза вирионов, слияния и «расплавления» мембран происходит раздевание нуклеокапсида и высвобождение геномной РНК в цитоплазму. Вирусная РНК за счет комплементарности 5 - и 3 -концевых последовательностей циклизуется и приобретает вид так называемой «сковороды с ручкой». Вторичная структура «ручки» является регуляторним элементом для рибосом клетки-хозяина и вирусного полимеразного комплекса. Экспериментальные данные, говорящие о связи между механизмом репликации вируса в инфицированной клетке и патогенезом инфекции клещевого энцефалита получены Морозовой О.В. с соавторами в результате изучения репликативного комплекса ВКЭ с участием клеточных белков, вирусных неструктурных белков NS5, NS3 и вирусной РНК (Морозова и др., 2001а, Морозова, 20016). На основании полученных результатов предполагается, что РНК-зависимый синтез может регулироваться путем изменения состава репликативного комплекса, состоящего из вирусных и клеточных белков. Выход белка NS5 из состава комплекса приводит к переключению синтеза с (-)-цепей РНК на геномные РНК. Уменьшение доли белка NS3 в составе ассоциированных с мембранами комплексов вирусных белков, возможно, ингибирует скорость синтеза геномных РНК, что может являться одной из причин реализации процесса медленной персистентной инфекции (Морозова, 20016). По матрице вирусной РНК происходит трансляция полипротеина, совмещенная с его процессингом (рис. 3). Образовавшиеся белки репликативного комплекса производят транкскрипцию (-) цепей вирусной РНК, служащих матрицей для синтеза (+) цепей. Синтез РНК происходит в цитоплазматических репликационных комплексах, связанных с перинуклеарными мембранами. Синтез (+)- и (-)-цепей количественно асимметричен, их количества находятся в соотношении 10:1 соответственно. Вновь синтезированная (+)-цепь вирусной РНК связывается в цитоплазме с высокоосновным белком С, находящимся первоначально в незрелой форме. Эта форма представляет собой белки С и ргМ, соединенные гидрофобной сигнальной последовательностью, пронизывающей мембрану ЭПР так, что белок С экспонирован в цитоплазму, а ргМ - в просвет ЭПР (Nowak et al., 1989). Сигнальная последовательность несет сайт протеолиза для вирусной протеазы NS2B/NS3 со стороны цитоплазмы. При расщеплении по этому сайту высвобождается зрелый белок С, формирующий прокапсид вокруг вирусной РНК (Amberg et al., 1994). Сигнальная последовательность в мембране «протаскивается» в направлении просвета ЭПР, при этом становится доступным сайт протеолиза для сигналазы клетки-хозяина. При расщеплении по этому сайту высвобождается белок ргМ. Образовавшийся прокапсид проходит через мембрану ЭПР, где располагаются белки ргМ и Е, получая таким образом липидную оболочку с поверхностными белками. Созревание белка С, образование нуклеокапсида и прохождение его через мембрану ЭПР происходит в виде практически непрерывного процесса (Mukhopadhyay et al., 2005). Далее, следуя по секреторному пути в клетке-хозяине, незрелый вирион проходит к плазматической мембране. Перед самым высвобождением вириона из клетки клеточная протеаза фурин расщепляет белок ргМ с образованием структурного белка М зрелого вириона ВКЭ (Stadler et al., 1997). Параллельно молекулы белка Е, высвобождающиеся из комплекса ргМ-Е, димеризуются (рис. 5). Как предполагается, белок ргМ необходим для предотвращения образования тримеров белка Е в условиях низкого рН в транспортной сети аппарата Гольджи (Heinz and Allison, 2003). Антитела к белку ргМ могут способствовать протективному иммунитету путем нейтрализации содержащих ргМ-антиген вирионов, находящихся на клеточной поверхности. Мутации в белке ргМ влияют на уровень секреции вирусных частиц, например, замена пролина на серии в позиции 63 а.к. приводит к уменьшению секреции почти в 5 раз, предположительно за счет нарушения процесса прохождения вириона через мембрану ЭПР (Yoshii et al., 2004).
Патогенные бактерии и простейшие, переносимые клещами
Как уже было отмечено, иксодовые клещи являются переносчиками целого спектра патогенов помимо ВКЭ. Заболевания, вызываемые этими патогенами, а также микст-инфекции, до развития дифференциальной диагностики часто ошибочно трактовались как клинические проявления КЭ, и могут ошибочно трактоваться в настоящее время при отсутствии надлежащего комплекса лабораторной диагностики (Korenberg & Likhacheva, 2006). Важность изучения распространенности различных клещевых инфекций обусловлена необходимостью дифференцирования этиологического агента заболевания с целью применения адекватного лечения.
Иксодовый клещевой боррелиоз вызывается бактериями рода Borrelia. В Северной Америке случаи клещевого боррелиоза связывают с подвидом В. burgdorferi, на Евразийском континенте - с подвидами В. afzelii, В. burgdorferi, В. garinii, В. spielmanii (Smith et al, 2006, Majlathova et al., 2006). На территории России преимущественно распространены В. afzelii и В. garinii (Smith et al., 2006, Majlathova et al., 2006, Фоменко и -др., 2007). Ранее в работе (Стронин и др., 2001) было показана принадлежность единичного изолята боррелии, выделенного в Томской области, к В. garinii, а согласно данным (Фоменко и др., 2007), в Томской области были выявлены В. garinii и В. afzelii.
Иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ) среди переносимых клещами инфекций , делит первое место с КЭ по показателям заболеваемости в Российской Федерации (Korenberg & Likhacheva, 2006). С 1996 по 2004 гг. ежегодно в стране регистрировалось 6,3-8,7 тысяч случаев ИКБ (рис. 9). Заболевание характеризуется поражением кожи, нервной системы, опорно-двигательного аппарата, сердца, склонностью к затяжному хроническому течению. Инкубационный период составляет от 3 до 30 дней, в среднем - 2 недели. Основным клиническим признаком является появление на месте укуса клещом покраснения кожи -мигрирующей эритемы. Эритема постепенно увеличивается по периферии, достигая 1-10 см в диаметре, иногда более 60 см. Форма пятна округлая или овальная, реже неправильная. Наружный край воспаленной кожи более интенсивно красный, несколько возвышается над уровнем кожи. Со временем центральная часть пятна бледнеет или приобретает синюшный оттенок, возникает форма кольца. В месте укуса клеща, в центре пятна, появляется корочка, а затем рубец. Пятно без лечения сохраняется 2-3 недели, затем исчезает. Через месяц начинают развиваться признаки поражения нервной системы, сердца и суставов (Чебышев и др., 2005).
Диагностика осуществляется серологическими методами (реакция непрямой иммунофлюоресценции, ИФА, иммуноблоттинг) и ПЦР. Лечение проводится антибиотиками тетрациклиновой и цефалоспориновой групп. Специфическая профилактика отсутствует. Неспецифическая профилактика - использование репеллентов, защитной одежды, борьба с клещами.
Эрлихиозы человека и животных - природно-очаговые инфекции, переносимые иксодовыми клещами и вызываемые бактериями семейства Anaplasmataceae рода Ehrlichia. С заболеваниями человека и животных связывают виды Е. chaffeensis, Е. muris, Е. ewingii, Е. equilike, Е. canis, Anaplasma phagocytophilum. Эрлихии локализуются в цитоплазматических вакуолях лейкоцитов и вызывают у людей острые гриппоподобныс лихорадочные заболевания. Различают моноцитарный эрлихиоз (Е. chaffeensis) и гранулоцитарный анаплазмоз (A. phagocytophilum) человека. Возбудители выявлены у иксодовьгх клещей, животных и людей во многих странах, что свидетельствует о широком распространении эрлихиозов, в том числе и в Российской Федерации (Tabara et al., 2007, Shpynov et al., 2004).
Инкубационный период заболевания составляет от 1 до 21 дня, а клинически выраженное заболевание - 2-3 недели, иногда до 6 недель. Заболевание приводит к воспалительным процессам, включая хронические, в широком спектре внутренних органов. Моноцитарный эрлихиоз человека может сопровождаться гранулемами костного мозга и печени, а также мультиорганными периваскулярными лимфогистоцитарными инфильтратами. При моноцитарных и гранулоцитарных формах летальность может достигать 3-5% (Чебышев и др., 2005).
Диагностика осуществляется при помощи реакции непрямой иммунофлюорес-ценции. Лечение проводится антибиотиками тетрациклиновой группы. Специфическая профилактика отсутствует. Неспецифическая профилактика — использование репеллентов, защитной одежды, борьба с клещами (Чебышев и др., 2005). 2.9.3. Клещевой риккетсиоз
Клещевой риккетсиоз (клещевой сыпной тиф, сибирский сыпной тиф, североазиатский риккетсиоз) - инфекционное заболевание человека, выз ываемое бактериями семейства Ricketsiaceae рода Rickettsia, передающееся иксодовыми клещами. Заболевания человека связывают с видами R. sibirica sibirica, R. sibirica mongolotimonae, и R. heilongjiangensis (Mediannikov et al., 2004, Shpynov et al, 2004, Shpynov et al., 2006). Патогенность для человека недавно выделенной R. raoultii пока не доказана (Mediannikov et al., 2006). Инфекция распространена в Западной, Центральной и Восточной Сибири, Хабаровском и Приморском краях, некоторых районах Восточного и Северного Казахстана, в Армении, Туркмении и Монголии (Mediannikov et al., 2004, Shpynov et al, 2004, Shpynov et al., 2006). У животных инфекция, вызванная R.sibirica, протекает бессимптомно, эпизоотии не отмечается.
Риккетсиозы человека являются остро протекающими циклическими болезнями длительностью от 2 до 3 недель и более. Характеризуются выраженной интоксикацией, поражением ЦНС и сердечно-сосудистой системы, наличием экзантемы (генерализованная сыпь, напоминающая коревую). Болезнь начинается остро с озноба и повышения температуры за 24—30 ч до 39,5—40,0. В отдельных случаях возможны продромальные явления: недомогание, головная боль, чувство разбитости во всем теле. На месте укуса клеща на коже развивается первичный аффект, в виде небольшого плотного инфильтрата, покрытого некротической корочкой коричневого цвета и окруженного узкой розовой каемкой. Иногда сопровождается регионарным лимфаденитом (увеличением затылочных, шейных, подмышечных лимфатических узлов). В редких случаях первичный аффект отсутствует и заметно лишь точечное красное пятно на месте укуса клеща.
Пробоподготовка и выделение РНК, ДНК
Собранных клещей хранили при -70С. Гомогенизацию образцов осуществляли растиранием в ступке с 300 мкл фосфатно-солевого буфера. Вьщеление нуклеиновых кислот производили из 100 мкл. гомогената с использованием наборов РИБО-сорб (Интерлабсервис, Россия) согласно инструкции производителя.
Комплементарные ДНК синтезировали на матрице суммарной РНК с использованием синтетического праймера сПМб. Синтез проводили в 20 мкл раствора состава: 50 мМ Трис-НС1, 75 мМ КС1, 3 MMMgCl2, 10 мМ DTT, по 1 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 2,5 мкМ гексамера dNe, 50 е.а. обратной транскриптазы Mo-MuLV (Медиген, Россия) при 37С в течение 1 часа. Перед добавлением обратной транскриптазы смесь прогревали при 65С в течение 2 минут.
Были предприняты специальные меры по предотвращению возможной контаминации вследствие попадания продуктов ПЦР в запасы растворов или переноса материала из образца в образец. Меры включали в себя физическое разделение процедур с проведением отдельных этапов работы в разных помещениях класса биозащиты BSL-2, использование разных наборов пипеток для: выделения РНК и проведения ОТ; ПЦР; анализа продуктов амплификации. Структуры праймеров, рассчитанных нами и использованных для амплификации фрагментов геномов различных возбудителей, приведены в таблице 1. Определение концентрации контрольной ДНК при исследовании чувствительности праймеров осуществляли спектрофотометрически с помощью флуориметра QUBIT (Invitrogen, США).
Амплификацию осуществляли в 30 мкл смеси, содержащей 60 мМ Трис-НС1, 25 мМ КС1, 1,5 мМ MgCl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,1% Тритона Х-100, 0,2 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 0,15 мкМ праймеров, 2 ед. Taq ДНК-полимеразы (Медиген, Россия). Температурные условия амплификации для разных пар праймеров подбирали экспериментально (типичные условия: 95 С -1 мин, Тапп -1 мин, 72 С -1 мин, 40 циклов).
Глубинное\2004 осуществляли амплификацией взаимно перекрывающихся фрагментов генома с использованием олигонуклеотидных праймеров. Праймеры были рассчитаны на основе сравнения известных полных нуклеотидных последовательностей геномов ВКЭ с помощью пакета программного обеспечения Vector NTI 8 (таблица 2). Таблица 2. Олигонуклеотидные праймеры, использованные для определения полной нуклеотидной последовательности штамма Глубинное/2004 ВКЭ.
Продукты амплификации разделялись в 2% агарозном геле в однократном буфере ТАЕ (Трис: 40 мМ, КагЭДТА: 1мМ, уксусная кислота). Для визуализации ДНК гель окрашивался бромистым этидием (10 мг/мл). Гель рассматривали на УФ трансиллюминаторе ТСР-20 МС (Wilber Lourmat, Франция) и фотографировали с использованием системы видеодокументирования КРС-650 ВН (КТ&С, Южная Корея) Для выделения продуктов амплификации из агарозного геля использовали набор Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, USA).
Определение нуклеотидных последовательностей продуктов амплификации проводили с использованием автоматического секвенатора Beckman Coulter CEQ2000 XL. Использовали наборы реактивов CEQ DTCS Kit (Beckman-Coulter, Cat# 608000) согласно инструкции производителя. Определение проводили дважды, в независимых экспериментах.
Для генотипирования выявленных вариантов ВКЭ проводили филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 5 -НТО и фрагмента гена белка С длиной 255 н.о. Для сравнения использовали последовательности прототипных изолятов (таблица 3). Множественное сравнение последовательностей осуществляли с использованием пакета программного обеспечения Vector NTI 8. Филогенетический анализ и расчет молекулярных часов проводили с помощью программ MEGA 4 и TREE-PUZZLE (Schmidt et al., 2002). Для оценки достоверности группирования применяли тест на стандартную ошибку длин ветвей (Rzhetsky & Nei, 1992) и бутстреп-тест (Felsenstein, 1985). Таблица 3. Прототипные штаммы флавивирусов, использованные для филогенетического анализа ВКЭ.
Целями нашей работы являлись: изучение встречаемости и генетического разнообразия ВКЭ и других переносимых клещами инфекций в г. Томске, а также секвенирование и молекулярно-генетический анализ генома штамма ВКЭ Глубинное/2004. Ряд последовательно выполнявшихся для достижения данных целей задач включал в себя: расчет и апробацию олигонуклеотидных праймеров для диагностики и генотипирования переносимых клещами инфекций, а также для определения полной нуклеотидной последовательности ВКЭ; создание коллекции образцов ДНК и РНК, выделенных из иксодовьгх клещей, собранных в городских и пригородных биотопах г. Томска; исследование ДНК и РНК иксодовьгх клещей, собранных в городских и пригородных биотопах г. Томска, на наличие генетических маркеров возбудителей переносимых клещами инфекций (в том числе и микст-инфекций) и изучение генетического разнообразия данных патогенов; изучение вариабельности 5 -НТО у природных вариантов ВКЭ и установление возможности генотипирования ВКЭ по району 5 -НТО; секвенирование и анализ генома штамма ВКЭ Глубинное/2004.
Сравнение филогенетической значимости 5'-НТО и гена белка Е ВКЭ
Поскольку выбранный нами для исследования участок генома ВКЭ не включает в себя ген белка Е, обычно используемого при генотипировании ВКЭ, мы решили установить, возможно ли определение генотипа ВКЭ по последовательности нашего фрагмента (5 -НТО и фрагмент гена белка С), сравнив результаты филогенетического анализа по этим двум районам.
Нами были построены одинаковым способом (метод «объединения ближайших соседей» с использованием двухпараметрической модели Кимуры) филогенетические деревья для известных полноразмерных последовательностей прототипных штаммов ВКЭ отдельно по участкам 5 -НТО и гена белка Е ВКЭ (рис. 12 и 13).
Разделение прототипных штаммов по ветвям генотипов оказалось схожим для филогенетических деревьев, построенных по последовательностям обоих районов, что свидетельствует об адекватности филогенетического анализа вариантов ВКЭ по последовательности 5 -НТО. Ни один штамм, отнесенный к какому-либо из генотипов по результатам анализа гена белка Е, не попал в ветвь другого генотипа в филогенетическом дереве, построенном по последовательности 5 -НТО.
Таким образом, можно утверждать, что варианты ВКЭ, выявленные в образцах иксодовых клещей, могут быть однозначно отнесены к определенному генотипу вируса без необходимости дополнительного определения последовательности гена белка Е. 90 1 Primorye-212 Primorye-253 Primorye-86 Primorye-270 Oshima5-10
В опубликованных в настоящее время литературных данных не описано исследований высокоэндемичных по клещевым инфекциям сибирских природных очагов на предмет изучения степени распространенности и генетического разнообразия комплекса различных патогенов, переносимых клещами. Имеющиеся в настоящее время публикации посвящены какому-либо одному возбудителю и опираются в основном на результаты изучения коллекций штаммов возбудителей, собранных за весьма долгое время. Использование таких коллекций в качестве материала для исследования может давать неверные сведения о генетическом разнообразии патогенов, поскольку далеко не все природные варианты возбудителей успешно культивируются в лабораториях и процент таких «потерь» достаточно велик. Поэтому исследование методом ПЦР первичного материала - иксодовых клещей, собранных в природных очагах, представляет особый интерес в плане изучения как встречаемости, так и генетического разнообразия переносимых клещами патогенов.
Для определения частоты встречаемости различных патогенов образцы иксодовых клещей, собранных в городских и пригородных биотопах г. Томска, были исследованы нами на предмет наличия генетических маркеров следующих возбудителей: ВКЭ, ВП, Borrelia spp., Rickettsia spp., Ehrlichia spp., Babesia spp., Bartonella spp.
При исследовании 240 образцов клещей из различных биотопов на наличие ДНК Bartonella spp., Babesia spp. и РНК ВП генетические маркеры данных возбудителей нами обнаружены не были.
Среди 1806 исследованных иксодовых клещей, РНК ВКЭ была выявлена у 118 (б,5±1,9%). При исследовании встречаемости генетических маркеров ВКЭ у иксодовых клещей нами было выявлено изменение этого показателя в зависимости от месяца эпидемического сезона. Например, положительными на наличие РНК ВКЭ в 2006г. в биотопе «Коларово» в мае оказались 3 из 52 клещей всех стадий развития (5,8%), в июне 4 из 228 (1,8%), в июле 5 из 107 (4,7%). При этом зараженными в мае-июне оказываются перезимовавшие имаго обоих полов, а появляющиеся в июне личинки и нимфы практически стерильны. Напротив, в июле основной вклад в уровень зараженности вносят уже личинки и нимфы, инфицирование которых произошло, по-видимому, при совместном с зараженными имаго питании на животных, а имаго вообще встречаются единичными особями и ВКЭ у них не обнаруживается (табл. 4).
Аналогичная динамика наблюдалась и для других биотопов в 2006 и 2007гг. Изменение уровня вирусофорности в зависимости от месяца связано с появлением новых особей иксодовых клещей, поскольку эффективность трансовариальной и трансфазовой передачи вируса далека от 100% (Чунихин и др., 1983), а передача вируса в основном происходит при совместном питании зараженных и стерильных особей на прокормителях. В среднем, частота встречаемости РНК ВКЭ у клещей составила 6,5%.
Варианты ВКЭ сибирского генотипа показали существенное генетическое разнообразие, формируя 3 подветви в пределах ветви генотипа, что свидетельствует о значительном времени существования и эволюции ВКЭ на территории г. Томска и его пригородов. 4 выявленных варианта ВКЭ группируются с прототипным штаммом «Заусаев», формируя отдельную подветвь. Данный штамм был выделен в 1985г. в Москве от больного с хронической прогрессирующей формой КЭ (Gritsun et al., 2003b). По описанию авторов, больной был укушен клещом в 1973г. в г. Томске, после чего заболел хронической формой ВКЭ, приведшей к летальному исходу в 1985г. в Москве. Факт обнаружения четырех новых вариантов этой геногруппы в Томске подтверждает данные о происхождении штамма «Заусаев» из природных очагов ВКЭ в г. Томске. Важно отметить, что варианты этой геногруппы, способные вызывать хронические формы КЭ, продолжают циркулировать в этом районе.
