Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Общая характеристика полициклических ароматических углеводородов 12
1.2. Биологическая деструкция ПАУ 15
1.3. Биохимические пути метаболизма ПАУ бактериями 19
1.3.1. Биохимические пути биодеградации нафталина 19
1.3.2. Биохимические пути деградации фенантрена 26
1.4. Разнообразие бактериальных генетических систем деградации ПАУ 29
1.4.1. Гены катаболизма ПАУ грам - отрицательных бактерий 29
1.4.1.1. Организация генов катаболизма нафталина плазмиды NAH7 29
1.4.1.2. Регуляция генов катаболизма нафталина плазмиды NAH7 30
1.4.1.3. Генетические системы катаболизма нафталина аналогичные nah-тенш плазмиды NAH7 31
1.4.1.4. Генетические системы катаболизма нафталина, отличающиеся от архетипа плазмиды NAH7: 35
а) рЫ-геиы Comamonas testosteroni 35
б) nag-гены Ralstonia sp. штамм U2 36
в) р/ш-гены Burkholderia sp. RP007 37
г) гены катаболизма ПАУ бактерий рода Sphingomonas 39
д)р/ш-гены Cycloclasticus sp. А5 39
1.4.2. Гены катаболизма ПАУ грам - положительных бактерий 41
1.4.2.1. war-гены бактерий рода Rhodococcus 41
1.4.2.2. Организация генов катаболизма фенантрена Nocardioides sp. КР7 41
1.5. Участие плазмид в биодеградации ПАУ 42
1.6. Пути эволюции генетических систем катаболизма ПАУ 44
2 Материалы и методы 49
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды 49
2.2. Питательные среды и условия роста 53
2.3. Выделение бактериальных штаммов из почвенных образцов 53
2.4 Выделение тотальной ДНКбактерий 54
2.5. Выделение плазмидной ДНК 54
2.6. Коньюгационный перенос шгазмид 55
2.7. Полимеразная цепная реакция 56
2.8. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции 58
2.9. Электрофорез в агарозном геле 58
2.10. Препаративное выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 59
2.11 Мечение ДНК методом рассеянной затравки 59
2.12 Гибридизация ДНК на нейлоновых фильтрах 59
2.13. .Цитирование ДНК 60
2.14. Приготовление компетентных клеток E.coli 60
2.15 Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК 61
2.16 Определение нуклеотидной последовательности ДНК 61
2.17 Определение удельных активностей ферментов 62
3. Результаты 64
3.1. Изоляция и характеристика штаммов- деструкторов нафталина 64
3.2. Генотипический анализ штаммов P. fluoresceins 65
3.3. Участие плазмид в генетическом контроле деградации нафталина и фенантрена 67
3.4. Анализ удельных активностей ферментов биодеградации нафталина, фенантрена и салицилата 69
3.5. Амплификация и RFLP - анализ ключевых генов биодеградации нафталина 72
3.6.Анализ генов nahAc штаммов-деструкторов нафталина 76
3.7. Анализ генов nahG штаммов-деструкторов 79
3.8. Салицилат 5-гидроксилаза в штамме P. putida АК5 83
3.9. Амплификация регуляторного гена nahR 85
3.10. Амплификация генов орто- и мета- пути деградации катехопа 86
3.11. Анализ штаммов на наличие плазмид биодеградации нафталина 1псР-9 группы 87
3.12. Геномный фингерпринт (rep-PCR) штаммов-деструкторов нафталина, содержащих Р-9 плазмиды 90
3.13. RFLP - анализ плазмид 0 и 5 -подгрупп Р-9 группы несовместимости 90
3.14. Анализ штаммов - деструкторов нафталина на наличие плазмид ЬісР-7 группы 92
3.15. Локализация генов биодеградации нафталина в штаммах - хозяевах шсР-7 плазмид 94
3.16. RFLP - анализ 1псР-7 плазмид 94
4. Обсуждение 96
Выводы 111
Список литературы 112
- Разнообразие бактериальных генетических систем деградации ПАУ
- Выделение бактериальных штаммов из почвенных образцов
- Анализ удельных активностей ферментов биодеградации нафталина, фенантрена и салицилата
- Геномный фингерпринт (rep-PCR) штаммов-деструкторов нафталина, содержащих Р-9 плазмиды
Введение к работе
Актуальность проблемы
Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) являются широко распространенными соединениями, загрязняющими окружающую среду. Развитие промышленности приводит к росту загрязнения окружающей среды отходами индустриального производства, в частности, ПАУ. Основную роль в деградации ПАУ в природных условиях играет микробная утилизация. Большим метаболическим потенциалом в отношении ароматических углеводородов обладают бактерии рода Pseudomonas, способные к полной минерализации или частичной трансформации таких соединений как нафталин, фенантрен, флуорен и других (Cerniglia, 1984). Наиболее изученными в настоящее время являются различные аспекты биодеградации нафталина (Sutherland et al., 1995). Генетический контроль деградации нафталина детально изучен на примере архетипической плазмиды NAH7, размером 83 т.п.н., которая является коньюгативной и содержит всю генетическую информацию, необходимую для конверсии нафталина в пируват и ацетальдегид (Dunn and Gunsalus, 1973). Катаболические гены плазмиды NAH7 организованы в два оперона: nah\ (nahAaAbAcAdBFCED) контролирует превращение нафталина в салицилат, nahl (nahGTHINLOMKJ) - утилизацию салицилата до интермедиатов цикла трикарбоновых кислот (Simon etal., 1993; Eaton, 1994). Экспрессия обоих оперонов находится под позитивным контролем регуляторного гена nahR (Schell, 1985). У штаммов флуоресцирующих псевдомонад гены утилизации нафталина и его производных могут иметь как плазмидную, так и хромосомную локализацию (Herrick etal., 1997). Описано несколько групп идй-подобных генов обладающих консервативной организацией и высокой степенью гомологии с яаЛ-генами архетипической плазмиды NAH7: пап- и ndo- гены Pseudomonas putida (Eaton, 1994; Simon etal., 1993; Kurkela etal., 1988); pah - гены штаммов P. putida, деградирующих фенантрен (Kiyohara et al., 1994; Takizawa et al., 1994), и dox - гены из штамма Pseudomonas sp., утилизирующего дибензотиофен (Denome etal., 1993).
Адаптация микробных сообществ к условиям окружающей среды в большой степени определяется переносом и перегруппировкой генетического материала. Катаболизм нафталина бактериями рода Pseudomonas часто контролируется конъюгативными плазмидами большого размера, что обеспечивает распространение биодеградативных признаков среди микроорганизмов. Известно, что большинство изученных плазмид биодеградации ПАУ, как правило, относятся к группам несовместимости Р-2, Р-7 и Р-9 (Кочетков и Воронин, 1984). Основные исследования организации катаболических генов проводили на плазмидах NAH7 и pDTGl, которые принадлежат Р-9 группе несовместимости. Плазмиды катаболизма нафталина других групп несовместимости в настоящий момент являются менее изученными. Поскольку несовместимость плазмид связана со спецификой организации их базовых репликонов, принадлежность плазмиды к определенной группе несовместимости определяет круг её бактериальных хозяев, а также возможность совмещения различных признаков в одном штамме микроорганизмов. Вопрос о взаимосвязи между плазмидными репликонами и катаболическими генами, а также определенными группами плазмид биодеградации и их бактериальными хозяевами, остается открытым.
Катаболические опероны часто располагаются внутри мобильных элементов. Транспозонная организация катаболических оперонов, а также высокая гомология генов биодеградации подразумевают возможность их независимой эволюции путем транспозиционных и рекомбинационных событий, что наряду с горизонтальным генетическим переносом является мощным фактором распространения таких оперонов как внутри, так и между микробными популяциями. Изучение разнообразия генетических систем деградации ПАУ способствует пониманию эволюционных процессов, лежащих в основе существующих в настоящее время катаболических путей.
Цель и задачи работы:
Целью настоящей работы являлся анализ генетических систем катаболизма нафталина штаммов флуоресцирующих псевдомонад, изолированных из
различных географических регионов Российской Федерации, Украины и Беларуси и способных к утилизации нафталина и его производных.
В соответствии целью, в работе были поставлены следующие задачи:
Выделение, определение спектра утилизируемых субстратов и генотипический анализ деструкторов нафталина рода Pseudomonas.
Изучение роли плазмид в генетическом контроле деградации ПАУ.
Определение биохимических путей деградации нафталина, фенантрена и салицилата штаммами-деструкторами.
Анализ полиморфизма ключевых генов биодеградации нафталина.
Изучение плазмид катаболизма нафталина, принадлежащих к группам несовместимости Р-7 и Р-9.
Научная новизна
В настоящей работе проведен анализ генетических систем катаболизма нафталина 52 штаммов флуоресцирующих псевдомонад, изолированных из различных регионов России, Украины и Беларуси. Установление филогенетической взаимосвязи между штаммами одного вида показало, что многие изолированные из различных географически удаленных регионов Российской Федерации деструкторы ПАУ являются близкородственными.
Выделена новая группа генов nahAc. Разработаны новые специфические праймеры для обнаружения методом ПЦР и характеристики генов nahG и nahR. Впервые изучено разнообразие генов nahG, обнаружены два новых варианта последовательностей гена nahG. Показано, что встречаемость различных вариантов генов nahAc и nahG отличается для штаммов-деструкторов, принадлежащих к разным видам. Обнаружено существование вариаций в организации биодеградативных оперонов, включая наличие различных сочетаний генов nahAc и nahG в одном и том же штамме, а также присутствие негомологичных генов nahG или nahR. Впервые обнаружено сочетание генов салицилат 5-гидроксилазы nagG с «классическими» папА - генами. Изучены штаммы, имеющие ген салицилат гидроксилазы в транс-положении по отношению к ш/»7-оперону. Подобный
двуплазмидный контроль пути утилизации нафталина до настоящего времени не был описан в литературе.
Обнаружено влияние характера синтеза нафталин диоксигеназы на способность микроорганизмов-деструкторов нафталина утилизировать более высокомолекулярные ПАУ (фенатрен).
Проведен анализ плазмид утилизации нафталина и салицилата групп несовместимости Р-7 и Р-9. Показано, что плазмиды биодеградации нафталина Р-9 группы несовместимости чаще встречаются в штаммах Pseudomonas putida, в то время как для плазмид группы несовместимости Р-7, по-видимому, основным хозяином является P. fluorescens. Исследованные плазмиды деградации нафталина IncP-9 группы по структурной организации подразделяются на три подгруппы (А, В и С). Наблюдается некоторая корреляция между строением репликона (1псР-9р и IncP-96 - подгруппы) и структурой плазмиды в целом. Плазмиды 1псР-7 отличаются большим структурным разнообразием и не образуют какие-либо группы.
Практическая значимость работы
Анализ генетических систем катаболизма ПАУ представляет несомненный интерес как в фундаментальном, так и в прикладном аспектах. Изучение организации генетических систем катаболизма ПАУ является основой понимания эволюционных процессов, приводящих к возникновению разнообразия генов катаболических путей и изменению спектра утилизируемых субстратов, вследствие горизонтального переноса генов, транспозиционных событий, перестановок в ДНК, слияния генов, точечных мутаций и т.д. Полученная в настоящей работе информация позволяет расширить наши представления об молекулярных механизмах адаптации микроорганизмов к загрязнению окружающей среды ксенобиотиками, а также является предпосылкой для дальнейших исследований.
С прикладной точки зрения, разработанные в настоящей работе специфические праймеры могут быть использованы для обнаружения и характеристики штаммов-деструкторов, а также для мониторинга популяций бактериальных деструкторов в загрязненной почве. Использование ПЦР со
специфическими праймерами позволяет также оценить биодеградативный потенциал загрязненной территории. Приобретение новых биодеградативных способностей микроорганизмами под воздействием селективного давления может происходить не только в открытой среде, но и в лабораторных условиях. Охарактеризованные в данной работе катаболические плазмиды могут быть использованы для трансформации аборигенных штаммов, которые более адаптированы к окружающей среде и предпочтительны для биоремедиации, с целью получения микроорганизмов с более широким спектром утилизируемых субстратов. Штаммы, способные к утилизации не одного, а нескольких ПАУ, представляют интерес не только для исследования основных принципов биодеградации ПАУ, но и, по-видимому, перспективны для использования их в биотехнологиях очистки окружающей среды.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: IV Путинская конференция молодых ученых, 1999; VII Путинская конференция молодых ученых, 2003; "Pseudomonas 2001" Congress, Brussels, Belgium, 2001; Third symposium of the EU-concerted action on "Mobile genetic elements' contribution to bacterial adaptability and diversity" (MECBAD), Berlin, Germany, 2001; 1st FEMS Congress of European Microbiologists, Ljubljana, Slovenia, 2003.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи и 5 тезисов.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, включает 6 таблиц и 33 рисунка. Библиография включает 171 наименование, из них 10 отечественных и 161 зарубежная работа.
Разнообразие бактериальных генетических систем деградации ПАУ
Плазмида NAH7, изолированная из штамма Pseudomonas putida G7, рассматривается как архетип для группы плазмид деградации нафталина и салицилата. Эта плазмида размером 83 т.п.н. является коньюгативной и содержит всю генетическую информацию, необходимую для конверсии нафталина в пируват и ацетальдегид (Dunn and Gunsalus, 1973). Организация и направление транскрипции генов катаболизма нафталина, а также их регуляция были изучены на серии полярных мутантов, полученных транспозицией Тп5 (Yen and Gunsalus, 1982; Yen and Gunsalus, 1985). Структурные гены деградации нафталина объединены в два иай-оперона внутри 30т.п.н. региона плазмиды NAH7 (Рис. 8). четырьмя генами: nahAa кодирует редуктазу, nahAb - ферродоксин, паИАс -большую субъединицу оксигеназы, nahAd - малую субъединицу оксигеназы. Были определены нуклеотидная и аминокислотная последовательности компонентов нафталин диоксигеназы и местоположение данных генов на плазмиде (Simon M.J. et.al., 1993). Далее следуют гены, которые кодируют нафталин нс-дигидродиол дегидрогеназу (nahB), салицилальдегид дегидрогеназу (nahF), 1,2-дигидроксинафталин диоксигеназу (nahC), белок с неизвестной функцией (nahQ), гидроксибензилпируват альдолазу (nahE) и 2-гидроксихромен-2-карбоксилат изомеразу (nahD) (Zylstra G.J. et.al., 1997).
Оперой "нижнего" пути (иа/і2-оперон) включает гены nahGTHINLOMKJ и кодирует конверсию салицилата через расщепление ароматического кольца катехола по мета-пути до интермедиатов цикла Кребса. Ген nahG кодирует салицилат гидроксилазу, nahT - белок, похожий на ферредоксин хлоропластов, nahH - катехол-2,3-оксигеназу, nahl - 2-ГМП дегидрогеназу, nahN - 2-ГМП гидролазу, nahL - 2-оксопент-4-еноат гидратазу, nahO - ацетальдегид дегидрогеназу, nahM - 2-оксо-4-гидроксипентаноат альдолазу, nahK - у-оксалокрононат декарбоксилазу и nahJ - у-оксалокротонат изомеразу (Harayama et al., 1987; You et al., 1991; Eaton, 1994). За генами "нижнего" пути недавно был обнаружен ген nahY, который транскрибируется совместно с nahl - генами. Продукт nahY размером 538 аминокислотных остатков отвечает за хеморецепцию нафталина и его аналогов (Grimm and Harwood, 1999).
Область плазмиды NAH7 размером 37,5 т.п.н., которая содержит все пай-гены, находится на дефектном транспозоне класса II (ТЫ655). В составе Тп4655 отсутствует ген транспозазы (tnpA), однако обнаружена новая система сайт-специфичной рекомбинации, ответственная за разрешение коинтегратов (Tsuda and lino, 1990). Кроме того, показано, что nahl оперон «верхнего» пути деградации нафталина окружен прямыми повторами длиной 84 п.н. (Eaton, 1994). В результате инактивации иа/іі-оперона утрачивается способность к утилизации нафталина (Nah SaT -фенотип), при инактивации ш/г2-оперона - к утилизации салицилата (Nah Sal" - фенотип). Существование третьего фенотипа, полученного путем транспозонного мутагенеза, Nah"Sal" может быть обусловлено мутацией регуляторного гена nahR (Yen and Gunsalus, 1985).
Установлено, что индуктором ферментов биодеградации нафталина в штаммах P. putida NCIB 9816, P. putida G7 и P. putida ATCC 17483, является салицилат и его структурный аналог - 2-аминобензойная кислота (Shamsuzzaman and Barnsley, 1974b; Barnsley, 1975). Индукция салицилатом приводит к существенному увеличению синтеза мРНК обоих оперонов плазмиды NAH7 (Schell М.А., 1985). Продукт регуляторного гена, белок NahR, является позитивным регулятором nah\ и паИІ промоторов и необходим для активации обоих оперонов, салицилат выступает в роли индуктора (Schell and Wender, 1986; Schell and Poser, 1989). NahR принадлежит к семейству прокариотических транскрипционных активаторов LysR и имеет консервативный ДНК связывающий НТН (helixurn-helix) домен в N-концевой области (Schell and Sukordhaman, 1989). Ген nahR экспрессируется конститутивно на низком уровне (Cebolla et al., 1997). Белок NahR может быть в двух формах: инактивированной (NahRi) и активной (NahRa). В отсутствии индуктора преобладает NahRi, а в присутствии - NahRa (Yen and Serdar, 1988). Предполагается, что салицилат, связываясь с NahR, влияет на способность последнего напрямую взаимодействовать с РНК-полимеразой. Полученное недавно доказательство белок - белкового взаимодействия между NahR и альфа субъединицей РНК-полимеразы подтверждает эту гипотезу (Park et al., 2002).
Выделение бактериальных штаммов из почвенных образцов
Микроорганизмы выделяли из образцов почвы, загрязненной нефтепродуктами методом накопительных культур. Накопительные культуры инкубировали в жидкой среде Эванса, содержащей нафталин в качестве единственного источника углерода и энергии, в течение 3-5 дней. Разведения высевали на агаризованную среду Е с нафталином. Отдельные колонии, выросшие на нафталине пересевали. Штаммы проверяли на способность к росту на производных нафталина (2-метилнафталине, салицилате, гентизате), а также на других ПАУ (фенатрене, антрацене, дибензотиофене, бифениле и пирене), феноле, толуоле и ксилоле. Способность к трансформации полициклических ароматических углеводородов проверяли согласно методу Киохара (Kiyohara et al., 1982а).
Тотальную ДНК бактерий выделяли согласно (Ausubel et al., 1999). Культуру бактерий выращивали 16 часов при 28С в 5 мл LB на качалке. 1 - 1.5 мл культуры осаждали центрифугированием в течении 20 секунд в настольной центрифуге "Eppendorf" при 12000 об/мин. Осадок суспендировали в 570 мкл буфера ТЕ (10 мМ Трис-О, рН 8.0, 1мМ ЭДТА), добавляли 30 мкл 10% SDS и инкубировали 1 час при 37 до полного лизиса клеток. Затем добавляли 100 мкл 5М NaCl, перемепгавали и добавляли 80 мкл раствора, содержащего 10% СТАВ (вес/объем) и 0.7М NaCl, и инкубировали 10 минут при 65С. Экстрагировали смесь хлороформом, а затем фенол/хлороформом (1:1). ДНК осаждали 0.6 объемами изопропилового спирта. Сгусток ДНК переносили наконечником для автоматической пипетки в микропробирку с 80% этанолом, затем ДНК осаждали на настольной центрифуге "Eppendorf , подсушивали и растворяли в 100-200 мкл деионизованной воды.
Концентрацию ДНК определяли на флуориметре ТКО-100 фирмы "Hoefer Scientific Instruments" (США) с красителем Hoechst 33258 ("Bio-Rad", США) согласно протоколу фирмы-изготовителя. В качестве стандарта использовали препарат тимусной ДНК ("Bio-Rad", США).
А) Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса (Маниатис и др., 1984) с некоторыми модификациями. Культуры Pseudomonas выращивали в 200 мл обогащенной среды Эванса (Evans et al., 1970) при интенсивной аэрации в течение 16 часов при 28С, в качестве источника углерода использовали салицилат в концентрации 1 г/л. Клетки осаждали центрифугированием при 7000 об/мин в течение 5 минут при 4С, суспендировали в 4 мл охлажденного раствора I (10 мМ Трис-С1, рН 8.0, 5 мМ ЭДТА), затем добавляли 8 мл раствора II (0.2н NaOH, 1% SDS).CMecb инкубировали при комнатной температуре до полного лизиса, затем добавляли 6 мл охлажденного раствора III (ЗМ СНзСООК, рН 5.2) и инкубировали 10-20 минут в ледяной бане. Далее смесь центрифугировали 20 минут (13000 об/мин, 4С), ДНК осаждали из супернатанта добавлением 0.6 объема изопропилового спирта в течении 20 минут при комнатной температуре, центрифугировали 20 минут (13000 об/мин, 20С). Осадок, содержащий ДНК, растворяли в 0.6 мл буфера ТЕ (10 мМ Трис-О, рН 8.0, 1мМ ЭДТА), добавляли 200 мкл ЮМ LiCl и инкубировали 5-10 мин на ледяной бане. Центрифугировали 5 минут при 12000 об/мин в настольной центрифуге 5414С фирмы "Eppendorf" (Германия). ДНК осаждали из супернатанта добавлением равного объема изопропанола. Инкубировали 10 мин при комнатной температуре, центрифугировали 7 минут при 12000 об/мин в настольной центрифуге "Eppendorf". Осадок промывали 80% этанолом, подсушивали и растворяли в 20-100 мкл деионизованной воды. Качество и количество препарата плазмидной ДНК оценивали электрофорезом в 0.8% агарозе в 0.5х Трис-боратном буфере (Маниатис и др., 1984).
В некоторых случаях плазмидную ДНК дополнительно обрабатывали РНКазой (раствор Юмкг/мл добавляли к препарату ДНК до конечной концентрации 0.1-0.2 мкг/мл) и очищали последовательными экстракциями фенол/хлороформом (1:1) и смесью хлороформ/изоамиловый спирт (24:1). Б) Также плазмидную ДНК выделяли с помощью "Qiagen" Plasmid Purification Midi Kit ("Qiagen"GmbH, Германия) по протоколу фирмы-изготовителя.
Анализ удельных активностей ферментов биодеградации нафталина, фенантрена и салицилата
Для определения путей биодеградации нафталина, фенантрена и салицилата штаммами-деструкторами проводился анализ удельных активностей ключевых ферментов деградации у ряда штаммов.
Микроорганизмы, деградирующие нафталин, часто способны к трансформации фенантрена, однако способность к росту на фенатрене в качестве единственного источника углерода и энергии встречается значительно реже. Было показано, что штаммы-деструкторы нафталина могут приобретать способность утилизировать фенантрен в результате продолжительного культивирования на минеральной среде с фенатреном (Кошелева и др., 2000). Таким способом были получены мутантные штаммы BS202-P, BS3701, BS3750 и BS3710. Штамм BS3790 изначально утилизировал широкий спектр субстратов, в том числе и фенантрен. В исследованных штаммах-деструкторах фенантрена (BS3701, BS3790, BS3750, BS3710 и BS202-P) проявляются активности нафталин диоксигеназы, фенантрен диоксигеназы, салицилат гидроксилазы, 1-гидрокси-2-нафтоат гидроксилазы, катехол-1,2-диоксигеназы (С 120) и катехол-2,3-диоксигеназы (С230) (Табл. 4). Данные определения активностей ферментов свидетельствуют о том, что утилизация фенантрена происходит через 1-гидрокси-2-нафтоат, салицилат и катехол с дальнейшим расщеплением последнего по орто- и мета-пут. Активности нафталин диоксигеназы, фенантрен диоксигеназы и 1-гидрокси-2-нафтоат гидроксилазы также наблюдались у штаммов BS202, АК2, АК8 и АК5 (Nah+Sal+), которые не способны к росту на фенатрене. Однако у микроорганизмов BS202, АК2, АК8 эти активности индуцировались салицилатом, в то время как у штаммов, способных к росту на фенатрене, активности нафталин диоксигеназы и фенантрен диоксигеназы конститутивны. Активность нафталин 1,2-диоксигеназы в штамме АК5 также индуцибельна, однако эта активность наблюдалась только при выращивании на нафталине и практически отсутствовала при выращивании на салицилате, что позволяет предположить, что в отличие от остальных исследованных штаммов индуктором rtahl - оперона у штамма АК5 является нафталин. Активность салицилат гидроксилазы и 1-гидрокси-2-нафтоат гидроксилазы у всех исследуемых штаммов индуцировалась салицилатом, за исключением штамма АК5, у которого эта активность отсутствовала. Активность катехол 1,2- диоксигеназы также индуцируется салицилатом во всех исследованных случаях, за исключением штаммов BS202-P и АК5, у которых активность С120 крайне низка и не зависит от индукции салицилатом, и АК8 у которого эта активность отсутствует (Табл. 4). Таким образом, отличительной чертой микроорганизмов-деструкторов нафталина, способных к росту на фенатрене, является конститутивный характера синтеза нафталин диоксигеназы.
Анализ активностей ферментов биодеградации нафталина и салицилата у BS202, BS3701 и BS3790 штаммов и их Nah SaT производных показал, что у всех этих штаммов наблюдаются активности салицилат гидроксилазы, 1-гидрокси-2-нафтоат гидроксилазы и катехол 1,2-диоксигеназы - фермента расщепления катехола по орто-пути. Активность катехол-2,3-диоксигеназы - ключевого фермента расщепления катехола по мета-пути проявляют только штаммы, содержащие плазмиды NPL-1, pBS1180, pBS1141 и pBS1191, в то время как штаммы BS203, BS3701-E и BS3790-E5 не проявляют активности этого фермента.
Анализ удельных активностей ключевых ферментов катаболизма нафталина в штамме P. putida АК5 показали отсутствие активностей салицилат гидроксилазы и катехол-2,3-диоксигеназы (Табл. 4). Наличие в штамме АК5 активности гентизат-1,2-диоксигеназы при росте на салицилате и нафталине, позволило предположить, что АК5 утилизирует нафталин через салицилат и гентизат.
Поскольку штамм P. putida АК8 хорошо растет на гентизате, было предположено, что салицилат, как и в штамме P. putida АК5, может расщепляться через гентизат. При выращивании АК8 на салицилате не удалось обнаружить активность гентизат-1,2-диоксигеназы, однако наблюдался высокий уровень салицилат 1-гидроксилазы. Отсутствует активности С120, компенсируется достаточно высокой активностью С230. Таким образом, P. putida АК8 утилизирует нафталин через салицилат по мета-путл окисления катехола.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является одним из наиболее быстрых, специфичных и чувствительных методов, позволяющих выявить наличие определенных последовательностей в различных микроорганизмах. Изученные к настоящему времени гены катаболизма нафталина у флуоресцирующих псевдомонад обладают большой степенью гомологии. Для ПЦР - анализа были выбраны гены, которые кодируют ключевые ферменты окисления нафталина бактериями: большую субъединицу нафталин 1,2-диоксигеназы (nahAc), салицилат гидроксилазу (nahG), регуляторный белок (nahR), катехол-2,3-диоксигеназу (nahH) и катехол-1,2-диоксигеназу (catA). Условия амплификации данных генов nahAc и nahH были подобраны ранее (Ferrero М. et al., 2002; Wilkstrom P., et.al., 1996), при их соблюдении ПЦР из плазмидной ДНК шла достаточно интенсивно, без появления неспецифических фрагментов. Праймеры и условия для амплификации гена катехол-1,2-оксигеназы (catA) были также разработаны ранее в лаборатории биологии плазмид (Табл. 3). К настоящему времени охарактеризовано несколько различных генов салицилат гидроксилаз Pseudomonas spp. и родственных видов, имеющих как плазмидную, так и хромосомную локализацию, и определены их последовательности. На основе последовательностей nahG из P. putida G7 (М60055), P. putida NCIB9816-4 (AF491307), P. stutzeri AN10 (AF039534), P. putida KF715 (S80995), P. fluoresces SME11 (AY048764) и P. putida SI (АВ010714) для быстрой детекции генов салицилат гидроксилаз в настоящей работе были разработаны вырожденные праймеры shclup и shcllo (Табл. 3).
Геномный фингерпринт (rep-PCR) штаммов-деструкторов нафталина, содержащих Р-9 плазмиды
Для выяснения вопроса о генотипическом разнообразии бактерий - хозяев плазмид биодеградации нафталина IncP-9 группы, изолированных из различных географических регионов, проводился REP-PCR с использованием праймера ВОХА1. Среди 17 штаммов методом REP-PCR были выделены семь различных групп геномных фингерпринтов (Рис. 25). К первой группе относятся восемь штаммов P. putida: BS202, BS3701, 8С, 15С, 16С, 24С, 25С and BS3750. Интересно, что эта самая большая группа включает штаммы, изолированные из трех различных географических областей (Украины, Московской области и Западной Сибири). Три группы включают по два генотипически похожих штамма каждая: PpG7 и BS3710; BS3790 и NK72; и 143NF и BS238. Оставшиеся три генотипа представлены единственным штаммом каждый (P. putida SN11, P. fluoresceins 37NF и P. aeruginosa 8909).
Для определения сходства и различий между исследуемыми плазмидами проводился рестрикционный анализ с использованием эндонуклеазы рестрикции EcoKL. Результаты RFLP плазмид представлены на рисунке 26А. Кластерный анализ проводился при помощи алгоритма UPGMA (Рис. 26 В). Оказалось, что исследуемые плазмиды на основании RFLP могут быть поделены на 3 основных группы. К группе А относятся 10 плазмид размером от 100 до 120 т.п.н. Самой малочисленной является подгруппа В, включающая в себя две практически идентичные плазмиды сходного размера, архетипическую плазмиду NAH7 и pNF37 (Рис. 26 А, В). Плазмиды групп А и В относятся к IncP-9 р - подгруппе, тогда как третья наиболее гетерогенная группа С включает Р-9 плазмиды 6 - подгруппы, pBS2, обладающую слитым 1псР7/Р9 3 репликоном и pNF143, которая относится к IncP-9 р - подгруппе, размером от 80 до 130 т.п.н. Штаммы флуоресцирующих псевдомонад, использованные данной в работе, были проверены на наличие плазмид Р-7 группы несовместимости методом ПЦР. Праймеры, специфичные для Р-7 решшкона, разработанные на основе сравнения последовательности ori-rep области плазмиды Rmsl48 и последовательности гена герА плазмиды pCARl (Maeda et al., 2003), были предоставлены К. М. Томасом (Бирмингемский университет, Великобритания). Было обнаружено 8 штаммов, которые давали положительный сигнал со специфичными праймерами (Табл. 2). Известно, что некоторые плазмиды могут обладать слитым репликоном, например, плазмида pBS2 (IncP7/P9 Р), однако, ни одна из вновь обнаруженных плазмид Р-7 группы не давала положительного сигнала амплификации с праймерами специфичными для Р-9 решшкона. Из всех исследуемых штаммов были выделены плазмиды Р-7 группы несовместимости, размер которых варьировал от 77 до 135 т.п.н. (Табл. 2). Все исследованные штаммы - хозяева плазмид Р-7 группы на основании ARDRA принадлежат к виду P. fluorescens, за исключением P. putida АК5.
Эксперименты по коныогационному переносу в рецепиентный штамм Р. putida КТ2442 показали, что по крайней мере две плазмиды: рА24-1 и pOS18, размером 100 и 135 т.п.н., соответственно, содержат весь необходимый набор генов для конверсии нафталина и салицилата. С целью доказательства плазмидной природы генов биодеградации нафталина проводили гибридизационный анализ IncP-7 плазмид. Плазмидную ДНК обрабатывали эндонуклеазой рестрикции EcoRl (Рис. 27 А). В качестве 32Р-зондов использовали ПЦР-продукты генов nahAc и nahG плазмиды NAH7, размером 856 и 893 п.н., соответственно (Табл.2). Результаты анализа показали, что в верхнем ЕсоШ - фрагменте всех исследованных IncP-7 плазмид локализован ген нафталин диоксигеназы (Рис. 27 Б). Ген салицилат гидроксилазы также находится в верхнем ЕсоШ - фрагменте всех исследованных IncP-7 плазмид, за исключением плазмиды рАК5, которая не дает гибридизационного сигнала с данной Р-пробой (Рис. 27 В). Поскольку было показано, что штамм P. putida АК5 содержит последовательность гена салицилат 5-гидроксилазы, для выяснения локализации гена nagG, ДНК исследуемых плазмид гибридизовали с Р - ампликоном гена nagG, размером 766 п.н. ПЦР - продукт гена nagG гибридизовался только с ЕсоШ - фрагментом размером около 10 т.п.н. плазмиды рАК5 (Рис. 27 Г).
Для определения сходства и различий между исследуемыми плазмидами проводился RFLP - анализ (restriction fragment length polymorphism) плазмид, обработанных эндонуклеазой рестрикции ЕсоШ (Рис. 27 А). Кластерный анализ проводился при помощи программы TREECON (Van de Peer and De Wachter, 1994) (Рис. 28). Результаты кластерного анализа показали, что исследуемые плазмиды не образуют какие-либо группы.
Микроорганизмы, способные к утилизации ПАУ, представляют несомненный интерес как в фундаментальном, так и в прикладном аспектах. Изучение особенностей организации генетических систем биодеградации штаммов деструкторов лежит в основе понимания эволюционных процессов, обеспечивающих разнообразие микроорганизмов и их адаптацию к изменяющимся условиям окружающей среды. Большой метаболический потенциал в отношении ПАУ проявляют бактерии рода Pseudomonas. В настоящей работе был проведен анализ 52 штаммов флуоресцирующих псевдомонад, изолированных из загрязненных нефтепродуктами почв и способных к утилизации нафталина и салицилата в качестве единственных источников углерода и энергии. Большинство этих штаммов предположительно относятся к видам P. putida и P. fluorescens, причем соотношение этих видов микроорганизмов, выделенных из отдельных сайтов примерно одинаково (по 48%). Однако не исключено, что, используемые в работе способы изоляции нафталиновых деструкторов, обеспечивают преимущества роста именно этих двух видов флуоресцирующих псевдомонад. Установление филогенетической взаимосвязи между штаммами одного вида методом геномного фингерпринта показало, что многие изолированные из различных географически удаленных регионов Российской Федерации деструкторы ПАУ, относящиеся к видам P. fluorescens и P. putida, являются близкородственными.
