Введение к работе
Актуальность проблемы
Неизбежным результатом технологического прогресса является поступление в окружающую среду различных типов ксенобиотиков. К их числу относятся фосфонаты, содержащие прямую ковалентную связь углерод-фосфор (С-Р). Такая связь чрезвычайно устойчива к химическим и физическим воздействиям, вследствие чего фосфонаты способны накапливаться в окружающей среде. Синтетические фосфонаты входят в состав многих пестицидов, могут поступать в среду как отходы химической индустрии и продукты де- токсикации фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ).
Глифосат (ГФ) является одним из наиболее распространенных синтетических фосфонатов и применяется как действующий компонент популярных гербицидов (Roundup, Ground-Bio и др.). К 2010 г. объемы поступления ГФ в среду превысили 800 тыс. тонн в год. По данным независимых исследований, ГФ способен сохраняться в почвах в течение многих лет, изменяя состав почвенной микрофлоры, проникая в культурные растения и просачиваясь в водоемы. У животных ГФ может вызывать поражения печени, иммунной системы и нарушения эмбрионального развития.
Метилфосфоновая кислота (МФК) — один из основных продуктов переработки ФОВ и побочный продукт ряда промышленных процессов, крайне стабильна в окружающей среде и может сохраняться в почве в течение десятков лет, проявляя фитотоксические свойства.
В связи с этим актуален поиск способов ремедиации почв и водоемов, загрязненных фосфонатами. Из-за высокой стойкости подобных соединений единственный рациональный подход к решению данной проблемы предполагает применение микроорганизмов-деструкторов. Однако разработка подобных технологий затрудняется недостатком сведений об организации путей метаболизма фосфонатов.
Считается, что С-Р связь большинства фосфонатов, в том числе МФК, неспецифически расщепляется ферментным комплексом «С-Р лиаза», необратимо инактивирующимся при дезинтеграции клеток. Известно единственное сообщение о возможном существовании разновидности С-Р лиазы, специфически разлагающей ГФ (в настоящей работе обозначенной как C-Р лиаза II). Существует предположение об альтернативном пути разложения ГФ, где начальную реакцию расщепления ГФ может катализировать фермент глифосат-оксидоредуктаза с образованием аминометилфосфоновой кислоты (АМФК). Однако ГФ-оксидоредуктаза не была очищена и охарактеризована. Путь дальнейшего метаболизма АМФК, связанный с разрывом С-Р связи, также неясен.
Дефицит знаний о метаболизме фосфонатов во многом объясняется отсутствием доступных и достоверных методов идентификации активности соответствующих ферментов, а также анализа их метаболитов. Разработка подобных методов и исследование метаболизма синтетических фосфонатов бактериями-деструкторами является одной из приоритетных задач современной биохимии.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы было изучение путей катаболизма глифосата и метилфосфоновой кислоты у почвенных бактерий-деструкторов фосфонатов. Для достижения цели работы необходимо было решить следующие задачи:
-
Разработка методов количественного и качественного анализа исследуемых фосфонатов и их метаболитов, а также методик измерения активности ферментов их деструкции.
-
Подбор объектов исследования - штаммов, обладающих наибольшей эффективностью деструкции в отношении изучаемых фосфонатов.
-
Изучение возможности адаптации штамма, выделенного под селективным давлением метилфосфоновой кислоты к утилизации глифосата.
-
Выявление путей метаболизма фосфонатов у отобранных штаммов- деструкторов.
-
Очистка нового фермента первичной атаки глифосата - глифосат- оксидоредуктазы.
-
Характеристика глифосат-оксидоредуктазы.
Научная новизна
Разработаны новые методы идентификации и измерения активности ферментов метаболизма ГФ и МФК с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), тонкослойной хроматографии (ТСХ) и спек- трофотометрического определения, отличающиеся высокой достоверностью.
Впервые показана возможность адаптации штамма-деструктора МФК (Achromobacter sp. MPS 12), первоначально не способного утилизировать ГФ, к использованию этого соединения как единственного источника фосфора. Адаптированный штамм Achromobacter sp. MPS 12A по показателям деструкции ГФ был близок к O. anthropi GPK 3.
Доказано существование двух С-Р лиазных систем с различающейся субстратной специфичностью: С-Р лиаза I разлагала МФК, C-Р лиаза II - ГФ.
Впервые выявлено различие в путях метаболизма ГФ у штаммов, выделенных под селективным давлением двух разных фосфонатов: Achromobacter sp. MPS 12А разлагал этот фосфонат с помощью ГФ-специфичной С-Р лиазы II с образованием саркозина. Ферментом первичной атаки ГФ у O. anthropi GPK 3 была ГФ-оксидоредуктаза; продуктами этой реакции были АМФК и глиоксилат.
У O. anthropi GPK 3 был идентифицирован ранее не описанный путь метаболизма АМФК, который включал стадии переаминирования и разрыва С-Р связи при вероятном участии фермента фосфоноацетальдегидгидролазы (фосфонатазы).
ГФ-оксидоредуктаза O. anthropi GPK 3 была впервые очищена до элек- трофоретически гомогенного состояния. Изучены ее основные характеристики, определен кофактор, выявлены параметры, способствующие повышению выхода фермента.
Практическая значимость
Разработанные высокоточные методы анализа фосфонатов и продуктов их метаболизма отличаются универсальностью и могут применяться для обнаружения фосфонатов в природных образцах почвы и грунтовых вод, сточных водах, а также в лабораторных исследованиях при анализе гомогенатов клеток и культуральной жидкости.
Изученные физиологические и биохимические особенности отобранных штаммов-деструктров ГФ и МФК позволяют давать точную оценку деструктивного потенциала таких микроорганизмов. Обнаруженный эффект адаптации изучаемых бактерий к утилизации фосфонатов разных типов открывает новые возможности селекции универсальных и высокоэффективных деструкторов, активных в отношении широкого диапазона этих соединений.
Данные о различиях в путях деструкции ГФ у штаммов, выделенных под селективным давлением разных фосфонатов, позволяют осуществлять более эффективный скрининг и отбор микроорганизмов, пригодных для последующего дальнейшего применения их в технологиях очистки природных сред от загрязнения фосфонатами. Сведения о факторах, способствующих индукции ГФ-оксидоредуктазы у O. anthropi GPK 3, дают возможность подобрать условия, способствующие наибольшей экспрессии данного фермента.
Впервые полученные сведения об организации и распределении ферментных систем катаболизма фосфонатов у бактерий являются основой для разработки биотехнологий очистки и восстановления природных сред, загрязненных фосфонатами.
Структура и объем диссертации
![Новые трансформации моно-, би- и трициклических аналогов системы оксазоло[3,2-a]пиридиния](/i/i/4282/311904.png "Новые трансформации моно-, би- и трициклических аналогов системы оксазоло[3,2-a]пиридиния Цисевич Александр Александрович")
