Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1 Экология вируса Западного Нила (ЗН) и его значение в инфекционной патологии человека 9
1.1.1 Географическое распространение вируса Западного Нила 10
1.1.2 Филогенетические взаимоотношения различных изолятов вируса Западного Нила 17
1.1.3 Значение членистоногих в экологии вируса Западого Нила 22
1.1.4 Значение позвоночных в экологии вируса Западного Нила 27
1.1.5 Клинические проявления лихорадки Западного Нила 31
1.2 Молекулярно - генетическая организация вируса Западного Нила 33
2. Материалы и методы 41
2.1 Место сбора и объем полевого материала 41
2.2 Методы сбора, транспортировки, хранения и подготовки полевых материалов 46
2.3 Вирусологическое обследование 46
2.4 Штаммы и нуклеотидные последовательности вируса Западного Нила, использованные в работе 47
2.5 Выделение тотальной РНК из осветленной клеточной или тканевой суспензии 49
2.6 Реакция обратной транскрипции 49
2.7 Проведение полимеразной цепной реакции 50
2.8 Электрофорез ДНК 50
2.9 Секвенирование ДНК 50
2.10 Компьютерная обработка данных 51
3. Полученные результаты 52
3.1 Разработка ОТ-ПЦР тест - системы для детекции вируса ЗН 52
3.1.1 Подбор праймеров 52
3.1.2 Определение специфичности ОТ-ПЦР тест - системы 57
3.1.3. Определение чувствительности ОТ-ПЦР тест — системы 58
3.2 Зараженность вирусом Западного Нила птиц дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы 61
3.2.1 Выявление РНК вируса Западного Нила у птиц методом ОТ-ПЦР 62
3.2.1.1 Зараженность вирусом ЗНптиц в различных природных зонах дельты Волги 63
3.2.1.2 Зараженность вирусом ЗН диких и синантропних птиц дельты Волги 67
3.2.1.3 Выявление РНК вируса ЗН у мелких позвоночных, в дельте Волги 72
3.2.2. Вирусологическое обследование птиц дельты Волги 73
3.3 Генетический анализ штаммов вируса ЗН, выделенных в дельте Волги от птиц в 2001 и 2002 гг 77
3.3.1 Анализ нуклеотидных последовательностей 79
3.3.2 Анализ предсказанных аминокислотных последовательностей 84
3.3.3 Филогенетический анализ 88
4. Обсуждение полученных результатов 91
Выводы 101
- Молекулярно - генетическая организация вируса Западного Нила
- Выделение тотальной РНК из осветленной клеточной или тканевой суспензии
- Зараженность вирусом Западного Нила птиц дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы
- Генетический анализ штаммов вируса ЗН, выделенных в дельте Волги от птиц в 2001 и 2002 гг
Введение к работе
Актуальность проблемы
Вирус Западного Нила (ЗН), являющийся этиологическим агентом лихорадки Западного Нила (ЛЗН), широко распространен практически по всем частям света. Ареал его распространения охватывает практически весь африканский континент, Юго-Западную и Южную Азию, Южную и некоторые центральные части Европы (Львов, 2000; Hublek, 1999). Начиная с 1999 г. вирус ЗН выявляется также на территории североамериканского континента (Lancotti et al., 1999). Для Австралийского континента топотипным является вирус Кунджин, который изначально рассматривался как самостоятельная нозологическая единица. Однако данные генетических и антигенных исследований позволяют рассматривать штаммы вируса Кунджин как топотипные, характерные для Австралии изоляты вируса ЗН, отнесенные к 1-ой филогенетической группе (Scherret et al., 2001; 2002; Hall et al.,2001).
Эпидемические вспышки ЛЗН различного масштаба и интенсивности регистрируются практически каждый год в странах Африки и Ближнего Востока, реже в Европе и Индии, иногда в Средней Азии (Львов, 2000; Murgue et al., 2002). Особую актуальность для здравоохранения вирус ЗН приобрел после ряда крупных, сопровождающихся высокой смертностью эпидемий ЛЗН, прошедших в конце 1990-х гг. в Румынии (1996), России и США (1999), Израиле (2000). Необычной, нехарактерной для ЛЗН особенностью данных вспышек явилось большое (до 30-40 %) число случаев с поражениями ЦНС в виде менингита и энцефалита, а также высокая смертность (в среднем 10%), В Израиле и России заболеваемость ЛЗН фиксировалась и в последующие годы, но в меньшем масштабе (Петров и др., 2001; Ковтунов и др., 2003; Bin et al., 2001). В США в 2003 г. зарегистрировано более 9000 случаев заболеваний ЛЗН, из которых около 30 % с поражениями ЦНС (). Вследствие этих событий ЛЗН была причислена к проблемам новых и вновь возвращающихся инфекций,
5 актуальность которых для мирового здравоохранения продолжает оставаться на высоком уровне (Львов, 2000).
Вирус ЗН принадлежит роду Flavivirus (семейство Flaviviridae) и является арбовирусом. Резервуаром вируса в природе являются птицы, а основными переносчиками служат комары, преимущественно рода Culex. Инфекция ЛЗН относится к природно-очаговым зоонозам поскольку имеет выраженный очаговый характер (Львов и др., 1989). Природная циркуляция вируса ЗН в очаге происходит в системе птицы — комары — птицы, при этом комары также эффективно заражают и других теплокровных, в том числе человека. Зараженность вирусом ЗН птиц является важным показателем активности природного очага и позволяет прогнозировать развитие эпидемической ситуации. Особенно важную роль при этом отводят синантропным птицам, массово заселяющих населенные пункты и их окрестности.
В нашей стране активные очаги ЛЗН, сохраняющиеся на протяжении десятилетий, расположены в Астраханской области, на территории дельты Волги. Здесь почти ежегодно фиксируется спорадическая заболеваемость ЛЗН, иногда эпидемические вспышки. Институтом вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН на территории Астраханской области проводится мониторинг циркуляции ЛЗН, который включает в себя наблюдения за вирусной активностью во всех звеньях экологической системы вирус — переносчики — позвоночные хозяева - переносчики - люди. Настоящая работа выполнена в рамках данного мониторинга и посвящена исследованию вовлеченности в циркуляцию вируса ЗН птиц в дельте Волги и Волго -Ахтубинской пойме.
Цель и задачи работы.
Цель настоящей работы заключалась в обследовании птиц дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы относительно зараженности вирусом ЗН и изучении генетических свойств циркулирующих здесь штаммов вируса
Западного Нила. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
Разработать тест - систему на основе ОТ-ПЦР для чувствительной и специфичной детекции вируса ЗН в биологических образцах.
С использованием разработанной ОТ-ПЦР тест - системы определить уровни зараженности вирусом ЗН птиц дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы в 2001 и 2002 гг.
Определить нуклеотидную последовательность структурной области генома штаммов вируса ЗН, выделенных от птиц дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы в 2001 и 2002 гг.
На основании полученных нуклеотидных последовательностей провести филогенетический анализ и определить генетические характеристики выделенных штаммов вируса ЗН.
Основные положения, выносимые на защиту.
Разработана чувствительная и высокоспецифичная ОТ-ПЦР тест - система для детекции вируса ЗН в биологических образцах.
Определены показатели зараженности вирусом ЗН птиц в дельте Волги и Волго - Ахтубинской поймы в 2001 и 2002 гг.
Определены молекулярно - генетические характеристики штаммов вируса ЗН, выделенных от птиц в дельте Волги в 2001 и 2002 гг.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Разработана ОТ-ПЦР тест - система для специфичной детекции вируса ЗН в биологических образцах с чувствительностью до 50 БОЕ/мл. При разработке системы использовались нуклеотидные последовательности штаммов вируса ЗН, принадлежащие ко всем известным филогенетическим группам, что обеспечило максимально возможную, на данный момент,
7 универсальность тест - системы. Использование разработанной системы целесообразно при проведении исследований, посвященных вирусу ЗН, в которых необходима быстрая и надежная детекция вируса в биологических образцах, в том числе и с диагностическими целями. Разработанная тест -система защищена патентом РФ №2199589 от 27.02.2003.
Впервые в России проведено масштабное исследование зараженности вирусом ЗН птиц в природных очагах дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы с использованием ПЦР. Всего обследовано более 1000 птиц, принадлежащих к 20 различным семействам, собранных как в диких, так и в антропогенных биоценозах. Согласно полученным результатам уровень зараженности вирусом ЗН птиц в дельте Волги составил 13,3% и 9,6% в 2001 и 2002 гг. соответственно. Зараженность птиц Волго - Ахтубинской поймы в 2002 г. не превысила 3,3 %. Зараженность вирусом ЗН синантропных птиц составила в 2002 г. в дельте Волги 16,9%, а на территории Волго - Ахтубинской поймы 4,1 %.
В результате вирусологического обследования, от птиц дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы было выделено 12 штаммов вируса ЗН. При этом два штамма вируса были выделены в 2001 г. и 10 штаммов в 2002 г. Для изучения их молекулярно - генетических характеристик, у 11 выделенных штаммов были определены нуклеотидные последовательности 5'-концевой области генома, включающей в себя 5'-нетранслируемый регион и гены всех структурных белков. На основе сравнения полученных нуклеотидных последовательностей было показано, что выделенные штаммы вируса ЗН практически идентичны штамму Ast986, выделенному здесь в 1999 г. от больного во время крупной вспышки ЛЗН, и несут в рассматриваемой области (по сравнению с ним) от 4 до 8 нуклеотидных и до 3 аминокислотных замен. Полученные результаты свидетельствует о тесной связи вирусной популяции, циркулирующей среди птиц, с эпидемическими штаммами вируса.
8 Показано, что сайт потенциального гликозилирования обол очечного белка Е у штаммов, выделенных в дельте Волги от птиц, представлен в четырех формах, при этом у двух штаммов, вследствие замены Asn(]54)—>Ser, функциональная активность сайта элиминирована.
Молекулярно - генетическая организация вируса Западного Нила
Вирус ЗН является типичным представителем рода Flavivirus и обладает всеми характерными для этого рода свойствами. Это РНК-содержащие вирусы диаметром около 45 нм, обладающие липидной оболочкой. В состав вири она входят три структурных белка: нуклекапсидный белок С (core), формирующий нуклеокапсид, оболочечный гликопротеид Е и мембранный белок М, которые входят в состав липопротеиновой оболочки вируса. Белок С (М 13 500) обладает РНК -связывающей активностью и в процессе сборки вириона вместе с геномной РНК упаковывается в нуклеокапсид, обладающий икосаэдрической симметрией. Белок С играет основную роль в реакции связывания комплемента. Липопротеиновая оболочка вируса образована липидами мембран ЭПР клетки-хозяина и двумя вирусными белками Е и М. Мембранный белок М (М»8200) обладает выраженными гидрофобными свойствами, вследствие чего практически полностью погружен в липидную оболочку. Главной функцией этого белка предположительно является вовлечение липидов мембран ЭПР в образование липопротеиновой оболочки вируса. Предполагается, что в составе липопротеиновой оболочки белок М за счет специфического связывания с оболочечным белком Е обеспечивает его правильную ориентацию. Гликопротеид Е (М«53000) является доминирующим антигеном в реакциях геммаглютинации и нейтрализации. Кроме того, на роль белка Е отводится функция связывания клеточных рецепторов и медиатора проникновения вируса через мембрану в клетку. Вследствие этого гликопротеид Е определяет нейровирулентность и нейроинвазивность нейротропных флавивирусов (Rice et al., 1986; McMinn, 1997). Геном флавивирусов представлен одноцепочечной, плюс-цепью РНК с молекулярным весом 4 106 и длиной около 11 т.н.о. (Rice et al., 1985; 1986).
Геномная РНК инфекционна и в клетке функционирует как мРНК. 5 - конец РНК кэпирован и вовлечен в образование 5 -терминирующей вторичной структуры, которая вместе с кэпом выполняет функцию связывания рибосомы (Brmton and Dispoto, 1988). 3 -конец не полиаденилирован, однако 3 -терминирующая последовательность высоко консервативна среди флавивирусов (Rice et al., 1986). Эта консервативная последовательность входит в состав 3 -терминальной вторичной структуры, которая, как предполагается, играет важную роль в репликации и инкапсулировании вирусной РНК (Rice et al., 1986; Shi et al., 1996). Геномная РНК содержит одну открытую рамку считывания (ОРС) длиной около 10 400 и.о., кодирующую приблизительно 3350 а.о. ОРС начинается с первого инициирующего кодона AUG в позиции 97-118 н.о. на 5 -конце и заканчивается тремя близко расположенными стоп-кодонами за 630-511 н.о. до З -конца. Таким образом, ОРС покрывает практически весь геном, за исключением 96 н.о. на 5- и 631 н.о. на З -концах. Других ОРС не обнаружено ни на геномной, ни на комплиментарной ей цепях (Rice et al., 1986), ОРС кодирует все вирусные белки, причем первоначально транслируется полипротеин - предшественник, из которого в процессе пострансляционного расщепления образуются индивидуальные белки. Гены структурных белков (С, М и Е) сосредоточены на 5 -конце и занимают только одну четвертую часть генома. Остальные три четверти занимают гены неструктурных белков, участвующих в репликации вируса. Общая схема организации генома флавивирусов представлена на рисунке 2. (Rice et al., 1985;Coiaetal., 1988). Нуклеотидная последовательность, окружающая инициирующий кодон, может сильно отличаться у разных флавивирусов. Как показано для вирусов желтой лихорадки и энцефалита Долины Мурей этот район представлен последовательностью G-A-A-C-A-.A-U-G.-U и U-U-C-A-A-.A-U-G.-U (Rice et al., 1986), соответственно. Для вируса ЗН этот же регион представлен U-C-U-C-G-.A-U-G.-U (Coia et al., 1988).
Нужно отметить, что эти последовательности не совпадают с консенсусной последовательностью Козак, показанной для эукариотических сайтов инициации: C-C-A/G-C-C-.A-U-G.-(G) (Rice et al., 1986). В геноме флавивирусов обнаружено несколько элементов и потенциальных вторичных структур, которые, вероятно, играют важную роль в процессах репликации, трансляции или инкапсулировании РНК. Особое внимание исследователей уделяется З -терминирующей последовательности, что связано с большой важностью этого региона для репродукции вируса. В этой области обнаружены два высоко консервативных элемента, представленные двумя терминирующими нуклеотидами ..CU0H И пентануклеотидом А-С-А-С-А...-3 (Rice et al., 1986). Эти элементы входят в состав З -терминирующей вторичной структуры, в образование которой вовлекаются 94 концевых нуклеотида (Brinton et al., 1986). Терминирующие нуклеотиды ..CUOH в этой структуре связаны водородными связями, а консервативный пентануклеотид формирует петлю, в которой связаны только два нуклеотида. Предполагают, что именно эти участки формируют сигнал связывания для вирусной репликазы и образования репликативного комплекса (Rice et al., 1986; Lindenbach and Rice, 1997; 1999). В ряде работ показано, что с 3 - терминирующей вторичной структурой флавивирусов способен связываться ряд клеточных белков, которые, вероятно, участвуют в регуляции репликации вируса (Blackwell and Brinton, 1995; 1997; Shi and Brinton, 1996). Еще одна вторичная структура предсказана в районе, разделяющем структурные и неструктурные белки. Ее функция неизвестна. Вероятно она участвует в регуляции синтеза вирусных белков (Rice et al., 1985; 1986; Coia etal, 1988). В З -НТР РНК флавивирусов в позиции между 10370 и 10520 н.о. описаны три повтора, длиной около 40 и.о. каждый. Эти повторы могут содержать от 4 до 6 замен между собой. Значение этих повторов в настоящее время неизвестно (Rice et al., 1985,1986; Coia et al, 1988). Наличие одной протяженной ОРС предполагает, что начиная с инициирующего AUG ко дона в позиции 97-100 на 5 -конце, трансляция продолжается почти до 3 -конца, в результате чего образуется большой полипротеин — предшественник, включающий в себя все вирусные белки. Индивидуальные вирусные продукты образуются в результате посттрансляционного расщепления этого полипротеина, причем выщепление некоторых белков происходит еще до конца трансляции (Yamshchikov and Compans, 1993; Nowak et al., 1989). Нужно отметить, что подобная модель полипротеина - предшественника также показана для пикорнавирусов и альфавирусов. В N-концевой части полипротеина (приблизительно 1Л) сосредоточены структурные белки: нуклеокапсидный белок С (core), который формирует нуклеокапсид вириона; предшественник мембранного белка М (ргеМ) и оболочечный гликопротеид Е, которые входят в состав липопротеиновой оболочки вируса. В остальной С -концевой части полипротеина сосредоточены неструктурные белки NS1-NS5, которые участвуют в процессах репликации вируса.
Процессинг полипротеина-предшественника - сложный, регулируемый процесс. В клетке полипротеин ассоциирован с мемраной эндоплазматического ретикулюма (ЭГТР), что обеспечиваеся наличием гидрофобных участков в некоторых вирусных белках. Эти гидрофобные участки, расположенные на С-концах белков С, М, Е и NS4a и на N—концах NS2a и NS4b протеинов заякориваются в мембране ЭПР, в результате чего полипротеин в клетке занимает сложное пространственное положение (Yamshchikov, Compans, 1993; Nowak et al.,1989). В процессинге структурных белков основную роль играют клеточные ферменты. Белок нуклеокапсида С в полипротеине состоит из 125 аминокислот, из которых до 25 % представлены Arg или Lys (Coia et al., 1988). Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белка С показал, что среди флавивирусов наиболее консервативным в белке является участок между 38 и 55 а/к. Предполагают, что этот домен ответственен за белок - РНК и белок - белковую интеграцию в процессе формирования нуклеокапсида (Rice et al., 1986). В ходе процессинга от N-конца белка нуклеокапсида отщепляется первый инициирующий метиониновый остаток (Met) и в зрелом белке первой аминокислотой является серии (Ser) (Rise et al.,1986). 15 С-терминальных аминокислот белка С образуют гидрофобный домен, который заякоривается в мембране и, вероятно, служит сигналом для клеточной сигнал азы. Расщепление между белками С и ргМ происходит по сайту Ala/Val-Gly/Ala-Ala и осуществляется сигнальной пептид азой (Coia et al., 1988). Образованию зрелого белка нуклеокапсида предшествует отщепление его гидрофобного домена, которое осуществляется вирусным протеазным комплексом NS2b-NS3 (Yamshchikov, Compans, 1993). Процессы расщепления С-ргМ и созревания белка С ассоциированы между собой и присутствие комплекса NS2b-NS3 необходимо для эффективного расщепления С-ргеМ клеточной сигналазой (Yamshchikov et al., 1997; Ryan et al, 1998).
Выделение тотальной РНК из осветленной клеточной или тканевой суспензии
К 200 мкл. лизирующего буфера (6 М гуанидинизотиоционата, 0.5 % N - лаурил саркозина, 50 мМ ацетата натрия рН 7.0, 2 % 2 - меркаптоэтанола) добавляли равный объем суспензии мозга и перемешивали на вортексе. К полученному раствору добавляли равный объем (400 мкл.) смеси водонасыщенного фенола (рН 5.0) с хлороформом в соотношении 4:1, соответственно. Пробу интенсивно перемешивали и инкубировали во льду в течение 15 минут. Для разделения фракций пробу центрифугировали в микроцентруфуге "Eppendorf", Германия на максимальной скорости в течение 15 минут при 4С. Водную фазу отбирали в чистую пробирку на 1,5 мл и преципитировали депротеионизированную РНК равным объемом изопропилового спирта в течение 1-го часа при -20С. РНК осаждали центрифугированием 30 минут при 4С на максимальной скорости. Осадок промывали 1 мл 80 % этанола и подсушивали на столе. Очищенную РНК ресуспендировали в 20 мкл. деионизованной воды, свободной от РНаз. Раствор РНК хранили при -20С две недели. 2.6 Проведение реакции обратной транскрипции Реакцию обратной транскрибции проводили в объеме 5 мкл. 2,65 мкл препарата РНК вносили в тонкостенную пластиковую пробирку объемом 0,2 мл и денатурировали при 72С в течение 2 минут, после чего быстро переносили в лед. К денатурированной РНК вносили 2,35 мкл реакционной смеси, содержащей следующие компоненты: M-MuLV буфер (100 мМ трис-НС1 (рН 8,3), 30 мМ MgCl2, 750 мМ КС1, 100 мМ DTT), по 0,5 мМ каждого из дНТФ, 20 пМ обратного праймера, 5 ед. ак. ингибитора РНаз "Promega", США и 15 ед. ак. M-MuLV обратной транскриптазы "Promega", США. Смесь инкубировали 45 минут при 42С.
Проведение полимеразной цепной реакции Полимеразную цепную реакцию (ПНР) проводили в тонкостенных пластиковых пробирках объемом 0,2 мл. Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл. В реакционную смесь входили следующие компоненты; ПЦР - буфер (85 мМ ацетата калия, 25 мМ трицина (рН 8,7), 8 % глицерина, 1 % диметилсульфоксида), 1,5 мМ AcMg, по 0,4 мМ каждого из дНТФ, по 10 пМ прямого и обратного праймеров, 5 мкл ДНК (продукт ОТ) и 5 ед. ак. Taq-ДНК полимеразы. Инкубацию реакционной смеси проводили при следующих условиях: 1) денатурация - 94С-30 сек; 2) отжиг праймеров от 55С до 60С -20 сек; 3) элонгация 72С - в зависимости от длины амплифицируемого фрагмента, из расчета 1 мин. на 1000 н.о. Число циклов составляло 35 в первом раунде и 25 во втором. 2.8 Электрофорез ДНК Электрофорез препаратов ДНК проводили в 1 - 2 % агарозном геле в трис - ацетатном буфере (ТАЕ) следующего состава: 0,04 М трис - ацетат, 0,002 М ЭДТА рН 8,0 в течении 1 - 2 часов при 100 В. Перед нанесением пробы на гель к ней добавляли 0,1 объем буфера для нанесения содержащего 50 % глицерина и 0,1 % бромфенолового синего. Для визуализации ДНК гель прокрашивали в течении 10-20 минут в растворе бромистого этидия (5 мкг/мл в ТАЕ). Учет результатов проводили в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм. Размер фрагментов ДНК определяли при сопоставлении электрофоретической подвижности продукта амплификации с фрагментами ДНК известной молекулярной массы. 2.9 Секвенирование ДНК Для определения нуклеотидных последовательностей использовался BigDye Termination Cycle Sequencing Kit, согласно инструкции производителя. Электрофорез одноцепочечной ДНК осуществлялся на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 DNA sequencer (Applied Biosystem, США). 2.10 Компьютерная обработка данных Используемые для подбора праймеров и сравнения нуклеотидные последовательности изолятов ЛЗН были получены в базе данных DDBJ/EMBL/GenBank. Нуклеотидные последовательности анализировали с использованием пакета программ "DNASTAR V 3.12", производства "Lasergen Inc. "(Madison, WI). Подбор праймеров проводился с использованием программ "Megalign" и "Amplify". Сравнение нуклеотидных последовательностей и построение филогенетических деревьев проводили методом ClustalW с помощью программы "Megalign". ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1 Разработка ОТ-ПЦР тест - системы для детекции вируса ЗН 3.1.1 Подбор праймеров В работе по подбору праймеров мы использовали нуклеотидные последовательности различных штаммов вируса ЗН, опубликованные в базе данных DDBJ/EMBL/GenBank. Нужно отметить, что к началу данной работы было опубликовано значительное количество коротких частичных последовательностей генома вируса ЗН. И только четыре полноразмерные первичные структуры генома, принадлежащие штаммам 1-ой (№D00246, №AF202541, №196836) и П-ой (№М12294) филогенетическим группам. Вместе с тем, результаты работы по изучению вируса ЗН, ведущейся в институте вирусологии им. Д.И. Ивановского (Львов и др., 2000; 2001;
Прилипов и др., 2001; 2002), предоставили в наше распоряжение последовательности большой 5 - концевой области генома 11 штаммов вируса ЗН, хранящихся в государственной коллекции вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского. Среди них были представители всех трех филогенетических групп, а также изолят Krsnl90, отнесенный к новой, впервые показанной IV -ой группе вируса ЗН (Прилипов и др, 2002). На основании сравнения всех доступных нуклеотидных последовательностей различных штаммов вируса ЗН было подобрано несколько праймеров, лежащих в 5 - концевой области вирусного генома (Табл.6, Рис.4). На рисунке 5 представлены места посадки подобранных праймеров для некоторых изолятов, использованных в работе. Для синтеза на матрице вирусной РНК комплиментарной ДНК был предложен праймер 626R. Здесь и далее номерное обозначение праймера соответствует позиции его посадки на геноме вируса ЗН. Буквами R и F обозначаются праймеры обратной и прямой (соответственно) комплиментарности. Место посадки праймера 626R расположено в области гена ргеМ, при этом в реакции обратной транскрипции синтезируется кДНК длинной 626 н.о. Для последующего проведения на матрице полученной кДНК ПЦР, были подобраны две пары праймеров. Первая пара IF и 518R для использования в первом раунде ПЦР и праймеры 26F и 518R для второго раунда. Как видно из рисунка 4 праймер 26F лежит внутри ампл икона, получаемого в первом раунде, т.е. ОТ-ПЦР тест - система является полу - гнездовой. Приблизительные значения температуры отжига праймеров, рассчитанные по формуле Тт = 22 + 1.46([2 х (G+C)] + (А+Т)) составляли от 65,8С до 73,1 С (Табл.5). Однако, эмпирически было установлено, что понижение температуры отжига в первом раунде до 55С не оказывает влияния на эффективность ПЦР. Учитывая вероятность выявления штаммов, не обладающих 100 % гомологией в местах посадки праймеров, было решено использовать в первом раунде для отжига праймеров именно 55С.
Аналогично, для второго раунда ПЦР решено использовать 60С. Прежде всего, работоспособность разработанной ОТ-ПЦР системы была протестирована со штаммами вируса ЗН, хранящимися в государственном музее вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. В нашем распоряжении было 12 различных штаммов ВЗН, выделенных в разное время из разных источников (см. Материалы и методы). Важно отметить, что среди музейных штаммов были представители всех 4 известных филогенетических групп вируса ЗН, что позволило нам оценить универсальность разрабатываемой ОТ-ПЦР тест -системы в отношении штаммов различных филогенетических групп. Для выделения РНК из инфекционного материала мы использовали стандартную методику с использованием гуанидинизотиоцианата с последующей фенол -хлороформной экстракцией (Chomczynski et al., 1987). При этом в эксперименте в качестве инфекционного материала использовался как культуральный материал (культуральная жидкость и суспензия клеток), так и суспензия мозга зараженных мышей. На рис. 6 представлена электрофореграмма с результатами ОТ-ПЦР, проведенной на матрице доступных музейных штаммов вируса ЗН. Как видно из рисунка, после первого раунда ПЦР получен ампликон размером около 520 и.о., что соответствует расчетным значениям (518 и.о.). После второго раунда ПЦР получен ампликон, размер которого равен приблизительно 500 и.о., что также соответствует расчетным значениям (493 и.о.). 3.1.2 Определение специфичности ОТ-ПЦР тест - системы Специфичность разработанной ОТ-ПЦР была определена с использованием различных вирусов, хранящихся в государственной коллекции вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.
Зараженность вирусом Западного Нила птиц дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы
Исследование зараженности вирусом ЗН птиц на территории дельты Волги и Волго - Ахтубинской поймы было проведено с использованием двух методов. Материалом служили осветленные суспензии гомогенизированных тканей мозга и селезенки птиц. Суспензии использовались для заражения культуры клеток Vero Е6 и параллельно тестировались в ОТ-ПЦР на предмет выявления вирусной РНК. В общей сложности подобным образом были протестированы образцы от И 23 птиц, из которых 315 были добыты в 2001 г., а 808 в 2002 г. Кроме того, нами были протестированы образцы от 26 мелких млекопитающих, собранных в 2002 г. на той же территории. 3.2.1 Выявление РНК вируса ЗН у птиц дельты Волги методом ОТ-ПЦР По данным ОТ-ПЦР скрининга, РНК вируса ЗН у птиц дельты Волги выявлена в 13,3 % (42 положительных пробы из 315) образцов 2001 г. и в 9,6% (60 положительных из 621) образцов 2002 года. Среди проб от птиц добытых в Волго - Ахтубинской пойме в 2002 г. этот показатель составил 3.3% (6 положительных из 187) (Рис.8). Если суммировать данные за два года, то РНК вируса ЗН обнаружена у 108 из 1123 птиц, что составляет 9,6%, Согласно Д.К. Львову (2000; 2002), в дельте Волги выделяют три основные географические зоны: авандельта, средняя дельта и верхняя дельта, (см. Материалы и методы). Поскольку исследуемый материал охватил все три зоны, зараженность птиц каждой зоны была проанализирована нами отдельно. При этом мы учитывали, что для эпидемического мониторинга интерес представляет уровень циркуляции вируса, прежде всего, среди синантропних птиц. Синантропные птицы, добытые в антропогенных биоценозах, в исследовании были представлены в основном птицами наземного комплекса. Большинство из них принадлежали семейству Врановые (Corvidae). Среди птиц, добытых в природных биоценозах (диких) преобладали птицы водного и околоводного комплексов.
Таким образом, зараженность вирусом ЗН птиц дельты Волги и Волго -Ахтубинской поймы анализировалась нами по двум критериям: 1) зараженность птиц различных природных зон дельты, 2) зараженность птиц, относящихся к разным экологическим комплексам (дикие и сининтропные). 3.2.1.1 Зараженность вирусом ЗН птиц в различных природных зонах дельты Волги Материал, собранный в 2001 г., охватывал только две природные зоны дельты Волги — среднюю дельту и авандельту. Наши результаты показали, что зараженность птиц аванделъты в 2001 г. составила 9,3 % (10 положительных образцов из 108). Это значение для птиц средней дельты составило в 15,5 % (32 положительных из 207). Материал, собранный в 2002 г., охватывал значительно большую территорию. Сюда, помимо аванделыпы и средней дельты вошел район северной части дельты - верхняя дельта и примыкающая к ней территория Волго-Ахтубинской поймы. Показатель зараженности птиц аванделъты в 2002 г. составил 4,3% (6 положительных из 138). Это значение для птиц средней дельты составило 7,5 % (12 положительных из 160). Самый высокий показатель зараженности птиц в 2002 г. получен для верхней дельты Волги -13 % (42 положительных из 323). Зараженность птиц Волго-Ахтубинской поймы определена как 3,2 % (6 положительных из 187) (Рис.9). Зараженность птиц, относящихся к диким биоценозам в 2001 г. составила 14,8 % (40 положительных из 271), а зараженность синантропных птиц 4,5 % (2 положительных из 44). Здесь нужно отметить, что материал в 2001 г. собирался в основном в диких биоценозах. Синантропные птицы были представлены мало. Вследствие небольшой выборки данный результат должен рассматриваться осторожно. В 2002 г. зараженность птиц диких биоценозов в дельте Волги составила 4,6% (17 положительных из 366). Этот показатель для птиц синантропного комплекса составил 16,9% (43 положительных из 255) (РисЛО). На территории Волго - Ахтубинской поймы в 2002 г. зараженность птиц диких биоценозов составила 2,2 % (2 положительных из 90). Зараженность синантропных птиц составила здесь 4,1 % (4 положительных из 97) В аваидельте зараженность птиц составила в 2001 г. 9,3 % (10 положительных из 108). Поскольку в аваидельте присутствуют только природные (дикие) биоценозы, этот результат отражает зараженность здесь птиц дикого комплекса. В 2002 г. для птиц данной зоны дельты был получен результат 4,4% (6 положительных из 137). Из птиц наземного (синантропного) комплекса в 2002 г. здесь была обследована (с отрицательным результатом) только одна ворона, добытая в 2002 г. В средней дельте в 2001 г. нами были протестированы 163 образца от птиц диких биоценозов и 44 пробы от синантропных птиц. Зараженность птиц диких биоценозов составила 18,4 % (30 положительных). Зараженность птиц синантропного комплекса составила 4,5 % (2 положительных). В 2002 г. зараженность диких птиц определена в 5,7 % (8 положительных из 141). Из 19 обследованных здесь в 2002 г. синантропных птиц, получено 4 пололожительных результата (21,1 %). В верхней дельте птицы были обследованы только в 2002 г. Зараженность птиц диких биоценозов составила 3,4 % (3 положительных из 68 88).
Среди птиц синантропного комплекса зараженность определена в 16,6 % (39 положительных из 235), Совокупный результат зараженности синантропных птиц в дельте Волги в 2002 г. составил 16,9% (Рис.11). Результаты обследования методом ОТ-ПЦР птиц дельты Волги и Волго — Ахтубинской поймы представлены в табл. 7. При развитии эпидемических ситуаций большое значение отводится, прежде всего, птицам синантропного комплекса (Tsai, 1997). Их массовость в населенных пунктах обеспечивает высокую вероятность передачи вируса, посредством комаров, местному населению. Кроме того, во время последних эпидемий ЛЗН в США и Волгограде отмечалась необычно высокая смертность ворон (С. brachyrhynchos и С. согопе соответственно), и на этом основании предлагается использовать ворон в качестве "сторожевых" маркеров ухудшения эпидемической ситуации (Львов, 2000). Вороны (Corvus. spp) принадлежат роду Corvus, семейства Corvidae (Врановые), и в нашем исследовании представители этого семейства составили большую часть птиц синантропного комплекса (215 из 396). Отметим, что этот положительный образец был одним из всего двух положительных среди синантропных птиц, обследованных в 2001 г. Вторая положительная проба принадлежала кукушке (Cue. canons). В 2002 г. суммарные значения зараженности вирусом ЗН птиц семейства Corvidae составили 18,1 % (37 положительных из 204). При этом зараженность ворон и грачей составила 14,8% и 18,2% соответственно (Рис.12), а их суммарная зараженность составила 18,1 % (36 положительных из 198). Из четырех соек (G. glandarius) положительный результат был обнаружен у двух. Также, положительный результат получен для одной из двух проб от сорок (P. pica) (Табл.8). В результате вирусологического обследования материала 2001 года на мышах - сосунках и параллельно на культуре клеток Vero Е6 было выделено несколько штаммов. Причем, среди них первичный материал при ОТ-ПЦР скрининге был положительным на вирус ЗН только для трех проб (номера полевого материала - 66, 115, 187). После пассажа на мышах, с использованием ОТ-ПЦР, только 4 штамма были идентифицированы как вирусы ЗН. Идентификация была подтверждена и в реакциях ИФА, РПГА и РН. Два из них, обозначенные LEIV-Ast01-66 и LEIV-AstOl-187 (номера полевого материала 66 и 187 соответственно), изолированы от большого баклана (Ph.carbo) и вороны (Схогопе) соответственно, добытых в средней зоне дельты. Причем, если баклан был добыт вдалеке от населенных пунктов в природном биоценозе, то ворона была отстрелена на свалке в окрестностях населенного пункта пос. Икряное. Еще два штамма вируса (LEIV-Ast-01-182, LEIV-Ast-01-183) выделены от нимф Hyalomma marginatus, собранных с той же вороны. Хотя в первоначальном скрининге эти нимфы не использовались, после выделения из них штаммов ВЗН, первичный материал был протестирован в ОТ-ПЦР с положительным результатом.
Генетический анализ штаммов вируса ЗН, выделенных в дельте Волги от птиц в 2001 и 2002 гг
Для изучения генетических свойств выделенных штаммов была определена нуклеотидная последовательность протяженного участка их генома, размером до 2500 т.н.о. Выбор данной области был продиктован тем, что на этом участке расположены все структурные гены вируса, анализ которых является наиболее информативным в филогенетических исследованиях (Berther et al., 1998; Burt et al., 2002; Scherret et. al., 2001, 2002). С этой целью на матрице РНК каждого штамма синтезировалась кДНК с использованием праймера 3536R. Затем, с полученной кДНК были амплифицированы 2 фрагмента: один длиной около 1700 н.о. с праймерами IF и 1690R, а другой длиной около 2600 н.о. с праймерами 1124F и 3467R (Рис.13). Используемые при этом праймеры были разработаны ранее в работах А.Г. Прилипова с соавт, (2001; 2002). Как видно из рисунка, фрагменты перекрывают около 3500 н.о. 5 - концевой области генома вируса, с перехлестом около 500 н.о. в районе гена Е. Секвенирование фрагментов было проведено с использованием нескольких праймеров. Для фрагментов 1F/1690R использовались праймеры IF, 650R, 826F и 1690R (Прилипов и др., 2001; 2002), а для фрагментов 1124F/3467R праймеры 1124F, 1856R и 1768F (А.Г. Прилипов, личное сообщение).
Также было проведено секвенирование части ГТЦР - ампликонов, полученных при скрининге. Ампликон представлял из себя фрагмент, длинной около 500 и.о., синтезированный с помощью праймеров 26F и 518R. Секвенирование проводили с использованием праймера 26F, в результате чего определялась нуклеотидная последовательность длиной около 150 н.о. внутри ампликона. Из 44 положительных образцов 2001 г. подобным образом были секвенированы 24. А из 66 положительных проб 2002 г. - 26. Полученные нуклеотидные последовательности анализировались с помощью пакета программ DNAstar (Lasergene). При анализе использовались нуклеотидные последовательности различных изолятов вируса ЗН, опубликованные в базе данных DDBJ/EMBL/GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Кроме того, использовались неопубликованные нуклеотидные последовательности некоторых музейных штаммов вируса, полученные лично от А.Г. Прилипова (лаб. Молекулярной генетики, ГУ НИИ вирусологии им Д.И. Ивановского РАМН). Анализ полученных нуклеотидных последовательностей показал, что все выделенные нами штаммы вируса ЗН демонстрируют между собой чрезвычайную близость. У четырех штаммов, выделенных в 2002 г. (Ast02-2-205, Ast02-2-208, Ast02-2-31, Ast02-3-570) рассматриваемый участок генома идентичен и не обнаруживает нуклеотидных замен. Остальные штаммы отличаются друг от друга нуклеотидными заменами в 1 - 3 позициях. Ранее в Астраханской области было выделено три штамма вируса ЗН. Один штамм (Нр-94) был выделен из клещей Н. marginatus в 1964 г. (Бутенко и др., 1964), и два штамма выделены в 1999 (Ast986) и 2000 (Ast901) гг. из крови больных людей (Lvov et al., 2000; Львов и др., 2000; Прилипов и др., 2001), во время крупных эпидемических вспышек ЛЗН. Большой интерес представляет сравнение штаммов вируса ЗН, выделенных в нашей работе, с этими эпидемическими штаммами. Сравнение нуклеотидных последовательностей показало, что в рассматриваемой области генома штаммы, выделенные нами от птиц, обнаруживают со штаммами Ast986 и Ast901 крайне низкое расхождение. Всего они несут по сравнению с Ast986 от 4 до 8 нуклеотидных замен, и от 2 до 6 по сравнению с Ast901. Поскольку Ast986, Ast901 и штаммы, изолированные в нашей работе, были выделены в дельте Волги в период с 1999 по 2002 гг., нами был проведен их ретроспективный анализ (Рис. 14).
При этом штамм Ast986 нами рассматривался как референсный, т.е. нуклеотидные последовательности штамма Ast901 и штаммов, выделенных в настоящей работе от птиц, анализировались по сравнению с ним, Штамм Ast901 в рассматриваемой области генома несет только две нуклеотидные замены в позициях 702 (GGA -» GGG) и 1432 (ССТ - ТСТ). Причем эти замены встречаются также у всех штаммов, выделенных в нашей работе от птиц в 2001 и 2002 гг. (кроме штамма Ast02-2-25, у которого замены в позиции 1432 нет). Штамм Ast01-66, выделенный нами в 2001 г., дополнительно несет еще две замены: в позициях 606 (GAT - GAC) и 2361 (CTG -+ СТА). Аналогично, такая же замена в позиции 2361 характерна для всех штаммов выделенных от птиц в 2002 г. Все штаммы, выделенные в 2002 г. несут еще две характерные замены в позициях 2319 (CGC -» CGT) и 528 (GAT - GAC) (кроме Ast02-3-717, у которого замена в позиции 528 отсутствует). Таким образом, все штаммы вируса ЗН, выделенные нами в дельте Волги в 2002 г. от птиц, несут пять общих нуклеотидных замен в позициях 528 (GAT - GAC), 702 (GGA - GGG), 1432 (ССТ- ТСТ), 2319 (CGC - CGT) и 2361 (CTG - СТА). У штамма Ast02-2-25 найдена одна дополнительная замена в позиции 963 (ТАС - ТАТ). Две дополнительные замены найдены у штамма Ast02-3-146 в позициях 455 (AGC - GAC) и 1368 (ААТ - ААС). У штамма Ast02-3-717 найдены три дополнительных замены в позициях 348 (ТТТ -» ТТС), 474 (СТС - СТТ) и 1796 (ААС - AGC). Также три дополнительные замены в позициях 158 (ATG -» AAG), 1108 (ATG - GTG) и 1433 (ССТ -» ТАТ) обнаружены у штамма Ast02-3-165 (Табл.12). В общей сложности по сравнению с Ast986 обнаружено 19 нуклеотидных замен в 17 позициях. Максимальное число нуклеотидных замен - 8 отмечено у одного штамма: - Ast02-3-165. Минимальное - 4 замены у штамма LEIV-AstOl-66. Остальные штаммы несли 5 (Ast02-2-205, Ast02-2-208, Ast02-2-31, Ast02-3-570, Ast02-2-25), 6 (Ast02-2-2044) и 7 (Ast02-2-298, Ast02-3-717, Ast02-3-146) нуклеотидных замен (Табл.12). Наиболее часто у исследованных штаммов вируса ЗН встречается замена Т —» С (в 6 позициях). Замены А -» G, С - Т, G —» А встречаются 5, 4 и 2 раза соответственно. И выявлено только по одному случаю замен С — А и Т -» А. Таким образом, большинство замен (17) являются заменами пурин - пурин или пиримидин — пиримидин, и только в двух случаях происходит замена пиримидин -» пурин (С — А и Т -» А).
Полученные результаты согласуются с работой J. Anderson (2001), в которой был проведен сравнительный анализ штаммов ВЗН, выделенных в 2000 г. на территории США. В этой работе анализировался более короткий участок генома, длиной около 900 н.о. в который входили часть гена core, ген ргеМ и часть гена Е. Авторами было показано, что на данном участке у штаммов, выделенных в 2000 г. обнаруживалось до 3 замен в сравнении со штаммом NY99, выделенном в 1999 г. (Anderson et al., 2001). При этом около половины изолятов от NY99 не отличались. В нашей работе исследовался несколько более протяженный участок генома, вероятно, поэтому число обнаруженных замен несколько больше. Кроме того, исследуемые нами штаммы были выделены через три года после выделения Астр986, и нужно учитывать накопление мутаций с течением времени. Результаты анализа нуклеотидных последовательностей ПЦР — ампликонов, полученных в результате ОТ-ГЩР скрининга, показали их практически полную идентичнось с аналогичными последовательностями выделнных от птиц штаммов. На основе нуклеотидных последовательностей, с использованием программы MegaLine, были предсказаны последовательности аминокислот в белках кодируемых данным регионом. Сюда вошла N - концевая область полипротеина - предшественника, содержащая все структурные белки вируса. При сравнении полученных аминокислотных последовательностей с анологичной последовательностью штамма Ast986 было показано, что из 19 нуклетидных замен только 7 приводили к замене аминокислоты. У штамма Ast02-3-165 замены аминокислот обнаружены в трех позициях, В белке core 21-я аминокислота меняется Met — Lys вследствие замены Т - А в позиции 158 и.о., в результате чего кодон ATG меняется на AAG. В белке Е найдены две аминокислотные замены - в позициях 48 и 156 а/к (от N-конца белка Е). В первом случае происходит замена Met — Val (ATG — GTG), а во втором Ser -У Туг (ТСТ — ТАТ). Отметим, что подобная замена в 156 позиции встречается также у штамма Ast901, выделенного в 2000 г. В позиции 156 а/к также расположена замена у штамма Ast02-2-25. В данном случае Ser меняется на Pro (ТСТ —» ССТ). У штаммов Ast02-2-2044 и Ast02-2-298 154-ой аминокислотой в белке Е является Ser вместо Asn (ААС - AGC).
