Введение к работе
Актуальность темы
Бактериальные системы рестрикции-модификации (системы РМ) являются одним из интереснейших объектов, изучаемых в молекулярной биологии Несмотря на большое число обнаруженных и охарактеризованных систем РМ микроорганизмов и установление их роли в защите бактериальной клетки от вторжения чужеродной ДНК, биологическое значение этих систем не выяснено до конца Система рестрикции-модификации включает в себя как минимум два фермента сайт-специфические эндонуклеазу рестрикции и ДНК-метилтрансферазу, узнающих одну и ту же короткую последовательность ДНК
Одной из фундаментальных проблем современной молекулярной биологии является проблема белок-нуклеинового взаимодействия Эндонуклеазы рестрикции и ДНК-метилтрансферазы входят в ряд наиболее удобных объектов для исстедования этой проблемы Это обусловлено целым рядом уникальных свойств данных ферментов, таких как высокая субстратная специфичность, огромное разнообразие узнаваемых последовательностей (более 250), а также небольшой молекулярный вес и относительная простота организации На сегодняшний день значительное количество генов, относящихся к системам РМ, клонировано, выделены рекомбинантные белки и получены кристаллы ферментов Это позволило достигнуть существенного прогресса в понимании той роли, которую играют процессы специфического метилирования и расщепления ДНК в жизнедеятельности клетки В то же время успешное развитие многих направлений молекулярной биологии и генетической инженерии немыслимо без расширения ассортимента эндонуклеаз рестрикции, которые являются одними из ключевых инструментов в этих областях науки
Поэтому особенную актуальность сегодня приобретает решение таких задач, как открытие новых систем рестрикции-модификации, изучение структуры и механизмов регуляции оперонов систем РМ, получение суперпродуцентов ферментов рестрикции-модификации, выявление ключевых аминокислотных последовательностей, отвечающих за связывание с сайтом узнавания на ДНК и катализ, а также поиск доказательств наличия эволюционных связей у различных групп ферментов
Цель и задачи исследования
Целью данной работы являлось изучение системы рестрикции-модификации II типа Sse9I
; J ч*
из бактериального штамма Sporosarcina species 9D В задачи настоящего исследования входило
установление субстратной специфичности и места расщепления ДНК новой
эндонуклеазой рестрикции Sse9I,
получение геномной библиотеки штамма Sporosarcina species 9D в Е coh с целью
обнаружения плазмиды, несущей ген ДНК-метилтрансферазы Sse9I,
определение основания, модифицируемого метилтрансферазой Sse9I, клонирование гена sse9IM в экспрессирующий вектор и получение гомогенного препарата рекомбинантной М Sse9I,
определение нуклеотидной последовательности и порядка расположения генов в опероне системы рестрикции-модификации Sse9I,
сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белков системы рестрикции-модификации Sse9I с последовательностями близкородственных полипептидов
- клонирование гена эндонуклеазы рестрикции Sse9I в экспрессирующий вектор и
получение препарата рекомбинантного фермента,
Научная новизна и практическая ценность работы
В результате выполнения данной работы найден бактериальный штамм Sporosarcina species 9D, являющийся продуцентом новой эндонуклеазы рестрикции II типа Sse9I Фермент узнает последовательность ДНК 5'-ААТТ-3' и расщепляет ее перед первым остатком аденина В отличие от термофильного прототипа, Tsp509I, работающего только при 65 С, рестриктаза Sse9I проявляет максимальную активность при 55 С и сохраняет 75% активности при 37 С Способность образовывать в результате реакции фрагменты ДНК с 5'-выступающими концами, комплементарными концам, образованным при гидролизе рестриктазами EcoRI (5'-GiAATTC-3'), Muni (5'-C|AATTG-3') и Apol (5'-RjAATTY-3') позволяет широко применять новый фермент в молекулярно-биологических и генно-инженерных экспериментах
Путем клонирования получена рекомбинантная плазмида pSse9/l, несущая ген ДНК-метилтрансферазы Sse9I Впервые определена специфичность метилтрансферазы, узнающей последовательность ДНК 5'-ААТТ-3' Анализ аминокислотной последовательности М Sse9I позволил сделать вывод, что новый фермент относится к классу Di2 ДНК-метилтрансфераз Ген sse9IM клонирован в экспрессирующий вектор, и выделен гомогенный препарат рекомбинантной М Sse9I из Е coh
Установлена нуклеотидная последовательность и порядок расположения всех генов, входящих в оперон системы рестрикции-модификации Sse9T Анализ аминокислотной последовательности С Sse9I показал наличие НТН-мотива, характерного для белков - регуляторов транскрипции Непосредственно перед геном sse91C выявлена последовательность ДНК (С-бокс), перекрывающаяся с областью промотора и гомологичная участкам связывания С-белков ряда систем рестрикции-модификации
Показано, что аминокислотная последовательность R Sse9I проявляет сходство с эндонуклеазами рестрикции Muni (5'-CAATTG-3') и EcoRI (5-GAATTC-3'), главным образом за счет консервативных мотивов PD/E ЕХК и GNAXER, ответственных за катализ и узнавание общей внутренней тетрануклеотидной последовательности ДНК ААТТ Такая гомология может свидетельствовать об эволюционном родстве упомянутых эндонуклеаз рестрикции и подтверждает наличие общего механизма специфичного узнавания у данной группы ферментов На основе сходства ключевых структурных элементов нового фермента с RMunI и R EcoRI предложена модель пространственной структуры эндонуклеазы рестрикции Sse9I Два варианта гена sse9IR клонированы в экспрессирующий вектор С использованием конструкции, содержащей короткий вариант гена, получен препарат рекомбинантной эндонуклеазы рестрикции Sse9I
Апробация работы
Материалы исследований по теме диссертации представлены на следующих российских и международных конференциях "4th New England Biolabs Workshop on biological DNA modification" (Инсбрук, Австрия, 1997), "2nd International symposium Separations in the BioSciences" (Прага, Чехия, 2001), "ПІ Съезд Биохимического Общества" (Санкт-Петербург, Россия, 2002), "5th New England Biolabs Meeting on restriction/modification" (Бристоль, Великобритания, 2004)
Публикации
По материалам диссертации были опубликованы три печатные работы
Структура и объем работы
