Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Структура и фолдинг белков: современные представления 9
1.2. Флуоресцентные белки 12
1.2.1. Спектральные свойства флуоресцентных белков 14
1.2.1.1. Флуоресцентные белки из класса Anthozoa 14
1.2.1.2. Флуоресцентные белки из других классов организмов 15
1.2.1.3. Aequorea GFP и его улучшенные варианты 16
1.2.1.4. Фотоактивируемые флуоресцентные белки 17
1.2.2. Структурные свойства флуоресцентных белков 19
1.2.2.1. Пространственная структура, топология и олигомеризация 19
1.2.2.2. Механизмы образования хромофора 21
1.2.2.3. Микроокружение хромофора 23
1.2.3. Конформационная стабильность флуоресцентных белков 25
1.3. Одорант-связывающие белки 26
1.3.1. Лиганды OBPs 27
1.3.2. Трехмерная структура OBPs 27
1.3.3. Комплексы OBPs с молекулами одорантов 30
1.3.4. Предположительная роль OBPs 32
1.3.5. Конформационная стабильность рОВР 34
ГЛАВА 2: Материалы и методы 36
2.1. Материалы 36
2.2. Методы 37
2.2.1. Анализ пространственной структуры белка 37
2.2.2. Флуоресцентные измерения 39
2.2.3. Регистрация и анализ кривых затухания флуоресценции 40
2.2.4. Измерение спектров кругового дихроизма 40
2.2.5. Измерение равновесных кривых денатурации 41
2.2.6. Измерение кинетических кривых денатурации белков 42
2.1.1. Тушение флуоресценции акриламидом 42
2.2.1. Анализ экспериментальных данных о процессе сворачивания-разворачивания белков с использованием параметрического представления двух независимых экстенсивных характеристик системы 43
2.2.2. Расчет кинетических параметров 45
2.2.10. Расчет термодинамических параметров 45
ГЛАВА 3: Результаты и обсуждение 48
3.1. Особенности процессов денатурации egfp и его мутантных форм с заменами в положении 96 49
3.1.1. Экспрессия EGFP и его мутантных форм в бактериальных клетках 49
3.1.2. Кинетика созревания хромофора EGFP и его мутантных форм 49
3.1.3. Влияние точечных аминокислотных замен в положении 96 на структуру EGFP..50
3.1.4. Особенности денатурации EGFP под действием GdnHCl. Влияние замен в положении 96 на стабильность EGFP 63
3.2. Роль четвертичной структуры в стабилизации флуоресцентных белков .71
3.2.1. Спектральные свойства мономерных и олигомерных FPs 72
3.2.2. Вторичная и третичная структура флуоресцентных белков 72
3.2.3. Спектры флуоресценции и доступность хромофора молекулам растворителя 75
3.2.4. Особенности триптофановой флуоресценции 75
3.2.5. Кинетика денатурации под действием гуанидингидрохлорида 79
3.2.6. Квазистационарные зависимости 83
3.3. Разворачивание-сворачивание овр под действием gdnhcl и нагревания 92
3.3.1. Локальные предденатурационные изменения структуры ОВР под действием небольших концентраций GdnHCl 104
3.3.2. Устойчивость структуры ОВР к денатурирующему действию GdnHCl 109
3.3.3. Тепловая денатурация ОВР 115
Выводы 120
Список цитируемой литературы
- Спектральные свойства флуоресцентных белков
- Регистрация и анализ кривых затухания флуоресценции
- Кинетика созревания хромофора EGFP и его мутантных форм
- Спектральные свойства мономерных и олигомерных FPs
Введение к работе
Актуальность исследования 5
Цели и задачи исследования 6
Основные положения, выносимые на защиту 6
Научная новизна исследований 7
Теоретическое и практическое значение работы 7
Спектральные свойства флуоресцентных белков
По положению спектра флуоресценции FPs из класса Anthozoa можно разделить на три основные группы (Labas et al., 2002): зеленые ( 485-520 нм, Anthozoa GFP), желтые (-540 нм, Anthozoa YFP) и оранжево-красные ( 570 нм, Anthozoa RFP). Кроме того, было обнаружено несколько белков с двухцветной флуоресценцией (красной и зеленой) и нефлуоресцентньтх CPs (Labas et al., 2002). Белки последней группы эффективно поглощают свет, однако не флуоресцируют.
Следует заметить, что большое практическое значение имеет создание мутантных форм FPs, спектр флуоресценции которых сдвинут в более длинноволновую область, где автофлуоресценция клеток (флуоресценция флавинов, витаминов и NAD(P)H) значительно ниже, чем в сине-зеленой области спектра. На основании красного флуоресцентного белка DsRedl из кораллов Discosoma была создана широко используемая в настоящее время мономерная мутантная форма mRFPl с более длинноволновым положением спектров возбуждения (584 нм) и флуоресценции (607 нм) по сравнению с DsRedl. В последующем на основе mRFPl была сконструирована целая группа улучшенных мономерных красных FPs, таких как mOrange, mStrawberry, mCherry, mRaspberry и mPlum (Shaner et al., 2004), перекрывающих красную и дальнюю красную области спектра, обладающих существенно большими скоростями созревания хромофора, имеющих большую яркость и фотостабильность. Совсем недавно на основании красного флуоресцентного белка eqFP578 (димерный белок со склонностью к образованию терамеров) из морской актинии Entacmaea qiiadricolor были созданы мономерные белки TagRFP и mKate, флуоресцирующие в красной и дальней красной области спектра (Merzlyak el al., 2007; Shcherbo et al., 2007), которые отличаются высокой яркостью, фотостабильностью и высокой скоростью созревания хромофора. Кроме того, TagRFP имеет чрезвычайно высокую рН-стабильность (рКа 4.0), в силу чего данный белок может быть превосходным маркером при использовании в органеллах с кислыми значениями рН. Флуоресцентные белки из других классов организмов
Основная часть FPs, выделенных из организмов класса Hydrozoa, принадлежит к классу зеленых флуоресцентных белков с максимумами флуоресценции в области 490-520 им. Из всех природных FPs этого класса только avGFP имеет спектр поглощения с максимумом в УФ-области. Остальные зеленые белки имеют спектры поглощения с максимумом в диапазоне от 465 нм до 498 нм. Недавно, из Anthomednsae sp. был выделен белок anm2CP, являющийся хромопротеином, а из медузы Phialidium sp. был выделен желтый флуоресцетный белок, phiYFP (Ianushevich et al., 2005). В противоположность zoanYFP (класс Anthozoa), phiYFP содержит тирозин в положении 203. Следует заметить, что замена Thr203 на Туг в avGFP приводит к сдвигу спектра флуоресценции в желтую область спектра. Таким образом, phiYFP является единственным обнаруженным природным FPs, в котором реализуется та же стратегия, которая была использована при создании желтых флуоресцентных мутантных форм на основе avGFP.
Настоящей сенсацией стало клонирование шести FPs из морских веслоногих рачков класса Copepoda типа Arthropoda. Два FPs были выделены из Pontellina plumata (ppluGFPl и ppluGFP2), один из Labidocera aestiva (laesGFP), два из Pontella meadi (pmeaGFPl и pmeaGFP2) и один из неустановленного вида (pdaelGFP). Все эти белки флуоресцируют в зеленой области спектра с максимумом флуоресценции от 500 до 511 нм. Отличительной особенностью GFPs этого класса является отсутствие в их составе триптофановых остатков (только laesGFP содержит Тгр в положении 179), что объясняет низкую интенсивность флуоресценции данных белков при возбуждении на длине волны 280 нм. Происхождение FPs у организмов, столь неродственных кишечнополостным, пока остается загадкой.
Более того, эндогенные FPs были обнаружены также в представителях вторичноротых царства животных, а именно в Branchiostoma floridae, В. lanceolatum, и В. belcheri (тип Chordata, подтип Cephalochordata, Amphioxus sp.) (Deheyn et al., 2007).
Спектры поглощения и возбуждения флуоресценции GFP дикого типа из медузы Aeqiiorea victoria имеют более сложную форму по сравнению с остальными FPs класса Hydrozoa. Основная полоса спектра возбуждения флуоресценции этого GFP имеет максимум при 395 нм, интенсивность этой полосы примерно в три раза больше интенсивности минорной полосы с максимумом при 475 нм. Возбуждение в области полосы с максимумом 395 нм приводит к возникновению спектра флуоресценции с максимумом 508 нм, тогда как при более длинноволновом возбуждении (475 нм) возникает флуоресценция с максимумом спектра при 503 нм. Зависимость положения спектра флуоресценции от длины волны возбуждающего света свидетельствует о том, что существуют, по меньшей мере, две различные формы хромофора, равновесие между которыми не успевает установиться за время жизни в возбужденном состоянии. Повышение рН приводит к увеличению интенсивности поглощения в полосе с максимумом при 475 им и уменьшению интенсивности полосы с максимумом при 395 нм. Было высказано предположение (Cubitt et al., 1995), что полоса поглощения с максимумом 475 нм появляется за счет молекул GFP, содержащих депротонированный (анионный) хромофор, тогда как полоса с максимумом при 395 нм связана с поглощением GFP, содержащим протонированный (нейтральный) хромофор. По-видимому, хромофор депротонируется в возбужденном состоянии, что характерно для фенолов.
Регистрация и анализ кривых затухания флуоресценции
Для того чтобы получить информацию о доступности молекулам растворителя триптофановых остатков и хромофора, проводили эксперименты по тушению триптофановой флуоресценции и флуоресценции хромофора внешним тушителем акриламидом. Концентрацию белка в исследуемых растворах составляла 0.1 мг/мл для ОВР и 0.05-0.1 мг/мл для флуоресцентных белков. Триптофановую флуоресценцию возбуждали светом с длиной волны 297 нм и регистрировали при 340 нм для ОВР и в максимуме триптофановой флуоресценции для флуоресцентных белков. Флуоресценцию хромофора возбуждали при длине волны 365 нм и регистрировали при 510 нм (zFP506, EGFP и его мутантные белки), 612 нм (mRFPl), 584 нм (dimer2) и 580 нм (DsRedl). При обработке данных делали поправку на вклад в регистрируемое свечение растворителя. Оценку констант тушения проводили с использованием соотношения Штерн-Фольмера: j=l+Ksv[Q], (2.10) где 70 и / - интенсивности флуоресценции в отсутствие и в присутствии тушителя соответственно, Ksv - константа тушения Штерн-Фольмера, [Q] - концентрация тушителя. Бимолекулярная константа процесса столкновения флуоресцирующих молекул в возбужденном состоянии и молекул тушителя (kq) была рассчитана с использованием соотношения: K,= -, (2.11) где г - среднеквадратичное время жизни флуоресценции в отсутствие тушителя.
Анализ экспериментальных данных о процессе сворачивания-разворачивания белков с использованием параметрического представления двух независимых экстенсивных характеристик системы
Впервые подход для изучения конформационных превращений белков, основанный на построении параметрических зависимостей интенсивностеи флуоресценции, зарегистрированных при двух длинах волн, был предложен Бурштейном (Бурштейн, 1976) и назван методом фазовых диаграмм. В последующие годы этот метод использовался крайне редко (Permyakov et al., 1980).
Метод заключается в построении параметрических зависимостей между двумя независимыми экстенсивными характеристиками системы. Любая экстенсивная характеристика системы, состоящей из двух компонент, определяется простым выражением: l(0) = a{(0)lx+a2(0)l2, (2.12) где 1\ и 1г - значения /(0), отвечающие 100 %-му содержанию в системе первой и второй компонент соответственно, а ах(0) и сс2(р) — относительные доли этих компонент в системе, ах(0) + а2(0) = \, в -любой параметр, при изменении величины которого изменяется доля компонент в системе. В качестве такого параметра могут выступать, например, концентрация денатуранта, температура, рН раствора и т.п. Соотношение (2.12) применимо только для экстенсивных характеристик, описывающих систему количественно. Доля компонент в системе и константа равновесия К, может быть определена с помощью простых соотношений: «,(e)-:#Li, LzM. K(e)=lfM. (2ЛЗ)
Соотношения (2.13) не выполняются для интенсивных характеристик системы, таких как положение спектра флуоресценции, параметр А, анизотропия флуоресценции и др., описывающих систему качественно (Eftink, 1994; Эфтинк, 1998), что, однако, часто не принимается в расчет при исследовании конформационных переходов белков. Для любых двух независимых экстенсивных характеристик имеем: lx(e) = aX0)lu+cc2(9)hM (2-14) /2 {О) = ах {в)1и + а2 {o)l22. (2.15) Исключая сг,(#) и а2(в) из соотношений (2.14) и (2.15), мы получим зависимость между /, {в) и 12 {в): ф) = а + Ы2(в), (2.16) где а = /п—— —1\2 и Ь = — —. Соотношение (2.16) означает, что если при г.г — -4,2 г,г \,2 изменении параметра 9 переход между состояниями 1 и 2 происходит по принципу «все или ничего» без образования промежуточных состояний, то регистрируемая экспериментально параметрическая зависимость между любыми двумя экстенсивными характеристиками должна быть линейной. Если экспериментально зарегистрированная параметрическая зависимость двух экстенсивных характеристик системы не является линейной, то это однозначно свидетельствует о том, что переход исследуемого объекта из начального в конечное состояние не является одностадийным и происходит с образованием одного или нескольких промежуточных состояний.
Этот подход был использован в нашей лаборатории для изучения для детального изучения процессов сворачивания-разворачивания и доказательства существования промежуточных состояний для ряда белков (Кузнецова и др., 2005; Степаненко Ольга и др., 2005; Kuznetsova et al., 2002b; Kuznetsova et al., 2004), в том числе при изучении данных кинетических экспериментов, когда в качестве параметра выступает время после перевода белка в раствор денатуранта соответствующей концентрации (Поварова и др., 2005; Kuznetsova et al., 2002а; Turoverov, Kuznetsova 2003). В последние годы этот метод уже широко используется исследователями из других лабораторий (Altschuler et al., 2005; Das et al, 2005).
Кинетика созревания хромофора EGFP и его мутантных форм
Как уже отмечалось, созревание хромофора в мутантных белках EGFP Arg96 Ser и EGFP Arg96 Ala является чрезвычайно медленным процессом. Действительно, эти белки приобретают заметное зеленое свечение лишь через полгода после их выделения. Интенсивность флуоресценции хромофора этих мутантных форм EGFP примерно в 50 раз ниже интенсивности зеленой флуоресценции EGFP. Следует заметить, что максимумы спектра флуоресценции хромофора этих мутантных форм EGFP сдвинуты в более коротковолновую область (500-504 нм) по сравнению с EGFP (рис. 3.3 и табл. 3.1). Это может быть обусловлено различиями взаимодействия зеленого хромофора с микроокружением либо тем, что конформация образовавшегося хромофора у этих мутантных форм отличается от конформации хромофора в EGFP.
На рисунке 3.4 представлены спектры флуоресценции единственного триптофанового остатка EGFP и его мутантных форм. Оказалось, что спектры триптофановой флуоресценции EGFP и мутантных форм EGFP Arg96 Ser, EGFP Arg96 Cys и EGFP Arg96 Ala существенно отличаются по положению максимума флуоресценции. Самый длинноволновый максимум спектра триптофановой флуоресценции (340 нм) имеет мутантная форма EGFP Arg96 Cys. Спектр флуоресценции EGFP имеет максимум при длине волны 336 нм, мутантных форм EGFP Arg96 Ala и EGFP Arg96 Ser - при 323 и 324 нм. Как известно, положение и форма спектра триптофановой флуоресценции определяются как степенью доступности триптофановых остатков молекулам растворителя, так и особенностями микроокружения триптофанового остатка: присутствием в составе микроокружения собственных полярных групп боковых цепей аминокислот и групп тушителей флуоресценции, наличием безызлучательного переноса энергии от тирозиновых остатков к триптофановым и между триптофановыми остатками. Результаты, полученные методом собственной УФ-флуоресценции, подтверждают данные, полученные методом КД в ближней УФ-области, свидетельствующие об изменении жесткости микроокружения ароматических остатков EGFP при введении аминокислотных замен в положение флуоресценции мутантного белка EGFP Arg96 Ala, измеренный через полгода после выделения белка, смещен в более коротковолновую область по сравнению со спектром, измеренным сразу после получения этого белка (см. также табл. 3.1). Это свидетельствует об изменении со временем свойств микроокружения триптофанового остатка этого мутантного белка. Таким образом, все исследованные белки сразу после выделения имеют уже сформировавшуюся структуру. Все эти белки имеют сходную вторичную структуру типа р-бочонка. При этом, скорость созревание хромофора мутантиых форм EGFP с заменами Arg96 Ala и Arg96 Ser существенно снижена по сравнению со скоростью созревания хромофора в EGFP. В случае мутантного белка EGFP Arg96 Ala созревание хромофора через полгода после получения этого белка приводит к дополнительным изменениям структуры белка, что и вызывает коротковолновый сдвиг положения спектра триптофановой флуоресценции EGFP Arg96 Ala (Stepanenko et al., 20086).
Спектры собственной флуоресценции EGFP и его мутантных форм, измеренные при длинах волн возбуждения 280 и 297 нм, различаются на коротковолновом краю (рис. 3.5). Это обусловлено тем, что при возбуждении при длине волны 280 нм в суммарное излучение вносят вклад тирозиновые остатки. Наряду с одним триптофановым остатком EGFP содержит девять тирозиновых остатков. Основной вклад в излучение могут вносить пять из этих остатков (Туг39, Туг74, Тугі 51, Тугі 82 и Туг200), поскольку, как показал расчет, выполненный на основании рентгеностркутурных данных, остальные тирозиновые остатки достаточно эффективно передают энергию возбуждения на Тгр57. Эффективность безызлучательного переноса энергии возбуждения от Туг143, Туг145, Туг92 и ТугЮб к Тгр57 составляет 96, 91, 49 и 47 %, соответственно. Между тирозиновыми остатками практически нет переноса энергии.
Спектры флуоресценции, зарегистрированные при длине волны 280 нм (кривые 1) и 297 нм (кривые 2) и вклад в суммарную флуоресценцию тирозиновых остатков для EGFP (панель а) и EGFP Arg96 Ala (панель б). Для EGFP Arg96 Ala спектры регистрировались сразу после получения белков (пунктирная линия) и через полгода после их вьщеления (сплошная линия). За единицу принято значение интенсивности флуоресценции при длине волны 365 нм. остается неизменной. Величину А(Х) нельзя использовать для характеристики различия вклада во флуоресценцию тирозиновых остатков, если интенсивность триптофановой флуоресценции в двух сравниваемых состояниях белка различается. Поэтому возрастание величины А(Х) ДЛЯ EGFP Arg96 Ala (рис. 3.5, б) и EGFP Arg96 Ser (данные не показаны) может быть обусловлено не только увеличением вклада тирозиновых остатков в излучение (обычно вклад тирозиновых остатков возрастает при разворачивании белка за счет уменьшения эффективности переноса энергии от тирозиновых остатков к триптофановым), но и уменьшением интенсивности флуоресценции триптофанового остатка, например за счет увеличения эффективности переноса энергии возбуждения триптофанового остатка на созревший хромофор.
Дополнительную информацию о структуре белков могут дать эксперименты по тушению триптофановой флуоресценции и флуоресценции хромофора внешним тушителем акриламидом. На рисунке 3.6 и в таблице 3.2 представлены Штерн-Фольмеровские зависимости и константы тушения, а так же рассчитанные на их основе бимолекулярные константы скорости столкновения молекул тушителя и флуоресцирующих центров (триптофанового остатка и зеленого хромофора) в возбужденном состоянии. Константы динамического тушения триптофановых остатков и, особенно, хромофора, имеют очень низкие значения. Для сравнения, константа динамического тушения триптофановых остатков в водном растворе равна величине 5.9-109 М" сек" . Данное обстоятельство свидетельствует о низкой доступности триптофановых остатков молекулам растворителя и позволяет считать хромофор практически недоступным молекулам растворителя. Сравнение величины константы динамического тушения триптофановых остатков для EGFP и его мутантных форм свидетельствует о том, что наименее доступен для растворителя триптофановый остаток мутантной формы EGFP Arg96 Ala, а наиболее -триптофановый остаток мутантной формы EGFP Arg96 Cys. Эти результаты хорошо согласуются с результатами измерения положения максимума спектров триптофановой флуоресценции этих белков
Спектральные свойства мономерных и олигомерных FPs
Как уже говорилось, многие FPs являются тетрамерами и димерами, что ограничивает возможность их использования для мечения белков. С целью выяснения роли четвертичной структуры в стабилизации FPs в настоящей работе проведен сравнительный анализ нескольких FPs с различной степенью олигомеризации, а именно EGFP (зеленого мономера), zFP506 (зеленого тетрамера), mRFPl (красного мономера), dimer2 (красного димера) и DsRedl (красного тетрамера) (Verkhusha et al., 2003; Stepanenko Olesya et al., 2004; Степаненко Олеся и др. 2005).
Известно, что основные спектральные характеристики флуоресцентных белков (такие как положение и форма спектров поглощения и флуоресценции) зависят не только от вида хромофора, который они содержат, но и от особенностей микроокружения хромофора (Cubitt et al., 1995). Так как пять исследуемых нами белков различаются по своей аминокислотной последовательности, то неудивительно, что спектральные свойства данных белков также различаются. Спектры поглощения EGFP (зеленого мономера), zFP506 (зеленого тетрамера), mRFPl (красного мономера), dimer2 (красного димера) и DsRedl (красного тетрамера) представлены на рис. 3.10. Красные флуоресцентные белки имеют спектр поглощения с максимумами при длинах волн 548, 555 и 580 нм для dimer2, DsRedl и mRFPl соответственно. Спектры поглощения красных FPs имеют довольно сложный вид. Все они содержат коротковолновую полосу поглощения с максимумом вблизи 334 нм; спектры DsRedl и dimer2 имеют два плеча при длинах волн 480-490 и 520 нм, в то время как спектр mRFPl в дополнение к длинноволновому плечу при 550 нм содержит еще две полосы поглощения с максимумами около 500 нм и 380 нм (рис. 3.10). Спектры поглощения зеленых флуоресцентных белков имеют значительно более простую форму. Спектры EGFP и zFP506 имеют максимум поглощения при длине волны 486 и 487 нм соответственно; в спектрах обоих белков присутствует плечо вблизи 460 нм, спектр EGFP имеет дополнительное плечо при 400 нм (рис. 3.10).
Спектры КД всех исследованных в этой работе белков в дальней УФ-области практически полностью совпадают (данные не представлены). Поэтому можно считать, что вторичная структура всех пяти белков весьма сходна. Спектры КД в видимой и ближней УФ-области спектра для зеленых флуоресцентных белков существенно различаются (рис. 3.11). Для всех флуоресцентных белков в видимой области спектра наблюдается небольшой отрицательный эффект Коттона, что хорошо согласуется с данными, полученными ранее (Visser et al., 2002).
На рис. 3.12, а представлены спектры флуоресценции EGFP, zFP506, mRFPl, dimer2 и DsRedl, которые были приведены к единице в максимуме флуоресценции. Специфическая флуоресценция хромофора данных белков имеет максимум на длине волны 506, 510, 584, 586 и 612 нм для zFP506, EGFP, dimer2, DsRedl и mRFPl соответственно. Недавно была определена пространственная структура zFP506 (Pletneva et al., 2007). Ренгеноструктурные данные показали, что хромофор в zFP506 образуется из аминокислотной последовательности, отличной от хромофор-образующего трипептида EGFP, а именно Asn65yr66-Gly67. Тем не менее, структура хромофора zFP506 идентична структуре хромофора EGFP и состоит из пятичленного гетероцикла имидазолона, соединенного мостиком с фенольным кольцом остатка Тугбб, который находится в суя-конформации относительно связи Ca-N(66). Также показано, что субъединицы белка в тетрамере zFP506 деформированы и мономер этого белка (впрочем, как и мономер DsRedl) при рассмотрении сверху имеет овальную форму. Известно, что локальные изменения микроокружения хромофора, например, ориентация заряженных групп, может приводить к сдвигу положения спектра поглощения и/или флуоресценции вплоть до 20 нм в любом направлении (Tsien, 1998; Baird et al., 2000; Shu et al., 2006). Поэтому, можно предположить, что отличие спектральных свойств в зеленом мономере и тетрамере, а также в серии исследуемых здесь красных флуоресцентных белков, обусловлено именно различиями в микроокружении хромофора. Эксперименты по тушению флуоресценции хромофора внешним тушителем, акриламидом, свидетельствуют о чрезвычайно низкой доступности хромофора растворителю во всех исследованных белках (рис. 3.12, б и табл. 3.5). Тем не менее, можно сделать вывод, что олигомеризация приводит к небольшому дополнительному уменьшению значений Ksv и к , что говорит о снижении доступности хромофора молекулам акриламида.
