Введение к работе
Актуальность исследования
С туберкулезом (ТБ) человечество знакомо очень давно Однако мы до оих пор очень мало знаем о механизмах, позволяющих микобактериям в обход защитных сил организма длительное время сосуществовать в виде латентной инфекции у одной трети мирового населения и поджидать подходящего случая для разития заболевания (Stewart et al, 2003, Tufanello et al, 2003) Несмотря на предпринимаемые мировым сообществом меры неуклонно продолжает возрастать распространение лекарственно-устойчивого ТБ В октябре 2006 г ВОЗ декларировала появление форм о широкой лекарственной устойчивостью, для лечения которых отсутствуют эффективные лекарственные средства Поэтому возрастает роль иммунопрофилактики и ранней диагностики заболевания В настоящее время для вакцинопрофилактики ТБ применяется живой апенуированный штамм Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerm (BCG), однако, индуцируемый им протективный эффект варьирует от 0 до 80 % (Aronson et al, 2004) Для скринингового выявления инфицированных ТБ лиц применяется кожный теот, основанный на использовании грубого экстракта фильтрата культур М tuberculosis — туберкулина, или PPD (purified protein derivative), для определения реакций клеточного иммунитета, вызываемых микобактериями Специфичность туберкулиновых тестов ограничена невозможностью дифференцировать заболевание от поствакцинального состояния либо от инфицирования невирулентными микобактериями Точный диагноз ТБ предусматривает обнаружение М tuberculosis в материале от пациента, но микроскопические исследования не позволяют выявлять абациллярных больных и больных нелегочными формами ТБ, а культуральные методы еще требуют длительного времени для постановки диагноза В настоящее время активно исследуется возможность использования новых высокоиммуногенных видоспецифичных антигенов в диагностике ТБ Однако и здесь остаются проблемы, как, например, повышение чувствительности таких диагностических тестов без снижения их специфичности
С развитием современных методов исследования генома мы приблизились к разгадке проблем вирулентности микобактерий и к возможности создания более эффективных препаратов для вакцинопрофилактики ТБ В 1996 г путем сравнения геномов патогенных микобактерий М bovis и М tuberculosis и микобактерий вакцинного штамма BCG были обнаружены области, кодирующие более 100 высокоиммуногенных белков, пригодных для диагностики и создания альтернативных вакцинных конструкций Наиболее интересная область генома RD1 (region of deletion) присутствует только в патогенных штаммах микобактерий и делетирована из генома вакцинного штаммаМ bovis BCG, а значит белки, кодируемые этой областью, могут оказаться ценными для дифференциальной диагностики Кроме того, эти белки могут стать вакцинными кандидатами, так как отвечают за вирулентность микобактерий и, возможно, будут индуцировать протективный иммунитет С их использованием открываются возможности для создания субъединичных и ДНК-вакцин, однако, до сих пор до практики не доведена ни одна альтернатива существующей вакцины BCG, которая бы превосходила ее по своим протективным свойствам Одним из возможных направлений совершенствования субъединичных и ДНК-вакцин является поиск более эффективных способов их доставки в организм Ранее было показано, что при введении в организм мышей полисахаридных частиц, в оболочке которых находятся суммарные антигены BCG, индуцируется клеточный иммунный ответ, а рибонуклеиновая кислота, находящаяся в их ядре, устойчива к действию рибонуклеаз Такие конструкции были названы искусственными микобактериальными частицами (МБЧ) Оставалось неясным, будет ли их введение животным приводить к формированию протективного иммунитета против М tuberculosis, возможно ли их использование для доставки в организм животных ДНК, обеспечивающих синтез т vivo микобактериальных антигенов, а также будет ли формироваться иммунный
ответ на эти антигены и каким он будет - преимущественно гуморальным или клеточным'
Цель настоящей работы заключалась в изучении возможности использования рекомбинантного белка ESAT-б для диагностики туберкулёза и изучении особенностей иммунного ответа у лабораторных животных, вызываемого ДНК-конструкцией, обеспечивающей синтез т vivo антигена esxA М tuberculosis, с применением полисахаридной системы доставки
Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:
-
Получить рекомбинантный штамм Е coli, опособный продуцировать микобактериальный антиген ESAT-б, и оценить диагностический потенциал рекомбинантного белка ESAT-б
-
Оценить возможность формирования протективного иммунного ответа к заражению М bovis морских свинок, иммунизированных искусственными микобактериальными частицами на основе полисахаридной системы доставки
-
Создать экспериментальный препарат на основе рекомбинантной ДНК, кодирующей антиген ESAT-б, и полисахаридной системы доставки
сконструировать рекомбинантную плазмиду, обеспечивающую синтез антигена ESAT-б в эукариотической системе,
получить конъюгат полиальдегиддекстран-спермидин,
получить экспериментальный препарат и проверить его стабильность
-
Исследовать иммуногенные свойства экспериментального препарата на мышиной модели
-
Оценить безопасность применения экспериментального препарата для живых организмов
Положения, выносимые на защиту.
-
Плазмидная конструкция, включающая ген esxA М tuberculosis, обеспечивает синтез рекомбинантного белка GST-ESAT-6 в клетках Е coh
-
Использование рекомбинантного белка GST-ESAT-6 в ИФА позволяет выявлять антитела, специфичные кМ tuberculosis
-
Использование рекомбинантного белка GST-ESAT-б в ELISA/ИФН-у анализе позволяет проводить дифференциальную диагностику активного туберкулеза и поствакцинального иммунитета
-
Искусственные микобактериальные частицы на основе полисахаридного конъюгата и экспонирующие на своей поверхности суммарные белки М bovis BCG обладают иммуногенностью и протективными свойствами на экспериментальной модели животных
-
Экспериментальный препарат на основе рекомбинантной ДНК, кодирующей антиген ESAT-б, и полисахаридной системы доставки обладает Т-клеточной иммуногенностью на мышиной модели и безопасен для животных
Научная новизна и практическая значимость работы:
Впервые получен рекомбинантный штамм Е coh, продуцировавший микобактериальный рекомбинантный белок GST-ESAT-6, который оказался пригоден для диагностики активного ТБ Важным результатом выполненной работы явилось определение чувствительности ИФА при выявлении антител класса IgG к антигену ESAT-6 М tuberculosis, которая составила 60 %, при специфичности - 95 %
В результате проделанной работы впервые был показан протективный иммунный ответ при заражении М bovis иммунизированных искусственными микобактериальными частицами морских свинок
Впервые сконструирована плазмида pONE6, содержащая ген esxA, экопрессирующая микобактериальный антиген ESAT-6, на основе которой создан экспериментальный препарат «КрОМЕб», окруженный полиоахаридной оболочкой из молекул модифицированного полиглюкина и опермидина, способной защищать нуклеотидный материал от деградации нуклеазами
Впервые показано, что иммунизация экспериментальным препаратом «KpONE6» лабораторных животных приводит к формированию специфического клеточного иммунного ответа, а сам препарат не обладает «острой» токсичностью И является безопасным для применения на животных
Полученные данные настоящей работы по иммуногенности экспериментального препарата могут лечь в основу дальнейшего исследования его протективных свойств на лабораторных животных
Апробация работы и публикации:
Полученные результаты исследований были доложены на международном симпозиуме «Интегративная Медицина в XXI веке» (Судак, Украина, 2004), международном Кейстоуновском симпозиуме «Интеграция хозяина и патология патогена» (Вистлер, Канада, 2005), VI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, Россия, 2005), интернациональном конгрессе «Новые подходы в вакцинных разработках» (Берлин, Германия, 2005), международной школе-конференции «Системная биология и биоинженерия» (Москва, Россия, 2005), международном междисциплинарном семинаре «Новые технологии в интегративной медицине и биологии» (Бангкок-Патайя, Таиланд, 2006), П интернациональной конференции «ТБ вакцины в мире» (Вена, Австрия, 2006), международной школе-конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» в рамках Международного Симпозиума «ЕС—Россия перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-ой Рамочной программе» (Санкт-Петербург, Россия, 2006), VI Всероссийской конференции молодых ученых в рамках 13 Международного конгресса по приполярной медицине (Новосибирск, Россия, 2006), III Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, Россия, 2006), XVI ежегодном конгрессе Европейского Респираторного Общества (Мюнхен, Германия, 2006), I летней международной школе по инфекционным заболеваниям «Кох-Мечниковский форум» (Берлин, Германия, 2006), 37-ом союзе международных конференций по патологии легких (Париж, Франция, 2006), 3-ей международной конференции по вакцинам «Перспективы вакцинных разработок медицинская необходимость и социальное значение» (Баден, Австрия, 2007), Российско-Германской конференции Форума Коха- Мечникова (Томск, Россия, 2007)
По материалам диссертации было опубликовано четыре статьи, 3 из них в журналах, рекомендованных ВАК для кандидатских диссертаций
Настоящая работа была выполнена в лаборатории разработки новых методов диагностики заболеваний человека ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» - эксперименты по клонированию, получению и исследованию рекомбинантных белков, получению экспериментальных препаратов для иммунизации животных и исследованию их иммуногенных и токсических свойств, на базе ГНУ Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН - эксперименты по заражению Mbovis иммунизированных морских свинок и оценке протективных свойств микобактериальных частиц
Выражаю глубокую благодарность за неоценимую помощь и поддержку в планировании и проведении экспериментов, обсуждении полученных результатов и подготовке диссертации Андрею Егоровичу Нестерову
Искренне признательна профессору Георгию Михайловичу Игнатьеву за ценные советы в подготовке экспериментов, терпение н помощь в осмыслении результатов
Благодарна всем сотрудникам лаборатории разработки новых методов диагностики заболеваний человека ФГУН ГЫЦ ВБ «Вектор»: А.Н. Болдыреву за возможность ежедневных обсуждений результатов экспериментов, кб.н. О.Ю. Смирновой за обучение методикам клонирования и человеческую поддержку, к.б.н. Агафонову А.П., кб.н. М Ш. Азаеву, к.х.н. Ю.В. Туманову и к.вет.н. А.Н,, Донченко за удачное совместное проведение экспериментов.
Особую благодарность выражаю своему научному руководите. к.х.н. Сергею Ивановичу Татькову за поддержку, участие в обсуждении результатов и предоставленную свободу действий для совместного выполнения части экспериментов с нашими коллегами ФГУН ПЩ ББ «Вектор».
Благодарю моих родителей, брата и моих друзей, оказывавших мне всестороннЕОЮ поддержку, как при проведении экспериментов, так и при написании диссертации.
Структура и объем работы Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы н методы», главы «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка литературы. Библиография вкгаочает 235 работ: 27 - отечественных авторов и 208 - зарубежных. Работа иллюстрирована і 8 рисунками и включает б таблиц.
