Введение к работе
Актуальность проблемы
Mycobacterium tuberculosis продолжает оставаться "успешным" патогеном и в XXI веке, так как, несмотря на достижения медицины, проблема туберкулеза остается актуальной для большинства стран. Высокую адаптивную способность вида Mycobacterium tuberculosis доказывает и очень быстрое его приспособление к новым условиям в эру применения антибактериальных препаратов - селекция и распространение лекарственноустойчивых штаммов. Наблюдающийся в последние годы подъем лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза, а также утяжеление ее структуры за счет роста множественной лекарственной устойчивости (Вишневский Б.И. и др., 1997; Вишневский Б.И., Вишневская Е.Б., 2003; Дорожкова И.Р.и др., 2000; Хоменко А.Г., Голышевская В.И., 1999; Goldman R.C., et al., 2007; Dye C., 2000; Su W.J., et al., 2008) значительно усложняет задачу лечения туберкулеза. Химиотерапия остается основным методом лечения больных туберкулезом, который обеспечивает прекращение бактериовыделения и прерывает распространение возбудителя. Широкое распространение в последние годы штаммов M.tuberculosis, принадлежащих к семейству Beijing, которое часто ассоциировано с высокой трансмиссивностью, множественной лекарственной устойчивостью и более тяжелыми и распространенными формами туберкулезного процесса (Кондакова М.Н., 2005; Нарвская О.В., 2003; Сапожникова Н.В., 2003; Drobniewski F. et al., 2005; Park Y.K. et al., 2005), еще более актуализирует задачу быстрого выявления наиболее эпидемиологически опасных M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью. В этих условиях возрастает роль бактериологических лабораторных методов определения резистентности M.tuberculosis и контроля адекватности химиотерапии.
Сегодня как никогда раньше, клиницисты заинтересованы в получении результатов определения лекарственной устойчивости в кратчайшие сроки. Учет результатов определения резистентности M.tuberculosis к противотуберкулезным препаратам стандартным методом абсолютных концентраций на плотной яичной среде Левенштейна-Йенсена производится на 21 сутки после посева культуры. На жидких средах микобактерии растут быстрее, но есть проблема визуализации их роста. В настоящее время для быстрого определения лекарственной устойчивости разработаны и используются системы бульонного культивирования, основанные на радиометрической, манометрической, колориметрической или флуоресцентной индикации роста M.tuberculosis в жидких средах – BACTEC 460, MB-BACT, BBL-MGIT, BACTEC MGIT 960, Versa Trek System (Иртуганова О.А. и др., 2000, 2001, а, б.; Palomino J.C. et al., 1999; Siddiqi S.H. et al., 1981; Zwolska Z. et al., 1999). С помощью этих систем спектр устойчивости может быть определен на 3-16 сутки прямым или непрямым методом. Молекулярно-генетические методы позволяют определить устойчивость к рифампицину, изониазиду, стрептомицину, этамбутолу, пиразинамиду по наличию мутаций в ДНК микобактерий, по сути, в день поступления патологического материала. Но перечисленные выше методы требуют дорогостоящего аппаратурного оснащения и значительного финансирования и потому доступны лишь большим централизованным референс-лабораториям. Кроме того, наличие мутаций в генах не всегда проявляется фенотипически и на сегодняшний день выявлены не все мутации (Грядунов Д.А. и др., 2001; Литвинов В.И., 2001; Скрягина Е.М. и др., 2001; Bergval I.L. et al., 2007; Cardoso R.F. et al., 2007; Sekiguchi J. et al., 2007). Существующие фенотипические микрометоды определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis на основе жидких сред небезопасны, требуют дополнительного оснащения реактивами, расходными материалами, оборудованием (Caviedes L. et al., 2002; Collins L.A., Franzblau S.G., 1997; Banfi E. et al., 2003). В связи с этим чрезвычайно актуальной проблемой является разработка дешевых, безопасных, простых и доступных для лабораторий любого уровня методов ускоренного определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis и бактериостатической активности крови (БАК), или туберкулостатической пробы, так как это позволит клиницистам в короткие сроки выработать оптимальную тактику химиотерапии туберкулеза в зависимости от свойств возбудителя.
Широкое распространении штаммов генотипа Beijing, для которых характерна высокая частота поли- и мультирезистнтности (Нарвская О.В., 2003; Drobniewski F. et al., 2005; Park Y.K. et al., 2005), поднимает вопрос о соотношении лекарственной устойчивости и вирулентности M. tuberculosis тем более, что эта проблема до сих пор остается дискуссионной. Сложность изучения факторов вирулентности M.tuberculosis, обусловлена, в частности, тем, что экспрессия генов, кодирующих эти факторы, происходит только в адекватных условиях внутренней среды макроорганизма-хозяина, а рост бактерий на искусственных питательных средах в отсутствие атак иммунной системы не требует реализации действия этих генов (Сидоренко С.В., 1999; Caviedes L. et al., 2002; Srivastava V. et al., 2007). Кроме того, изучение факторов вирулентности в основном проводится при сравнении вирулентных и авирулентных (лабораторных или мутантных, полученных с помощью делеции генов) штаммов, сильно отличающихся друг от друга по степени патогенности. Все клинические изоляты безусловно вирулентны, коль скоро вызвали болезнь, однако, различия между штаммами, принадлежащими к генетическим кластерам разных объемов, могут быть менее отчетливы. В связи с этим актуальной является проблема адекватной оценки вирулентности M.tuberculosis разных генотипов. Существующие методы исследования вирулентности M.tuberculosis на различных моделях с использованием животных или молекулярно-генетических методов и их комбинаций очень дороги, длительны, доступны очень немногим лабораториям, оснащенным высокотехнологичным оборудованием, и не позволяют провести исследование достаточно большого числа штаммов различных генотипов с целью их сравнительной оценки. Использование тканевой культуры макрофагоподобных клеток человека в качестве модели для изучения одного из свойств вирулентности M.tuberculosis – способности вызывать некроз макрофагов (цитотоксичности), помогает решить проблему в трех планах. Во-первых, исследовать достаточно большое число клинических штаммов, во-вторых, уменьшить влияние видовой и индивидуальной генетической гетерогенности, которое весьма существенно влияет на оценку вирулентности при использовании животных и макрофагов ex vivo, и, в-третьих, количественно оценить, образно говоря в "чистом виде", вирулентность клинических штаммов M.tuberculosis различных генотипов и ее связь (или ее отсутствие) с лекарственной устойчивостью. Оценить пригодность такого метода для поставленной цели представляется возможным при сравнительном исследовании вирулентности M.tuberculosis генотипов Beijing и иных генотипов.
Цель работы: обосновать применение ускоренных методов определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis и бактериостатической активности крови для лабораторного контроля адекватности терапии, изучить вирулентность (цитотоксичность) M.tuberculosis в зависимости от генотипа и лекарственной устойчивости возбудителя.
Задачи исследования:
-
Исследовать возможность определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis посредством биохимической индикации метаболической активности микобактерий.
-
Разработать питательную среду для ускоренного определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis. Провести сравнительное исследование лекарственной устойчивости клинических штаммов M.tuberculosis с помощью ускоренного и стандартного методов.
-
Исследовать бактериостатическую активность крови больных туберкулезом органов дыхания с помощью стандартных методов, используя выделенные аутоштаммы M.tuberculosis, сопоставить полученные результаты с устойчивостью M.tuberculosis к противотуберкулезным препаратам и течением туберкулезного процесса. Дать оценку туберкулостатической пробе как методу бактериологического контроля адекватности химиотерапии.
-
Разработать ускоренный метод определения бактериостатической активности крови с помощью полужидкой питательной среды. Исследовать бактериостатическую активность крови больных туберкулезом органов дыхания с помощью ускоренного метода, сопоставить полученные результаты с клиническими и бактериологическими данными.
-
Исследовать вирулентность клинических штаммов M.tuberculosis по их способности активировать гибель макрофагов (цитотоксические свойства), сопоставить уровень вирулентности с генотипом и устойчивостью возбудителя.
Научная новизна
Впервые разработана полужидкая питательная среда, позволяющая получить визуально наблюдаемый рост культуры M.tuberculosis на 3-5 сутки после инокуляции суспензии. Разработанный ускоренный метод определения лекарственной устойчивости M.tuberculosis к изониазиду, стрептомицину, рифампицину дает возможность иметь данные об устойчивости культуры к этим препаратам на 3-5-е сутки, о чувствительности – на 7-е после посева суспензии штамма M.tuberculosis. Предложенный метод позволяет на 2 недели раньше в сравнении со стандартным методом на плотной яичной среде Левенштейна-Йенсена изменить терапию, что особенно важно в связи со значительным увеличением множественной лекарственной устойчивости.
Впервые методом вертикальной диффузии показана четкая зависимость величины бактериостатической активности крови от устойчивости клинического изолята к изониазиду. С помощью разработанного ускоренного метода сопоставлены результаты определения туберкулостатической пробы как лабораторного метода контроля адекватности терапии и течения процесса у больных туберкулезом органов дыхания, и выявлена корреляция степени бактериостатической активности крови и эффективности химиотерапии.
Впервые на модели in vitro при инфицировании дифференцированных клеток линии ТНР-1 микобактериями туберкулеза разных генотипов показано: наибольшая вирулентность (цитотоксичность) характерна для M.tuberculosis генотипа Beijing варианта В0; штаммы сборной группы других генотипов, обладали меньшей способностью активировать некроз макрофагов; M.tuberculosis семейства LAM обладали полярными по отношению к Beijing свойствами, вызывая некроз макрофагов в наименьшей степени; высокие цитотоксические свойства обнаружены у M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью.
Положения, выносимые на защиту
-
Полужидкая питательная среда, разработанная на основе среды Сотона, позволяет получить визуально наблюдаемый рост клинических штаммов и выявить M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью в течение 3-7 суток.
-
С помощью метода вертикальной диффузии на среде Левенштейна-Йенсена показана корреляция величины бактериостатической активности крови больных туберкулезом и чувствительности M.tuberculosis к изониазиду. Применение плотных сред для определения бактериостатической активности крови некорректно в случае устойчивости M.tuberculosis к препарату, однако метод информативен при исследовании фармакокинетики изониазида при разных путях его введения: показано увеличение концентрации препарата в крови и тканях и пролонгация эффекта при эндолимфатическом введении в сравнении с внутримышечным.
-
Величина бактериостатической активности крови, определяемой с помощью полужидкой среды, коррелирует с устойчивостью клинических штаммов к противотуберкулезным препаратам, тяжестью течения, эффективностью лечения специфического процесса: наиболее тяжелые формы заболевания отмечаются при низких и нулевых значениях бактериостатической активности и множественной лекарственной устойчивости M.tuberculosis. Определение бактериостатической активности с использованием аутоштаммов и полужидкой питательной среды позволяют в течение недели получить объективные сведения об адекватности применяемой химиотерапии.
-
Клинические штаммы M.tuberculosis генотипа Beijing B0 проявляют наибольшую способность активировать гибель макрофагоподобных клеток линии ТНР-1, индуцировать выработку противовоспалительного цитокина TGF- и уменьшать - провоспалительного цитокина TNF-. M.tuberculosis генотипа LAM обладают полярными относительно Beijing свойствами. Высокая частота множественной лекарственной устойчивости наблюдается у штаммов как с выраженной цитотоксичностью, так и с низкой.
Научно-практическая значимость работы
Разработанный на основе использования полужидкой среды ускоренный метод определения устойчивости M.tuberculosis к изониазиду, стрептомицину, рифампицину, прост, дешев, безопасен и потому доступен любой практической фтизиобактериологической лаборатории.
Метод ускоренного определения бактериостатической активности крови также может использоваться любой лабораторией и является надежным способом лабораторной оценки адекватности химиотерапии. Применение ускоренных методов определения лекарственной устойчивости и бактериостатической активности крови дает возможность сократить сроки получения необходимых данных в 2-3 раза в сравнении со стандартными методами на плотных средах.
Вирулентность M.tuberculosis различных генотипов можно оценивать по их способности активировать гибель макрофагоподобных клеток линии ТНР-1.
Реализация результатов работы
Получен патент на изобретение "Питательная среда для ускоренного определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза" № 2226398 от 10.04.2004 .
Результаты исследования внедрены в практику работы Курского областного противотуберкулезного диспансера, используются в клинике легочного туберкулеза ФГУ "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи", а также в учебном процессе на кафедре фтизиатрии ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Росздрава».
Апробация диссертационной работы
Материалы по теме диссертации доложены и обсуждены на: Всероссийской конференции по внелегочному туберкулезу (Санкт-Петербург,1997); заседаниях общества микробиологов г.Санкт-Петербурга (2000, 2002); VIII Российском съезде фтизиатров (Москва, 2007); 17-ой Международной конференции "СПИД, рак и общественной здоровье" (Санкт-Петербург, 26.05-29.05.2008); Межрегиональном семинаре для заведующих бактериологическими лабораториями Северо-Западного Федерального Округа РФ (Санкт-Петербург, 29.09-01.10.2008), Всероссийской научно-практической конференции "Актуальные вопросы лечения туберкулеза различных локализаций" (Санкт-Петербург, 29.09-31.09.2008).
Публикации
По материалам работы опубликовано 26 печатных работ, из них 9 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 178 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 72 отечественных и 202 зарубежных источника. Диссертация иллюстрирована 25 таблицами и 14 рисунками.
