Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 24
2.1. Геном М. tuberculosis - возбудителя туберкулеза в сравнении с геномами близкородственных микобактерий 24
2.2. Молекулярное генотипирование М. tuberculosis 29
2.3. Лекарственно-резистентные штаммы М. tuberculosis, их эпидемическая значимость 35
2.4. Молекулярные механизмы резистентности М. tuberculosis к лекарственным препаратам 45
2.5. Методы молекулярной диагностики лекарственной резистентности М. tuberculosis 55
2.6. Молекулярно-генетические особенности современных клинических штаммов М. tuberculosis 61
3. Материалы и методы 66
3.1. Бактериальные штаммы 66
3.2. Питательные среды 66
3.3. Определение лекарственной чувствительности микобактерий in vitro 66
3.4. Определение молекулярных механизмов лекарственной резистентности М. tuberculosis 66
3.5. Генотипирование клинических штаммов М. tuberculosis 68
3.5.1. Видовая идентификация клинических штаммов микобактерий 68
3.5.2. Выделение хромосомной ДНК 68
3.5.3. RFLP-\S6110 69
3.5.4. Сполиготипирование 69
3.5.5. RFLP-PGRS 70
3.5.6. VNTR 70
3.5.7. Программное обеспечение 71
3.6. Определение вирулентности клинических штаммов М. tuberculosis 71
3.6.1. Заражение макрофагов 71
3.6.2. Заражение животных 72
3.7 Определение делетированных последовательностей в геномах штаммов микобактерий 72
3.8. Деплиторная аллель-специфичная ПЦР 72
4. Результаты исследований 75
4.1. Клинические штаммы М. tuberculosis: изучение молекулярных механизмов резистентности крифампицину и изониазиду 75
4.2. Разработка молекулярных методов экспресс-идентификации лекарственной резистентности к рифампицину и изониазиду клинических штаммов М. tuberculosis 79
4.3. Изучение вирулентности клинических штаммов М. tuberculosis 86
4.4. Сравнение геномов микобактерий с использованием метода гибридизации на ДНК-чипах: выявление различий, важных для функционирования микобакте-риальной клетки и дифференциации клинических штаммов микоба 91
4.5. Характеристика лекарственно-резистентных штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных-заключенных, находящихся в СИЗО города Серпухов 94
4.6. MDR туберкулез у заключенных в Тульской области 110
4.7. Характеристика клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных в городе Тула и Тульской области 123
4.8. Характеристика клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в Нижегородской области 129
4.9. Характеристика клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в городе Калуга 134
4.10. Коллекция клинических штаммов М. tuberculosis (ГНЦ ПМ, Оболенск) 136
4.11. Характеристика клинических штаммов М. tuberculosis AI/LAM семейства 142
4.12. Сравнение разрешающей способности разных методов
генотипирования 146
5. Обсуждение результатов 159
5.1. Эпидемическая значимость лекарственно-резистентных клинических штаммов М. tuberculosis 159
5.2. Молекулярные механизмы резистентности клинических штаммов М. tuberculosis к изониазиду, рифампицину и пиразинамиду 161
5.3. Разработка молекулярных методов экспресс-идентификации лекарственной резистентности к рифампицину и изониазиду клинических штаммов М.tuberculosis 162
5.4. Вирулентность клинических лекарственно-резистентных штаммов М. tuberculosis 166
5.5. Сравнение геномов микобактерий с использованием метода гибридизации на ДНК-чипах: выявление различий, важных для функционирования микобактери-альной клетки и дифференциации клинических штаммов микобакте-рий 168
5.6. Характеристика лекарственно-резистентных штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных, находящихся в СИЗО города Серпухов 174
5.7. Характеристика клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в городе Тула и Тульской области 177
5.8. Сравнительный анализ генотипов штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в городах Серпухов, Тула, Калуга, в Тульской и Нижегородской областях 180
5.9. Характеристика клинических штаммов М. tuberculosis AI/LAM
семейства 181
6. Выводы 185
7. Список литературы 185
- Геном М. tuberculosis - возбудителя туберкулеза в сравнении с геномами близкородственных микобактерий
- Определение молекулярных механизмов лекарственной резистентности М. tuberculosis
- Клинические штаммы М. tuberculosis: изучение молекулярных механизмов резистентности крифампицину и изониазиду
- Разработка молекулярных методов экспресс-идентификации лекарственной резистентности к рифампицину и изониазиду клинических штаммов М.tuberculosis
Введение к работе
Актуальность темы. Согласно данным официальной медицинской статистики, эпидемическая обстановка по туберкулезу резко ухудшилась в последние годы во всем мире [49, 73, 74, 96, 149, 172, 177]. В настоящее время от туберкулеза умирает людей больше, чем от всех других инфекционных заболеваний [19].
Заболеваемость туберкулезом увеличилась и в России, достигнув в среднем по стране в 2002 году 86,1 на 100 тысяч населения (82,8 - туберкулезом органов дыхания) [Государственный доклад «О состоянии здоровья населения Российской Федерации в 2002 году»].
Ежегодно в России выявляется более 120 000 вновь заболевших туберкулезом (123 340 в 2002 году), среди них около 4 000 детей (15,9 на 100 000 населения). Среди всех новых случаев туберкулеза в мире (по данным ВОЗ) 0,6 - 0,8% приходится на Россию.
Всего по данным 2002 года в нашей стране зарегистрировано 388 627 больных туберкулезом (271,1 на 100 тысяч населения), среди них- 359 110 туберкулезом органов дыхания (250,5 на 100 тысяч населения) и 9 730 детей (40,4 на 100 тысяч населения).
Примерно треть от общего числа больных (126 000 человек) является бакте-риовыделителями, то есть огромным резервуаром непосредственных распространителей инфекции.
Смертность от туберкулеза в 2002 году достигла в России 21,5 на 100 тысяч населения. По сравнению с 1990 годом этот показатель увеличился в 2,8 раза. Число умерших от туберкулеза в России составляет 1% от всех смертельных случаев от туберкулеза на всей нашей планете. Существующая стратегия борьбы с туберкулезом теряет эффективность, что, возможно, связано с изменением свойств возбудителя туберкулеза - Mycobacterium tuberculosis.
Вопросом первостепенной важности в борьбе с туберкулезом становится широкое распространение лекарственно-резистентных штаммов М. tuberculosis и, как следствие, снижение эффективности химиотерапии, являющейся основным мероприятием в лечении инфекции. В мире уже зарегистрировано несколько вспышек туберкулеза, вызванных полирезистентными штаммами М. tuberculosis. Особую угрозу для больных представляют мультирезистентные штаммы - штаммы, резистентные одновременно к изониазиду и рифампицину, так как известно, что заболевания, вызванные мультирезистентными штаммами М. tuberculosis, имеют остро прогрессирующий характер и плохо поддаются лечению [23]. Исследование мутационных процессов, приводящих к развитию лекарственной резистентности клинических штаммов М. tuberculosis, создаст реальные предпосылки для разработки методов экспресс-диагностики лекарственной резистентности.
Генетическая вариабельность различных штаммов М. tuberculosis является причиной измененных патогенных свойств возбудителя, что существенно затрудняет лечение заболевания. Наиболее информативным методом полного генетического сравнения микобактерий является понуклеотидное сравнение их геномных последовательностей. Данные по первичной структуре хромосом различных видов микобактерий Mycobacterium leprae [75]; Mycobacterium bovis [88] и трех штаммов М. tuberculosis (H37Rv, CDC1551 и 210) свидетельствуют о высоком уровне межвидового разнообразия, вызванного инсерционно-делеционными перестройками [183]. Среди штаммов М. t uberculosis при геномном сравнении также выявлен высокий уровень полиморфизма, включающий как полиморфизм длинных последовательностей (больше 10 нуклеотидов) так и однонуклеотидный полиморфизм [83]. Так как опре 10 деление первичной структуры хромосом большого числа клинических штаммов ми кобактерий туберкулеза невозможно в связи с большой трудоемкостью, то реальной альтернативой становятся методы сравнения геномов вновь выделенных штаммов с уже описанными геномами методами вычитающей гибридизации (выявление инсер-ций) и гибридизации на ДНК-чипах (анализ делеций). Определение геномных различий среди микобактериальных штаммов также может быть использовано для разработки новых методов выявления суб-популяций циркулирующих штаммов и для выявления ключевых генетических районов и соответствующих функциональных различий, щих функциональных различий.
Цель исследования
Изучить с применением микробиологических, биохимических и молекулярно-биологических методов циркулирующие в центральных регионах России штаммы М. tuberculosis, выявить их генетические особенности, установить их чувствительность к антимикробным препаратам, а также мутации, определяющие резистентность к лекарственным средствам и разработать на этой основе новый метод экспресс-идентификации мультирезистентных клинических штаммов М. tuberculosis для оптимизации мониторинга и химиотерапии туберкулеза.
Задачи исследования
1. Создать и систематизировать коллекцию клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных в Центральном и Приволжском федеральных округах России (г. Тула и Тульская обл., г. Серпухов Московской обл., г. Калуга, Нижегородская обл.). 2. Определить лекарственную резистентность клинических штаммов М. tuberculosis in vitro; оценить вирулентность лекарственно-резистентных штаммов М. tuberculosis в опытах на модели животных (на мышах).
3. Изучить молекулярные механизмы, детерминирующие резистентность клинических штаммов М. tuberculosis к изониазиду, рифампицину и пиразинамиду. Создать на основе полученных данных диагностическую ПЦР тест-систему, обеспечивающую экспресс-идентификацию резистентности клинических штаммов М. tuberculosis к изониазиду и рифампицину.
4. Осуществить внутривидовую идентификацию штаммов возбудителя туберкулеза методами RFLP-\S6110, RFLP-PGRS, VNTR и сполиготипирования.
5. Провести сравнение геномов современных штаммов М. tuberculosis, выделенных на территории РФ, с уже описанным геномом штамма H37Rv методом гибридизации на ДНК-чипах для анализа делеций.
6. Создать компьютерный каталог данных клинических штаммов М. tuberculosis.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Штаммы М. tuberculosis, выделенные в центральном регионе РФ, преимущественно относятся к геногруппам W/Beijing - 40,7 %, AI/LAM - 40% и Haarlem - 8,9 %. Частота встречаемости микобактерий туберкулеза, относящихся к разным геногруппам, варьирует от территории к территории. Штаммы, принадлежащие к семействам W/Beijing и AI/LAM, обладают широким спектром лекарственной резистентности.
2. Геномы штаммов, относящихся к различным семействам, отличаются не только расположением и количеством повторяющихся и инсерционных элементов, но и наличием или отсутствием определенных открытых рамок считывания. Выявлен 12 ные различия в кодирующих последовательностях геномов микобактерий отражают современную эволюцию возбудителя туберкулеза.
3. Для семейств W/Beijing и AI/LAM характерны определенные сочетания мутаций, детерминирующих резистентность к рифампицину и изониазиду. Штаммы семейства W/Beijing в 73% случаев несут мутацию в 531 кодоне гроВ и в 100% случаев имеют одновременно две мутации в гене katG в 315 и 463 положениях. В AI/LAM семействе ведущее положение занимает мутация в 516 кодоне гроВ (72 %) и выявляется только одна мутация в 315 положении гена katG (99%).
4. Метод деплиторной аллель-специфичной ПЦР позволяет одновременно с определением мультирезистентности идентифицировать культуру М. tuberculosis и может быть использован для обнаружения лекарственно-резистентных бактерий в смешанной популяции, в которой присутствуют и чувствительные к лекарственным средствам микобактерий.
Научная новизна
• Впервые выявлены и подтверждены различия в кодирующих последовательностях геномов современных штаммов М. tuberculosis, выделенных на территории РФ. В штаммах семейства Beijing отсутствует 0,7% генома H37Rv или 40 открытых рамок считывания (ORF), тогда как в штамме 1540 семейства Haarlem отсутствует 0,26% генома или 20 ORF. Установлено, что вирулентный штамм М. tuberculosis в сравнении с менее вирулентными штаммами несет в хромосоме дополнительный структурный ген фосфолипазы С. Выявлена ранее неизвестная делеция DS1540 с геномными координатами 357305 - 358264.
• Показано, что среди больных туберкулезом Центрального и Приволжского федеральных округов России наряду со штаммами W/Beijing семейства широко распространены штаммы AI/LAM семейства. Штаммы AI/LAM семейства обладают широким спектром лекарственной резистентности, в частности к препаратам первой линии.
• Охарактеризовано генетическое семейство штаммов М. tuberculosis А1. Определены размеры и количество фрагментов рестрикции при 136770-типировании. Показана принадлежность штаммов семейства AI к LAM сполиготипу. Определен VNTR шифр AI семейства - 22222.
• Определена сравнительная частота хромосомных мутаций, детерминирующих резистентность к изониазиду и рифампицину клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных в Центральном и Приволжском федеральных округах России. Впервые выявлены новые мутации в гене rpoB - 479TTG, 515-517 AATGGACCAG, 516ТТС, 524ТСС, 525ACG, 535СТС, 565AGT, 566AGGG, 580CAG, в гене katG - 335GTC, в гене рпсА - 22АСТ, 63GAA, 63GCC, 96AGG, 108GTA, 132 CGT, 164CCG, 17AGG, 78AG, делеция с 87 по 148 кодоны, вставка 131GGTC.
Теоретическая значимость
Основные теоретические итоги проделанной работы заключаются в определении структурных особенностей геномов современных клинических штаммов М. tuberculosis, циркулирующих на территории Российской Федерации. Геномы штаммов, относящихся к различным семействам, отличаются не только расположением и количеством повторяющихся и инсерционных элементов, но и наличием или отсутствием определенных открытых рамок считывания. Показана редукционная эволюция геномов микобактериальных штаммов семейства Beijing. Выявлена частота встречаемости штаммов различных геногрупп М. tuberculosis. Определены мутации в генах штаммов М. tuberculosis, ответственные за резистентность к основным противо 14 туберкулезным лекарственным средствам, в том числе и новые, что является основой для разработки молекулярно-биологических методов экспресс-диагностики лекарственной устойчивости.
Практическая значимость работы
Компьютерный каталог, содержащий микробиологическую, биохимическую и молекулярно-биологическую характеристики клинических штаммов М. tuberculosis, циркулирующих в настоящее время среди больных туберкулезом в Центральном и Приволжском федеральных округах России, будет представлен на сайте в Internet и станет доступен широкому кругу специалистов-фтизиатров, занимающихся как исследовательской, так и практической деятельностью. Содержащиеся в каталоге данные позволят быстро и точно отслеживать пути циркуляции штаммов возбудителя туберкулеза в эпидемических очагах. Полученные данные могут быть использованы при выборе противотуберкулезных лекарственных средств на ранних стадиях лечения пациентов.
Разработанная на основе деплиторной аллель-специфичной ПЦР диагностическая система, обеспечивающая экспресс-идентификацию лекарственной резистентности клинических штаммов М. tuberculosis к изониазиду и рифампицину одновременно с видовой идентификацией возбудителя заболевания, позволит сократить время определения лекарственной резистентности к указанным препаратам от трех-четырех недель до одного рабочего дня. Метод прост в исполнении и экономически выгоден. Методические рекомендации «Молекулярно-генетическая экспресс-идентификация лекарственной резистентности клинических штаммов М. tuberculosis к рифампицину и изониазиду», утвержденные 17 декабря 2004 директором института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН академиком Ивановым ВТ. и заместителем директора ГНЦ прикладной микробиологии профессором Волковым В.Я. прилагаются.
Методические приемы, разработанные в ходе работы над диссертацией, охарактеризованные штаммы М. tuberculosis и хромосомная ДНК микобактерий различных геногрупп применяются в микробиологических и молекулярно-биологических исследованиях ряда лабораторий ГНЦПМ (Оболенск), ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Москва), московского научно-практического центра по борьбе с туберкулезом и центрального института туберкулеза (Москва).
Геном М. tuberculosis - возбудителя туберкулеза в сравнении с геномами близкородственных микобактерий
История накопления знаний о М. tuberculosis восходит к 1882 году, когда Роберт Кох впервые изолировал микобактерию туберкулеза и продемонстрировал в опытах на морских свинках, что эта медленно растущая бактерия является возбудителем заболевания у человека. Вместе с другими близкородственными бактериями М. tuberculosis формирует комплекс, состоящий из нескольких видов (М. africanum, М. bovis, М. bovis BCG, М. canetti, М. microti и М. tuberculosis), характеризующийся почти полной гомологией большинства генов [113]. Все представители этого туберкулезного комплекса являются патогенными бактериями для человека и/или животных, за исключением вакцинного варианта М. bovis BCG, который был получен Кальметтом и Гереном в первой половине прошлого века путем проведения 230 пассажей М. bovis на картофельно-глицериновой среде. Как оказалось, аттенуация М. bovis BCG связана с последовательной потерей части генетического материала, что сделало невозможной реверсию микроба к исходному вирулентному состоянию [53].
Первым штаммом М. tuberculosis, первичная структура хромосомы которого была полностью определена, стал референсный штамм H37Rv, выделенный в 1905 году. Полная последовательность его генома состоит из 4 411 532 пар оснований и характеризуется необычно высоким содержанием G+C пар (65,6%) [54]. Полный геном штамма H37Rv содержит около 4 000 генов, что составляет примерно 91% его объема. Гены штамма H37Rv можно отнести к 11 большим функциональным группам. На сегодняшний день для 52% генов известна точная или предполагаемая функция. Для 48% генов функция является гипотетической, либо вообще не определена [47]. Более 51% генов возникли благодаря дупликации и процессу перемещения доменов. Инсерционные элементы (186770 и др.) и профаги (phiRvl, phiRv2) составляют 3,4% генома. В составе хромосомы H37Rv обнаружено 56 копий IS-элементов, принадлежащих как к хорошо известным семействам инсерционных последовательностей: IS3, IS5, IS27, IS30, IS710, \S256, \SL3, так и к новому семейству - IS7535. Наиболее часто встречающийся инсерционный элемент IS6770 принадлежит к семейству IS3 и играет значительную роль в пластичности генома благодаря возможности гомологичной рекомбинации между ближайшими копиями данного элемента [78]. Для микобактерий туберкулеза характерен низкий уровень однонук-леотидного полиморфизма (одна замена на фрагмент из 2 000-4 000 нуклеотидов) [185]. В большинстве случаев замены являются молчащими, но иногда, например точечные замены в гене рпсА, могут приводить к появлению устойчивости к пирази-намиду.
Примерно 9% генома кодирует белки, участвующие в метаболизме липидов, что свидетельствует о важном значении этих соединений в жизненном цикле М. tuberculosis [56]. Необычным для бактерий оказалось наличие в геноме H37Rv около сотни генов, ответственных за утилизацию экзогенных липидов. До 8% кодирующей емкости генома занято генами РЕ (выявлено 100 таких генов) и РРЕ (67 генов). Название кодируемых ими белков происходит от консервативного N-концевого фрагмента в положении 8-9 для РЕ семейства по однобуквенному международному обозначению пролина-глутамина и в положении 8-10 аминокислотных остатков проли-на-пролина-глутамина (РРЕ). РЕ и РРЕ белки можно разделить далее по свойствам их С-концевых доменов.
Генетической основой разнообразия М. tuberculosis является инсерцион-но/делеционный механизм. Большинство вставок генетической информации происходит благодаря процессам транспозиции, в основном при участии IS6770 и значительно реже при дупликации генов. Прямых доказательств горизонтального переноса генов у М. tuberculosis пока не найдено. О возможности таких событий можно предполагать, исходя из различного внутрихромосомного расположения профаговых геномов hiRvl и phiRv2 [42]. При сравнении геномов двух штаммов микобактерий -H37Rv и CDC1551 (выделенного в девяностых годах в Кентукки от больного туберкулезом) было установлено наличие в штамме H37Rv37 вставок по отношению к CDC1551 и 45 вставок в штамме CDC1551 по отношению к H37Rv. Почти половина вставок в обоих штаммах обнаружена в генах, кодирующих белки семейств РРЕ и PE_PGRS [83]. Указанные штаммы существенно отличались по количеству копий \S6110. Шестнадцать копий обнаружено в геноме штамма H37Rv и только четыре копии - в геноме CDC1551. Также обнаружено 1 075 случаев однонуклеотидного полиморфизма. Интересно отметить, что при анализе однонуклеотидных замен в 877 семействах генов выявлен ряд семейств, в которых частота встречаемости замен значительно превышала этот показатель для генома в целом. К таким семействам принадлежат РЕ/РРЕ гены, которые кодируют кислые глицин-богатые белки, локализованные на внешней поверхности и считающиеся потенциальными антигенами для иммунной системы хозяина. Таким образом, антигенная вариабельность может представлять собой результат повышенной частоты замен в этом семействе генов.
Обнаружена только одна существенная перестройка в геномах обоих штаммов - профаг phiRvl, расположенный в хромосоме H37Rv в положении 1 779 312 -1 788 503, в CDC1551 находится в положении 3 870 803- 3 879 990.
При анализе результатов дифференциальной гибридизации между хромосомами штаммов М. tuberculosis H37Rv и M.bovis BCG выявлены 14 участков (RD1-RD14) размером от 2 до 12,7 тысяч пар оснований, которые отсутствуют в вакцинном штамме [43]. Кроме того, определены пять участков, делетированных в хромосоме H37Rv в сравнении с другими членами бактерий туберкулезного комплекса (RvD1-5) и выявлена одна делеция (TbD1), специфичная только для представителей М. tuberculosis [53].
Делеции в геноме М. tuberculosis можно разделить на 2 группы - античные и современные. Античные делеции возникали на этапе становления вида и являются широко распространенными. Примером такой делеции является TbD1 (Табл. 1). Современные же делеции значительно менее распространены. При изучении делеции среди 19 охарактеризованных современных клинических штаммов М. tuberculosis с помощью микрочипов, созданных на основе последовательности хромосомы штамма H37Rv, было установлено, что средний размер делеции по отношению к геному штамма H37Rv составляет около 13 000 п.о., или 0,3% или 17,2 открытых рамок считывания [116]. В этом же исследовании были установлены все 25 делетиро-ванных последовательностей, которые в общей сумме составляют 76 839 п.о. или 1,7% генома.
Геном штамма AF2122/97 М. bovis состоит из 4 345 492 пар оснований и на 99,5% гомологичен геному М. tuberculosis H37Rv. Делеции привели к уменьшению размера хромосомы штамма AF2122/97 М. bovis на 66 040 п.о. в сравнение с H37Rv [87]. На основании сравнительной геномики можно утверждать, что изменения в компонентах клеточной стенки и в экспрессии генов явились основной движущей силой в эволюции М. bovis.
Определение молекулярных механизмов лекарственной резистентности М. tuberculosis
Результаты многочисленных исследований, посвященных резистентности М. tuberculosis к лекарственным препаратам, свидетельствуют о том, что лежащие в ее основе молекулярные механизмы принципиально не отличаются от уже известных для большинства других бактерий. В арсенале возможностей М. tuberculosis противостоять ингибирующему действию антимикробных препаратов имеется четыре основных группы механизмов. 1) Барьеры, связанные с проницаемостью клеточной стенки. Бактерии туберкулезного комплекса, как известно, имеют специфическую клеточную стенку, для которой характерна низкая проницаемость для различных молекул, включая антибиотики и химиопрепараты [143, 193]. 2) Продукция ферментов, способных инактивировать или деградировать лекарственные вещества, например, р-лактамаз [121]. 3) Системы активного выброса ксенобиотиков, локализованных в цитоплазматической мембране, могут отвечать за невысокий уровень резистентности к аминогликозидам и тетрациклину, а также ряду других антибиотиков [29, 177, 179]. 4) Модификация блока лекарство-мишень путем мутирования генов, ответственных за фукционирование механизмов или продуктов, непосредственно участвующих во взаимодействии с противотуберкулезными препаратами [193].
Первые три из перечисленных механизмов позволяют объяснить причины природной резистентности М. tuberculosis только к некоторым антибиотикам и хими-опрепаратам, часто при их низкой концентрации. Четвертый механизм - основной путь формирования клетками М. tuberculosis резистентности к используемым при терапии туберкулеза лекарственным средствам.
Развитие резистентности у М. tuberculosis к ряду противотуберкулезных препаратов напоминает процесс обучения, так как уровень устойчивости бактериальной культуры находится в зависимости от концентрации используемого для лечения препарата. При повышении последней возрастает и уровень резистентности бактериальной культуры. Сходная картина наблюдается при монотерапии инфекции с последовательной сменой препаратов при неэффективном лечении. В результате можно отобрать штамм микроба, у которого последовательно развилась резистентность к нескольким препаратам. Это объясняет возникновение ЛР штаммов в клинической практике. Скорость развития резистентности коррелирует с частотой возникновения в бактериальной хромосоме мутаций, обусловливающих резистентность к тому или иному лекарственному средству. В конечном же итоге появление лекар-ственнрезистентных штаммов М. tuberculosis определяется эффективностью селекции мутантов бактерий, обладающих тем или иным уровнем устойчивости к тому или иному антимикробному препарату. Частота появления мутантов лекарственной резистентности различна и колеблется от 1СГ6 для рифампицина и изониазида, 10"8 для стрептомицина, до 10"9 для препаратов группы фторхинолонов [10, 46]. Таким образом, вероятность возникновения и отбора резистентных штаммов в больших популяциях микобактерий достаточно высока. В легочной каверне диаметром 2,5 см обнаруживают около 108 бактерий возбудителя туберкулеза, следовательно, в ней может содержаться примерно 102 клеток, резистентных к изониазиду. При селективном давлении изониазида (при лечении) резистентные к этому препарату микобактерий имеют возможность беспрепятственно размножаться. Очевидно, аналогичная ситуация накопления лекарственно-резистентных мутантов М. tuberculosis в организме больного туберкулезом может иметь место и в случае применения других антимикробных препаратов. Различия заключаются лишь в молекулярных механизмах возникновения резистентности. Накопленные к настоящему времени данные о природе лекарственной резистентности М. tuberculosis представлены в таблице 4.
Резистентность к изониазиду. Клетки М. tuberculosis и М. bovis высокочувствительны к действию изониазида. Препарат оказывает ингибирующий эффект на эти микроорганизмы в концентрации 0,02 мкг/мл. Остальные виды микобактерий менее восприимчивы к изониазиду. Для их ингибирования требуется концентрация препарата от 1 до 10 мкг/мл. Имеется огромное количество информации, как в области генетики, так и биохимии, о многоступенчатости процесса активации изониазида, превращении его в активное производное, способное ингибировать синтез миколо-вой кислоты.
Долгое время отсутствие каталазной активности рассматривалось только в качестве маркера устойчивости к изониазиду. Позже было установлено, что эта корреляция является результатом мутации в гене katG, кодирующем синтез каталазы-пероксидазы [106, 218]. Это явление наблюдается приблизительно у 50% клинических штаммов (Табл. 4). При поглощении бактериями М. tuberculosis изониазида происходит его окисление каталазой-пероксидазой и превращение в активный промежуточный продукт, который оказывает губительное действие на клетку.
В присутствии интактной каталазы-пероксидазы генерируется активный агент, который подавляет работу фермента, участвующего в синтезе миколовых кислот -енол-кислой фосфатредуктазы, кодируемой геном inhA [32, 167]. По-видимому, мутации в гене inhA являются причиной резистентности к изониазиду у примерно 25% изолятов. Большинство мутаций приводят к активации экспрессии гена inhA и, следовательно, к повышению содержания енол-кислой фосфатредуктазы, подавляющей ингибирующее действие лекарственного препарата, благодаря участию в процессе детоксикации активного промежуточного продукта изониазида [32, 67, 162]. Как правило, эти мутации обусловливают низкий уровень резистентности к изониазиду (МИК 1мкг/мл) [105, 107, 108].
После идентификации генов katG и inhA, стало очевидным, что 10% - 20% изолятов, устойчивых к изониазиду, не имеют мутаций ни в одном из этих генов. В процессе поиска дополнительных генов был обнаружен ген алрС, который кодирует синтез фермента алкилгидропероксидредуктазы. Этот фермент также участвует в детоксикации активного промежуточного продукта изониазида [212]. У многих бактерий ген ahpC контролируется геном oxyR, который регулирует ответ на окислительный шок. Интересно, что ген oxyR в клетках М. tuberculosis и М. bovis функционально не активен, тогда как в микобактериях других видов его функция не нарушена [66].
Клинические штаммы М. tuberculosis: изучение молекулярных механизмов резистентности крифампицину и изониазиду
Успех лечения туберкулеза в значительной степени зависит от своевременной диагностики и выбора методов лечения. Как правило, неадекватное лечение приводит к появлению лекарственно-резистентных штаммов возбудителя туберкулеза, и как следствие, форм заболеваний, плохо поддающихся лечению [138, 175]. Поэтому очень важно не только обнаружить и диагносцировать туберкулезную инфекцию и заболевание, но и определить лекарственную чувствительность возбудителя туберкулеза.
Поскольку М. tuberculosis является медленно растущей бактерией, обнаружение лекарственной резистентности обычными микробиологическими методами занимает от 4 до 8 недель [48, 98]. В литературе уже описан ряд мутаций, которые ответственны за резистенность возбудителя к препаратам первого поколения [157, 192] и которые можно обнаружить с помощью молекулярно-биологических методов. Применение молекулярных методов позволяет сократить время обнаружения лекарственной резистентности М. tuberculosis от нескольких недель до нескольких дней или даже меньше, а также быстро подобрать соответствующий режим лечения.
Рифампицин и изониазид - это препараты первой линии, которые используются для лечения туберкулеза [131]. Резистентность к рифампицину, одному из наиболее эффективных противотуберкулезных препаратов, связана с мутациями в гене гроВ. В 96% случаев резистентность к рифампицину обусловлена точечными мутациями, вставками и делециями, расположенными в сегменте (81 п.о.) гена гроВ [194]. Несмотря на то, что резистентность к изониазиду может быть обусловлена мутациями, присутствующими в некоторых других генах, мутации в гене katG чаще всего ответственны за резистентность к этому препарату [105, 186].
Нами разработан метод деплиторной аллель-специфичной ПЦР для обнаружения мутаций, которые отвечают за резистентность М. tuberculosis к рифампицину и изониазиду. Проведение ДАС-ПЦР совместно с амплификацией произвольно выбранных фрагментов генома М. tuberculosis значительно повышает чувствительность и точность обнаружения мутаций. При использовании областей гена mpt40 или элемента IS6770 в качестве произвольно выбранных продуктов амплификации или "вспомогательных" ампликонов, метод ДАС-ПЦР позволяет одновременно обнаруживать мутации, определять видовую принадлежность организма и контролировать качество анализируемого материала.
Семь точечных мутаций, ответственных за лекарственную резистентность большинства случаев туберкулеза, были идентифицированы методом ДАС-ПЦР. Было обнаружено 6 мутаций в гене гроВ (D516V, H526Y, H526R, H526L, S531L) и одна мутация в гене katG (S315T). Проведено 12 циклов ПЦР-анализа. Фрагмент гена mptAO (622 п.о.) и фрагмент элемента \S6110 (1085 п.о.) использовали в качестве вспомогательных ампликонов. Различия в длине вспомогательных и целевых ампликонов позволили без труда отличить их при проведении гель-электрофореза.
Были проведены предварительные эксперименты по оптимизации температуры отжига и концентрации праймеров. Применение вспомогательных праймеров, объем которых превышал в два раза концентрацию аллель-специфичных праймеров, позволило улучшить разрешающие возможности реакции. Оптимальный диапазон концентраций dNTP, при котором эффективная и специфичная ПЦР все еще происходит на фоне подавления накопления "ненужного" продукта, был определен эмпирически и составил 30-50 мкМ. При более высоких концентрациях dNTP накопление миспримированного ампликона возможно на последних этапах ПЦР. Выявлено, что в оптимизированных условиях нарастание вспомогательного ампликона эффективно подавляет накопление ложноположительного продукта ПЦР (Рис. 7). В то время, как эффективность обычной аллель-специфичной ПЦР снижалась, ДАС-ПЦР с использованием любого из праймеров полностью сохраняла способность к дискриминации аллелей.
Для проверки надежности разработанного метода было проанализировано 39 клинических штаммов М. tuberculosis, лекарственная резистентность которых была параллельно определена микробиологическими методами и ДНК-сиквенсом. Резистентность к рифампицину методом ДАС-ПЦР определялась путем выявления мутаций в гене гроВ. Десять штаммов имели мутацию D516M, другие 10 штаммов содержали одну из мутаций H D, Y Y, Y R и Y L в кодоне и mpt40 - вспомогательные ампликоны; М - маркер размеров ДНК {100 п.о). 526, а еще 10 штаммов имели замену S531L Из 39 проверенных штаммов 26 (66,7%) несли мутации, ответственные за резистентность как к рифампицину, так и к изониазиду. Резистентность к изониазиду обеспечивалась S315T аллелем гена katG. У 9 штаммов были обнаружены аллели генов гроВ и katG штаммов дикого типа. Эти штаммы оказались чувствительными к изониазиду и рифампицину. Результаты ДАС-ПЦР представлены на Рис. 8 и полностью согласуются с данными, полученными микробиологическими методами и сиквенсом.
Чтобы установить, позволяет ли этот метод различать аллели в зависимости от количества используемой геномной ДНК, был проведен ряд ПЦР анализов с использованием ДНК, количество которой варьировало от 10 пг до 100 нг. Вспомогательным ампликоном служил фрагмент гена mtp40, размером 622 п.о. Как показано на рис. 9, ПЦР сохраняла специфичность с разбросом концентраций матрицы, по меньшей мере, на 5 порядков. В описанных условиях, данный метод обеспечивал эффективное обнаружение мутаций при использовании всего лишь 10 пг ДНК генома.
Данный вид ПЦР может быть использован для обнаружения лекарственно-резистентных бактерий в смешанной популяции, в которой присутствуют и чувствительные возбудители (рис. 10). Т.о., впервые создана чувствительная диагностическая система для выявления появляющихся резистентных микобактерий, когда их доля в общей популяции еще крайне мала (не превышает 5%). Этот метод может найти применение в клиниках для мониторинга эффективности химиотерапии.
Разработка молекулярных методов экспресс-идентификации лекарственной резистентности к рифампицину и изониазиду клинических штаммов М.tuberculosis
Инфекционный процесс, обусловленный возбудителем туберкулеза с множественной лекарственной резистентностью, по мнению клиницистов, в 80-84% характеризуется остро прогрессирующим течением. Эффективность лечения таких больных при использовании только основных противотуберкулезных препаратов не превышает 22-29% [11]. По данным, полученным в ЦНИИ туберкулеза РАМН, наличие лекарственной резистентности, особенно полирезистентности, часто сочетается с большой распространенностью туберкулезного процесса в легких, что существенно снижает эффективность лечения. При лекарственной резистентности к двум основным химиопрепаратам -изониазиду и рифампицину - эффективность лечения обычно не превышает 50% по показателю прекращения выделения микобактерий [24]. В настоящее время среди впервые выявленных больных туберкулезом органов дыхания превалируют деструктивные и бациллярные формы заболевания [14, 17].
В данном разделе диссертации приведены результаты изучения уровня вирулентности лекарственно-резистентных клинических штаммов М. tuberculosis. Анализ 375 историй болезни пациентов, находящихся на лечении в противотуберкулезных учреждениях города Серпухова, Тульской и Калужской областей в течение 2000 года позволил установить, что 96,6% больных имеют тяжелые формы туберкулеза легких. Преобладали следующие клинические формы заболевания: фиброзно-кавернозный туберкулез легких (31%), инфильтративный туберкулез легких (39,7%о), диссеминированный туберкулез легких (25,9%)). Лишь 3,4% составляли другие формы туберкулеза легких. Продолжительность заболевания колеблется в широком интервале - от нескольких месяцев до 20-30 лет. 58,6% пациентов больны туберкулезом от 2 до 16 лет, 5,8% - от 17 до 30 лет. 65,5% пациентов самостоятельно обратились за помощью в лечебные учреждения и только 35,5% больных были выявлены при профилактических осмотрах.
При исследовании выделенных от больных штаммов М. tuberculosis установлено, что культуры, резистентные одновременно к изониазиду и рифампицину, составляют 47,2%. К одному лекарственному препарату резистентно 9,3%, к двум - 13,9%, к трем - 13,0%, к четырем - 16,6% и к пяти -28,7% штаммов. Штаммы, чувствительные к пяти проверяемым препаратам, составили 18,5%.
Для экспериментальных исследований были отобраны 10 клинических штаммов М. tuberculosis: 8 лекарственно-резистентных (6 из них мультирезистентных) и 2 лекарственно-чувствительных. Данные по лекарственной резистентности приведены в табл. 6. Как резистентные, так и чувствительные штаммы были выделены из мокроты больных с тяжелыми формами туберкулеза. Штаммы 1643, 1544, 155/6, 1486 и 1481 выделены от больных с диагнозом инфильтративный туберкулез легких. Штаммы 1626, 1462 и 1540 выделены от больных с диагнозом фиброзно-кавернозный туберкулез легких. Штаммы 1402 и 1397 выделены от больных с диссеминированным туберкулезом легких. Все исследованные микобактериальные культуры на среде Левенштейна-Йенсена росли в R-форме и при окраске по Цилю-Нильсену имели вид кислотоустойчивых палочек. По данным анализа, включающего результаты теста по выращиванию культур на средах, содержащих натрий салициловокислый, полуколичественного определения каталазы и ее термостабильности, а также наличия в хромосоме \S6110-sneMema, все исследованные клинические штаммы являются М. tuberculosis.
Во всех М. tuberculosis, резистентных к рифампицину, при ПЦР-секвенировании выявлены мутации в гене гроВ, кодирующем синтез р-субъединицы РНК-полимеразы. Мутации расположены в трех кодонах- 516, 526 и 531. У изониазид-резистентных микобактерии подвергнут ПЦР-секвенированию фрагмент гена katG. При этом у 4 из 6 обнаружены мутации в 315 кодоне. Один из изолятов характеризовался наличием полиморфизма в 463 кодоне, а другой содержал 2 мутации в 315 и 463 кодонах (табл. 7).
В опытах по заражению перевиваемых макрофагоподобных клеток J774 микобактериальными клетками активность фагоцитоза выражали фагоцитарным числом, характеризующим количество фагоцитированных бактерий одним макрофагом. Фагоцитарные числа для всех исследованных культур М. tuberculosis имели близкие значения (от 3 до 30). Микобактерии всех культур в течение 5 суток сохранялись внутри макрофагов. Другой учитываемый параметр - фагоцитарная активность, выраженная в процентном содержании фагоцитирующих макрофагов. Фагоцитарная активность в 1-е сут варьировала от 30 до 100%. На 5-е сутки этот показатель для всех культур составлял 100%.Для оценки вирулентности клинических штаммов М. tuberculosis после внутривенного заражения мышей через 28 суток проводили высев бактериальной культуры из легких и селезенки инфицированных животных - индивидуально из органов каждого животного. В качестве контроля использовали животных, зараженых микобактериями штамма H37Rv. Обсемененность паренхиматозных органов выражали в десятичных логарифмах концентрации бактериальных клеток. Полученные результаты приведены в табл. 7.
По уровню инвазивности штаммы распределились на 3 группы. Первая группа включает наименее инвазивные клинические штаммы: 1462, 1481, 1626, 1397, 155/6 и контрольный штамм H37Rv (показатели инфицированности легких зараженных животных - Ig 5,56-6,64). Вторая группа является промежуточной по уровню вирулентности и содержит только 1 штамм (1486), обсемененность легких которым составляла Ig 7,05. В третью группу входят наиболее вирулентные штаммы: 1402, 1544, 1643, 1540. В этой группе наряду с лекарственно-резистентными оказались и лекарственно-чувствительные микобактерии. Концентрация микобактериальных клеток в легких мышей, зараженных этими культурами, равнялась Ig 7,66 - 8,23. Штамм 1540 вызвал гибель 50% зараженных животных.
