Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Методы генотипирования M. tuberculosis 10
1.1.1. IS6110-RFLP-типирование 12
1.1.2. Сполиготипирование 14
1.1.3. MIRU-VNTR-типирование 17
1.2. Молекулярно-генетические исследования M. tuberculosis в России .22
1.2.1. Генотипирование клинических изолятов M. tuberculosis 22
1.2.2. Лекарственная устойчивость клинических изолятов M. tuberculosis 29
1.2.3. Геномный полиморфизм, клиническая и эпидемиологическая значимость штаммов M. tuberculosis генетического семейства Beijing 32
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 38
2.1. Материал исследования .38
2.2. Микробиологические исследования 38
2.3. Сбор и подготовка образцов биомассы M. tuberculosis для генотипирования 39
2.4. Молекулярно-генетические методы типирования клинических изолятов M. tuberculosis 40
2.4.1. Генотипирование с использованием тест-системы "Амплитуб-Beijing" 40
2.4.2. MIRU-VNTR-типирование 40
2.4.3. Сполиготипирование 43
2.4.4. IS6110-RFLP-типирование 45
2.4.5. Определение мутаций устойчивости к рифампицину и изониазиду у клинических изолятов M. tuberculosis 51
2.5 Статистическая обработка результатов 51
ГЛАВА 3. Генотипическая характеристика изолятов m. tuberculosis, полученных от больных туберкулезом в уральском федеральном округе Российской Федерации ...52
3.1. Генотипы клинических изолятов non-Beijing, полученных от впервые выявленных больных туберкулезом 55
3.2. Геномный полиморфизм изолятов Beijing, полученных от впервые выявленных больных туберкулезом 64
3.3. Генотипы изолятов M. tuberculosis, полученных от ранее леченных больных туберкулезом 71
ГЛАВА 4. Отношение к противотуберкулезным препаратам клинических изолятов m. tuberculosis 78
4.1. Характеристика лекарственной чувствительности клинических изолятов M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам первого ряда 78
4.2. Мутации устойчивости к рифампицину и изониазиду у клинических изолятов M. tuberculosis 91
ГЛАВА 5. Схема генотипирования клинических изолятов m. Tuberculosis в уральском федеральном округе российской федерации .99
Заключение 107
Выводы .109
Практические рекомендации 110
Список использованных сокращений 111
Список использованной литературы .112
Приложения 136
- Молекулярно-генетические исследования M. tuberculosis в России
- Генотипирование с использованием тест-системы "Амплитуб-Beijing"
- Геномный полиморфизм изолятов Beijing, полученных от впервые выявленных больных туберкулезом
- Мутации устойчивости к рифампицину и изониазиду у клинических изолятов M. tuberculosis
Введение к работе
Актуальность проблемы
Туберкулез остается актуальной проблемой российского
здравоохранения. Согласно официальным данным в Уральском федеральном округе (ФО) в 2012 г. показатель заболеваемости туберкулезом на 27,2% превысил средний по России (68,1 на 100 тыс. населения). Растет число инфицированных штаммами Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) (20,8% в 2012 г. против 16,1% в 2009 г.), обладающих резистентностью, по меньшей мере, к двум наиболее эффективным противотуберкулезным препаратам (ПТП) – изониазиду и рифампицину (Скорняков С.Н., 2013).
Микробиологический мониторинг возбудителя туберкулеза в
современных условиях основан на анализе специфических нуклеотидных последовательностей хромосомной ДНК M. tuberculosis с использованием сполиготипирования, MIRU-VNTR- и IS6110-RFLP-типирования и других методов исследования геномного полиморфизма микобактерий (van Embden J. et al., 1993; Kamerbeek J. et al., 1997; Supply P. et al., 2006).
Соотношение генотипов в популяциях M. tuberculosis может существенно различаться в разных странах и географических регионах мира (Kremer K. et al., 2005; Iwamoto T. et al., 2007; Comas I., et al., 2009; Mokrousov I. et al., 2008). При этом следует учитывать, что, вследствие недостаточной проработки критериев принадлежности к генетическому семейству (линии), классификация изолятов M. tuberculosis на основе сопоставления их профилей сполиготипирования и MIRU-VNTR-типирования с имеющимися в компьютерных базах данных1 условна.
1 SITVITWEB () и MIRU-VNTRplus ()
Степень разработанности темы исследования
В настоящее время генетически неоднородная российская популяция
возбудителя туберкулеза насчитывает около 200 сполиготипов,
представляющих более 20 генетических семейств/линий, среди которых доминирует эпидемиологически и клинически значимый генотип Beijing (Нарвская О.В., 2003; Мокроусов И.В. и др., 2012). Однако сведения о структуре субпопуляций возбудителя туберкулеза на территориях России неполны. В научной литературе имеются единичные публикации, посвященные генотипической характеристике возбудителя туберкулеза в Уральском ФО. Так, в 2001 – 2002 гг. проведено исследование 98 уральских изолятов M. tuberculosis с использованием MIRU-VNTR-типирования (12 локусов MIRU) и показано доминирование изолятов, отнесенных к генетическому семейству W-Beijing (54,3%) (Kovalev S. et al., 2005). В этой работе у 15,2% изолятов впервые был идентифицирован новый генотип, получивший наименование URAL.
Цель исследования – изучить региональные особенности генетической структуры популяции M. tuberculosis в современных условиях и разработать схему генотипирования возбудителя туберкулеза в Уральском ФО РФ.
Задачи исследования:
-
Провести генотипирование клинических изолятов M. tuberculosis, полученных в Уральском ФО РФ, с использованием ПЦР-тест-системы «Амплитуб-Beijing» и методов MIRU-VNTR-, IS6110-RFLP и сполиготипирования.
-
Определить лекарственную чувствительность и мутации, обусловливающие устойчивость возбудителя туберкулеза к рифампицину и изониазиду, у M. tuberculosis различных генотипов.
-
Оценить распространенность и эпидемиологическую значимость M. tuberculosis различных генотипов в исследуемых когортах больных.
-
Разработать оптимальную схему генотипирования клинических изолятов
M. tuberculosis с учетом особенностей современной структуры популяции
возбудителя туберкулеза в Уральском ФО РФ.
Научная новизна работы
Впервые, с использованием стандартизированных молекулярно-генетических методов (MIRU-VNTR-типирования, сполиготипирования, RFLP-IS6110-типирования) и ПЦР-тест-систем «Амплитуб-Beijing» и «ТБ-Биочип (MDR)», получена комплексная генотипическая характеристика клинических изолятов M. tuberculosis в Уральском ФО РФ.
Установлено, что среди клинических изолятов M. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в Уральском ФО РФ доминируют представители генотипа Beijing, обладающие МЛУ за счет мутаций Ser531Leu и Ser315Thr в генах rpoB и katG, соответственно.
Впервые c помощью сполиготипирования проведен анализ структуры DR области хромосомы 80 уральских изолятов M. tuberculosis группы non-Beijing и установлена принадлежность 74 из них к 37 сполиготипам 15 генетических семейств, представленных в международной компьютерной базе данных SITVITWEB; описано 6 ранее не известных сполиготипов.
Теоритическая и практическая значимость работы
Полученные экспериментальные данные расширяют информацию о генетической структуре популяции возбудителя туберкулеза на территории Урала.
В лаборатории экспериментальных и диагностических методов исследования Федерального государственного бюджетного учреждения «Уральский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «УНИИФ» Минздрава России) создана и поддерживается коллекция, включающая на начало 2013 года 823 клинических изолята и образцы ДНК M. tuberculosis 714 больных туберкулезом в Уральском ФО РФ.
Сполигопрофили и MIRU-VNTR профили 83 изолятов M. tuberculosis включены в международную, постоянно обновляемую компьютерную базу данных SITVITWEB и SITVIT 2 (Institut Pasteur de la Guadeloupe).
Разработана научно обоснованная схема генотипирования возбудителя туберкулеза в Уральском ФО РФ, согласно которой на первом этапе осуществляется дифференциация M. tuberculosis на группы Beijing/non-Beijing и определение мутаций устойчивости к основным ПТП с использованием ДНК, выделенной из клинического материала; последующее MIRU-VNTR-типирование изолятов M. tuberculosis генотипа Beijing проводится c использованием 9 локусов, изолятов других генотипов (non-Beijing) - 15 локусов и сполиготипирования.
С использованием предложенной схемы в ФГБУ «УНИИФ» проводится эпидемиологический анализ путей распространения туберкулеза, выделяются группы риска больных по развитию лекарственно-устойчивого заболевания, а также оценивается эффективность противоэпидемических мер, проводимых в очагах инфекции и на территории стационара ФГБУ «УНИИФ».
Материалы исследования используются в учебном процессе в ФГБУ «УНИИФ» и на кафедре фтизиатрии и пульмонологии Уральского государственного медицинского университета.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
-
Популяция M. tuberculosis в Уральском ФО РФ генетически неоднородна и представлена штаммами глобально распространенных генетических групп/семейств, среди которых доминирует Beijing.
-
Штаммы M. tuberculosis генотипа Beijing играют ключевую роль в распространении возбудителя туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью в Уральском ФО РФ.
-
Устойчивость изолятов M. tuberculosis Beijing к рифампицину и изониазиду ассоциирована с сочетанием замен rpoBSer531Leu и katGSer315Thr. В группе non-Beijing выявлена ассоциация МЛУ, обусловленная сочетанием замен rpoBAsp516Val, katGSer315Thr1 и inhA_T15, с принадлежностью изолятов к сполиготипуSIT252 семейства LAM.
4. Разработанная схема генотипирования клинических изолятов M. tuberculosis эффективна для проведения микробиологического мониторинга возбудителя туберкулеза на территории Уральского ФО РФ.
Апробация работы и публикации
Основные результаты исследований доложены и обсуждены на Российских и международных конференциях: 18-20 октября 2012 г., г. Санкт-Петербург: 1-й Конгресс Национальной Ассоциации фтизиатров «Актуальные проблемы и перспективы развития противотуберкулезной службы в Российской Федерации»; 17-22 марта 2013 г., г. Берлин: Седьмой симпозиум имени Р. Коха и И.И. Мечникова; 23-25 апреля 2013 г., г. Екатеринбург: региональная научно-практическая конференция с международным участием «Пути повышения качества и эффективности деятельности противотуберкулезных учреждений»; 24 сентября 2013 г., г. Екатеринбург: научная сессия с международным участием «Фундаментальные исследования – практической фтизиатрии».
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Структура и объем диссертации
Молекулярно-генетические исследования M. tuberculosis в России
Существует немало работ, иллюстрирующих особенности штаммов возбудителя туберкулёза в разных странах мира, в том числе и в регионах России. Показано, что популяция микобактерий туберкулеза является поликлональной. Соотношение отдельных клонов (генетических семейств) может различаться на отдельных территориях, что в свою очередь связано с особенностями течения эпидемического процесса [14].
В настоящее время на территории России регулярный мониторинг возбудителя туберкулеза с использованием молекулярно-генетических методов не проводится. В научной литературе можно встретить отдельные работы по молекулярно-генетической характеристике территориальных популяций M. tuberculosis с использованием различного набора методов генотипирования, что затрудняет сопоставление результатов, полученных в разных регионах страны (Таблица 3).
Имеются единичные работы, посвященные характеристике популяции возбудителя туберкулеза в Уральском регионе. Так, еще в 2001 – 2002 гг. в Свердловской области с использованием 12 MIRU локусов [164] и 9 дополнительных VNTR локусов [109] было проведено MIRU-VNTR-типирование культур M. tuberculosis, выделенных от 92 больных туберкулезом - жителей Уральского региона [109]. Исследование показало, что на данной территории доминировали штаммы генетического семейства Beijing (54,3%). Семейства LAM(AI) и Haarlem были представлены 8,8% и 5,4% изолятов соответственно. В этой работе впервые была охарактеризована группа штаммов, получившая наименование URAL (15,2%). Также были предложены критерии принадлежности к этой генетической группе/линии: 1 повтор в локусе MIRU26 и 6-13 повторов в локусе MIRU10. Позднее были описаны особенности сполигопрофиля штаммов генотипа URAL: отсутствие сигналов 29-31 и 33-36, что соответствовало подсемейству Haarlem4 согласно базе данных SpolDB4 [59], а по данным обновленной версии базы -SITVITWEB часть сполиготипов (SIT35, SIT262) отнесли к семейству H3 [76].
Таким образом, одной из характерных особенностей структуры популяции возбудителя туберкулеза на территории России является доминирование штаммов генетического семейства Beijing. В целом, около половины Российской популяции возбудителя туберкулеза представлено штаммами этого генетического семейства.
Данные о генотипе изолятов возбудителя туберкулеза обычно дополняют данными о лекарственной чувствительности (ЛЧ), полученными с помощью культуральных и/или молекулярно-генетических методов. Доказано, что возникновение лекарственной устойчивости к противотуборкулезным препаратам (ПТП) обусловлено мутациями в геноме M. tuberculosis, при этом, одной из главных причин длительной циркуляции лекарственно устойчивых (ЛУ) штаммов является применение неадекватных схем химиотерапии [81].
Мутации, обусловливающие ЛУ не связаны между собой, поэтому степень вероятности формирования устойчивости микобактерий к трем одновременно принимаемым препаратам находится в диапазоне вероятности от 10-18 до 10-20. Причиной возникновения фенотипа МЛУ служит накопление независимых мутаций в нескольких генах, участвующих в формировании ЛУ к каждому препарату [184].
Резистентность к изониазиду является наиболее распространенной формой наблюдаемой ЛУ к ПТП, возникающей с частотой 10-5-6. Установлено, что устойчивость к этому препарату является результатом мутаций, затрагивающих несколько генов. Ген katG осуществляет контроль клеточной каталазно-пероксидазной активности и переводит изониазид в активную форму. Показано, что высокоустойчивые клинические изоляты M. tuberculosis утрачивают активность каталазно-пероксидазную активность, кодируемую геном katG. Мутация katGSer315Thr является наиболее распространенной и встречается у 50-90% клинических изолятов, устойчивых к изониазиду. Мишенями для изониазида (как и его структурного аналога этионамида) в клетках микобактерий служат белки – продукты гена inhA, участвующего в синтезе миколовых кислот клеточной стенки, и гена kasА. Мутации в этих генах, наряду с мутациями в области межгенного участка oxyR-ahpC, также обусловливают резистентность M. tuberculosis к изониазиду и этионамиду. Мутации на уровне inhA, как правило, ассоциируются с низкой устойчивостью и наблюдаются реже, чем мутации в гене katG. Сочетание мутаций в генах katG и inhA приводит к повышению уровня устойчивости к изониазиду. Механизм резистентности 15-20% устойчивых к изониазиду штаммов M. tuberculosis остается неизвестным [8, 150, 184].
Устойчивость к рифампицину у 96% изолятов связывают с мутациями в гене rpoB, приводящими к нарушению первичной структуры -субъединицы РНК-полимеразы, с которой связывается рифампицин, блокируя процесс транскрипции РНК в клетках M. tuberculosis. Частота возникновения мутаций к рифампицину составляет 10-7 - 10-8. Мутации в кодонах 531, 526, 516 rpoB относят к наиболее часто встречаемым в рифампицин-устойчивых штаммах. Обычно мутации rpoB531 обусловливают высокую резистентность и перекрестную устойчивость ко всем препаратам рифампицинового ряда, однако мутации в кодонах 511, 516, 518 и 522 ассоциируются с низкой устойчивостью к рифампицину и рифапетину, но сохраняют чувствительность к рифамбутину и рифалазилу [8, 184].
Предполагают, что ряд генов микобактерий может регулировать работу нескольких физиологических систем клетки (репарационной и антиоксидантной системы, транспорта низкомолекулярных соединений и т.п.), которые влияют на процесс возникновения и закрепления мутаций, в том числе мутаций лекарственной устойчивости. Например, наличие аллельных вариантов в 3R – генах (репарации, репликации, рекомбинации), в генах оксигеназ и супермутаз напрямую влияет на темп и тип возникновения мутаций [15].
В большинстве регионов России показана ассоциация генотипа Beijing c лекарственной устойчивостью, причем сразу к нескольким препаратам первого ряда (изониазиду, рифампицину, этамбутолу, стрептомицину) [9, 12, 16, 18, 19, 30, 39, 57, 61, 72]. Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) штаммов этого генотипа чаще всего обусловлена заменами в гене rpoB531 и katG315, которые ассоциированы с высоким уровнем устойчивости к рифампицину и изониазиду in vitro [14, 30]. Также для штаммов Beijing, устойчивых к рифампицину, описаны мутации гена rpoB в кодонах 516, 526 - [21, 30], кодоне 533 [20] и мутации в кодонах 335, 463 гена katG, inhA_T15, inhA_G8, обеспечивающие устойчивость к изониазиду [20, 43].
Генотипирование с использованием тест-системы "Амплитуб-Beijing"
Для постановки ПЦР применяли реактивы производства ООО «Интерлабсервис», г. Москва. Изоляты были генотипированы методом MIRU-VNTR с использованием 15 локусов: Mtub04, ETRC, MIRU04, MIRU40, MIRU10, MIRU16, Mtub21, QUB11b, ETRA, Mtub30, MIRU26, MIRU31, Mtub39, QUB26, QUB4156. Для дифференцирования изолятов генотипа Beijing, объединенных в кластеры MIRU-VNTR, использовали 3 гипервариабельных локуса: VNTR4120, VNTR3820, VNTR3232. Праймеры для ПЦР, представленные в работах P. Supply, 2006 [164] и Iwamoto T., 2007 [99], синтезированы в ООО «Синтол», г. Москва.
ПЦР осуществляли в термоциклере «Терцик» (ООО ДНК технология, г. Москва) Объем реакционной смеси составил 25 мкл. ПЦР смесь 1, общий объем 5 мкл: праймеры, по 1 мкл прямого и обратного (конечная концентрация 200 мкМ/л), dNTPmix - 2,5 мкл (конечная концентрация 200 мкМ/л), стерильная дистиллированная вода – 0,5 мкл. ПЦРсмесь 2, общий объем 18 мкл: 5ПЦР-буфер – 4 мкл, MgCl2 – 2 мкл (конечная конц. 2,0 мМ/л) Диа Так-полимераза - 0,2 мкл (1 ед), стерильная дистиллированная вода – до 18 мкл. ПЦР смесь 1 и ПЦР смесь 2 разделяли воском. В смесь вносили по 2 мкл ДНК, полученной, как указано в п.2.3.
Условия проведения ПЦР: 15 мин – 950 C, 40 циклов: 30 сек. – 950 С, 30 сек – 600 С, 45 сек – 720 С, 10 мин – 720 С. При постановке ПЦР в качестве контроля применяли ДНК штамма M. tuberculosis H37Rv.
Продукт ПЦР подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием (0,5 мкг/мл). Электрофорез проводили в ТВЕ1 буфере с использованием камеры для горизонтального электрофореза Sub Cell GT System Bio-Rad, США. Для определения молекулярной массы «размера» продуктов амплификации в гель вносили маркер молекулярной массы (1kb DNA Ladder, «Интерлабсервис»). Результаты ПЦР наблюдали в геле в виде светящихся полос при ультрафиолетовом излучении с помощью системы документации гелей BioRad «GelDoc», США. Число повторов в MIRU-VNTR-локусах устонавливали по молекулярной массе продукта амплификации согласно таблице 4.
MIRU-VNTR-профиль для каждого изолята записывался в виде набора цифр, соответствующих числу повторов в локусах в следующем порядке: Mtub04, ETRC, MIRU04, MIRU40, MIRU10, MIRU16, Mtub21, QUB11b, ETRA, Mtub30, MIRU26, MIRU31, Mtub39, QUB26, QUB4156.
Принадлежность изолятов к генетической линии (lineage) устанавливали путем сравнения полученных MIRU-VNTR профилей изолятов с имеющимися в базе данных «MIRU-VNTRplus» (http://www.miru vntrplus.org). Для оценки вариабельности генетических локусов использовали индекс Хантера-Гастона (HGDI), который рассчитывали при помощи алгоритма http://www.hpa-bioinformatics.org.uk/cgi-bin/DICI/DICI.pl. Сполиготипирование (spoligotyping, spacer oligonucleotide typing) проводили с набором реагентов для сполиготипирования (Isogen Bioscience BV) в соответствии указаниями производителя. Амплификацию DR-области хромосомной ДНК клинических изолятов МБТ, контрольных штаммов M. tuberculosis H37Rv и M. bovis BCG P3 проводили со специфическими праймерами Dra (меченный биотином) и Drb. Для постановки ПЦР использовали 10 мкл пробы ДНК, реагенты и ДНК контрольных штаммов в следующем режиме: 96С – 3 мин, 20 циклов: 96С – 1 мин, 55С – 1 мин, 72С – 30 сек; 72С – 30 сек.
Гибридизацию меченных биотином продуктов амплификации ДНК клинических изолятов M. tuberculosis и контрольных штаммов с 43 спейсерными олигонуклеотидами, фиксированными на мембране, осуществляли в следующем порядке. В микропробирки объемом 1,5 см3 вносили по 150 мкл смеси 2xSSPE/0,1%SDS (1:1) (20х SSPE - 12 мл, 10%SDS – 1,2 мл, дистиллированная вода 120 мл), нагретой до 600 С. В каждую пробирку добавляли 20 мкл амплифицированной в ПЦР ДНК изолята или контрольного штамма. Пробирки инкубировали при 980С 10 мин, затем резко охлаждали во льду при -200С в течение 10-15 мин и осаждали конденсат при 7000 об/мин – 30 сек. Специальную мембрану для сполиготипирования инкубировали в 100 мл нагретого до 600 C раствора 2хSSPE/0,1%SDS в течение 5 мин. Мембрану укладывали на подложку и помещали в миниблоттер, располагая перпендикулярно маркированным (с 1 по 45) пазам (слотам), нанесенным на внутреннюю сторону крышки миниблоттера, выравнивая так, чтобы отверстия на концах пазов располагались вдоль темных маркировочных линий мембраны, показывающих линейный порядок расположения на мембране 43 стандартных спейсерных олигонуклеотидов. Затягивали винты блоттера и удаляли жидкость из пазов с помощью дозатора через отверстия в крышке. Затем, дозатором, меняя наконечники, через верхние отверстия заполняли пазы, внося в 1-й и 45-й - раствор 2хSSPE/0,1%SDS, во 2-й и 3-й – подготовленные пробы ПЦР-продукта ДНК контрольных штаммов, в 4-й – дистиллированную воду, в следующие – ПЦР-продукты ДНК изолятов. Блоттер помещали в термостат и инкубировали при 600 С в течение часа. Удаляли содержимое из пазов с помощью дозатора. Мембрану дважды отмывали в 100 мл раствора 2хSSPE/0,5%SDS, нагретого до 600С и инкубировали 10 мин, периодически покачивая кювету. Далее мембрану сворачивали в рулон и помещали в стеклянную тубу, вносили 10 мл свежеприготовленной смеси: 2хSSPE/0,5%SDS (прогретой при 420C), 2,5 мкл конъюгата стрептавидина и пероксидазы. Тубу плотно закрывали крышкой и закрепляли в роторе термостата. Гибридизацию осуществляли при 420 С в течение 1-1,5 часов. Мембрану дважды (по 10 мин) отмывали при 420 C в 100 мл раствора 2хSSPE/0,5%SDS, затем дважды (по 5 мин) - при комнатной температуре в 100 мл раствора 2хSSPE. Детекцию хемолюминесценции гибридизованной ДНК проводили со смесью реагентов из набора ECL (Amersham) согласно указаниям производителя.
Мембрану экспонировали на светочувствительной пленке Hyperfilm ECL - 20 мин, затем проявляли в течение 1-2 мин, промывали водой, фиксировали 3-5 мин, вновь промывали водой и сушили при комнатной температуре.
Результаты сполиготипирования оценивали визуально, отмечая наличие каждого из 43 спейсеров в виде темных пятен на пленке, и представляли с помощью бинарного кода: 1 (наличие спейсера) и 0 (отсутствие спейсера). Каждый изолят имел определенный числовой код -, который для обработки переводили в восьмеричный формат и обратно с использованием Microsoft Excel. Полученные профили сравнивали с данными, представленными в международной компьютерной базе SITVITWEB - http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT_ONLINE/ и ее обновленной версии SITVIT2, включавшей на момент сравнения около 40 тысяч профилей сполиготипирования.
Геномный полиморфизм изолятов Beijing, полученных от впервые выявленных больных туберкулезом
У 98 изолятов, принадлежащих по результатам типирования тест-системой «Амплитуб-Beijing» к генетической группе Beijing, было выявлено 44 MIRU-VNTR профиля (Рисунок 6).
64 (65,3%) изолята Beijing входили в состав 10 кластеров (Рисунок 6): Bj1, Bj2, Bj26 и Bj39 – по 2 (2,0%) изолята; Bj27 – 3 изолята (3,1%); Bj3 – 4 (4,1%) изолята; Bj8 и Bj10 – по 5 (5,0%) изолятов; Bj34 – 8 (8,2%) изолятов. Самый многочисленный кластер – Bj 23 объединял 32 (32,7%) изолята (рисунок 6, приложение B).
В таблице 8 представлены значения HGDI для 15 MIRU-VNTR локусов изолятов Beijing. Наиболее информативными оказались локусы MIRU26 (HGDI - 0,651) и QUB26 (HGDI - 0,603). Локусы MIRU31, Mtub21, QUB11b, MIRU40 имели низкую степень полиморфизма (HGDI: 0,243, 0,190, 0,173 и 0,155 соответственно). Значения HGDI для локусов ETRA, Mtub04, MIRU10 и MIRU16 было ниже 0,1: 0,098, 0,079, 0,060 и 0,060 соответственно. Пять локусов: Mtub 39, Mtub30, MIRU4, ETRC и QUB4156 были мономорфными (Таблица 8).
Значение HGDI для MIRU-VNTR-типирования (15 локусов) группы Beijing составило 0,884. больных. Цифрами справа показано число повторов в локусах: Mtub04, ETRC, MIRU04, MIRU40, MIRU10, MIRU16, Mtub21, QUB11b, ETRA, Mtub30, MIRU26, MIRU31, Mtub39, QUB26, QUB4156Генотипирование по трем дополнительным (гипервариабельным) локусам: VNTR4120, VNTR3820, VNTR3232 [99] было проведено для 64 изолятов, входивших в число 10 MIRU-VNTR-кластеров (приложение B). Значения HGDI для трех локусов, представлены в таблице 9. Таблица 9 – Полиморфизм трех гипервариабельных VNTR локусов в пределах MIRU-VNTR- кластеров (15 локусов) изолятов генотипа Beijing Locus HGDI Число аллелей Число повторов
Использование гипервариабельных локусов позволило «разбить» 7 из 10 MIRU-VNTR-кластеров: Bj1, Bj3, Bj8, Bj10, Bj23, Bj27 Bj34 (Рисунок 7). Один кластер, состоящий из двух изолятов – Bj39, остался мономорфным; для кластеров Bj2 и Bj26 результаты получены не были (не прошла ПЦР) (Рисунок 7).
IS6110-RFLP-типирование 45 изолятов M. tuberculosis Beijing углубило дифференциацию в пределах MIRU-VNTR-кластеров: выявлено 17 близкородственных (коэффициент сходства 83%) типов IS6110-RFLP-профилей, которые различались как по количеству (15-19), так и по молекулярной массе фрагментов рестрикции хромосомной ДНК, содержащих участок последовательности инсерционного элемента IS6110 (Рисунок 7, 8).
Минимальное охватывающее древо (Minimum spanning tree) профилей MIRU-VNTR (15 локусов) клинических изолятов M. tuberculosis Beijing впервые выявленных больных туберкулезом
Размеры узлов пропорциональны числу изолятов в составе MIRU-VNTR-кластера. Числовой профиль (число повторов в каждом из 15 локусов - Mtub04, ETRC, MIRU04, MIRU40, MIRU10, MIRU16, Mtub21, QUB11b, ETRA, Mtub30, MIRU26, MIRU31, Mtub39, QUB26, QUB4156) показан в 1-й строке у каждого узла, ниже построчно приведены числовые профили для трех гипервариабельных локусов (VNTR4120, VNTR3820, VNTR3232) и профили IS6110-RFLP (обозначены жирным шрифтом). Цифры в скобках обозначают число изолятов, превышающее 1.
Как видно из рисунка 8, 15 (88%) из 17 вариантов профилей рестрикции IS6110 были индивидуальны (т.е. обнаружены у одного изолята), остальные представляли два крупных кластера: А0 и В0, включавших 5 (10,9%) и 25 (54,4%) изолятов с идентичными профилями рестрикции соответственно.
Сопоставление данных MIRU-VNTR-типирования и IS6110-RFLP-типирования выявило, что из 32 изолятов MIRU-VNTR-кластера Bj23, 16 (50,0%) также имели идентичные IS6110-RFLP-профили (В0), в 6 случаях (18,9%) IS6110-RFLP-профили различались (L4, M0, L19, B31, M9, B32); малое количество ДНК в 10 случаях не позволило осуществить IS6110-RFLP-типирование. Изоляты с профилем В0, по данным MIRU-VNTR-типирования также принадлежали кластерам: Bj3– 2 изолята; Bj10– 4 изолята; Bj4, Bj19, Bj20 – по одному изоляту (Рисунок 7).
У изолятов MIRU-VNTR-кластера Bj34 определены следующие варианты IS6110-RFLP-профилей: А0 - 3 изолята, С3 – 1 изолят и С7 – 1 изолят (Рисунок 7). По данным IS6110-RFLP-типирования 3 из 5 изолятов MIRU-VNTR-кластер Bj8 имели уникальные IS6110-RFLP-профили: B28, А12, С11; для двух изолятов данных IS6110-RFLP-типирования не получено.
Штаммы IS6110-RFLP-кластеров А0 и В0 ранее были описаны как представители доминирующих клонов Beijing на территории РФ [30, 134]. Штаммы B0 (W148) отличает повышенная вирулентность, которая проявляется высокой способностью к распространению (трансмиссивность), в том числе в стационарах [55, 115], более быстрыми, по сравнению с другими вариантами Beijing, темпами роста популяции на территории России [30, 25] и ассоциацией с МЛУ и тяжелым течением туберкулеза [30]. Эти данные свидетельствует о высокой эпидемиологической и клинической значимости штаммов RFLP-кластера В0 на территории Уральского ФО РФ.
По данным Мокроусова И.В. (2012) [27], маркером принадлежности к IS6110-RFLP-кластеру B0 является наличие 6-7 повторов в локусе QUB26 и 7 повторов в локусе MIRU26. В настоящей работе выявлена зависимость между принадлежнастью к семейству Beijing, кластеру В0 и наличием 6-7 повторов в локусах QUB26 и MIRU26 (р=0). Число изолятов, содержащих по 6-7 повторов в локусах QUB26 и MIRU26, составляло 52 (53,1%).
Полученные данные свидетельствуют о текущей диссеминации штаммов генотипа Beijing на территории Уральского ФО.
Мутации устойчивости к рифампицину и изониазиду у клинических изолятов M. tuberculosis
Результаты выявления мутаций устойчивости к рифампицину и изониазиду с помощью тест-системы «ТБ-Биочип», были получены для 174 из 178 изолятов M. tuberculosis впервые выявленных больных (Таблица 17). Из них 77 (44,3%) не имели мутаций. Мутации в генах rpoB, katG и/или inhA, обусловливающих МЛУ, выявлены у 72 (41,4%) изолятов.
Как видно из таблицы 17, мутации в гене rpoB, обусловливающие устойчивость к рифампицину, были обнаружены у 73 (41,9%) изолятов. Большинство (82,2%) из них имели замену rpoBSer531Leu. Вторую по частоте встречаемости мутацию - rpoBAsp516Val несли 6 (8,2%) изолятов; по 3 (4,1%) изолята содержали замены rpoBLeu511Pro и rpoBHis526Tyr; один изолят имел мутацию rpoBMet515Ile.
Устойчивость к изониазиду была обусловлена мутациями в генах katG и inhA – у 92 и 15 изолятов соответственно. Самая распространенная замена katGSer315Thr1 была отмечена у подавляющего большинства (97,8%) изолятов; замена katGSer315Thr2 встретилась лишь у двух изолятов. В структуре мутаций гена inhA преобладала inhA_T15 (80,0%) (Таблица 17).
Таким образом, наиболее распространенным сочетанием замен, обусловливающих МЛУ, было: rpoBSer531Leu и katGSer315Thr1, выявленное у 79,2% мультирезистентных изолятов (Сочетание замен rpoBAsp516 Val, katGSer315Thr1, inhA_T15 – 5 встречалость у 6,9% МЛУ изолятов. Остальные сочетания мутаций в генах rpoB, katG и/или InhA встретились значительно реже (Таблица 18).При сопоставлении данных генотипирования и результатов определения мутаций ЛУ установлено, что доля изолятов генотипа Beijing, содержащих мутации устойчивости к рифампицину и изониазиду, составила 58,7% (57 из 97), причем у 53 (92,9%) МЛУ была связана с наличием сочетания замен Ser531Leu и Ser315Thr1 в генах rpoB и katG, соответственно (р=0). У остальных четырех изолятов встречались замены: rpoBHis526Tyr и katGSer315Thr1 – 2 изолята, rpoBLeu511Pro и katGSer315Thr – 1 изолят и rpoBSer531Leu и inhA_G8 – 1 изолят.
По данным литературы, замены rpoBSer531Leu и katGSer315Thr1 также ассоциированы с генотипом Beijing и связаны с устойчивостью к высоким концентрациям препаратов [11, 15, 22, 30].
Интересно отметить, что среди 52 изолятов Beijing, содержащих по 6-7 повторов в локусах MIRU 26 и QUB26, было 45 (86,5%) изолятов с мутациями устойчивости к рифампицину и изониазиду, причем, сочетание замен Ser531Leu и Ser315Thr1 в генах rpoB и katG выявлено у подавляющего большинства последних - 44 (97,8%). Среди 46 изолятов, имеющих отличное от 6-7 число повторов в этих локусах только 11 (23,9%) содержали мутации устойчивости к рифампицину и изониазиду, из них сочетание замен rpoB Ser531Leu и katG Ser315Thr1 выявлено у 8 (72,7%). Таким образом, выявлена зависимость между наличием 6-7 повторов в локусах MIRU26 и QUB26 и наличием мутаций устойчивости к рифампицину и изониазиду в генах rpoB Ser531Leu и katG Ser315Thr1 соответственно (р=0).
Среди изолятов M. tuberculosis группы non-Beijing мутации, ассоциированные с МЛУ, были выявлены у 15 (18,8%) изолятов: LAM - 7 (46,7%) изолятов, Ural - 6 (40%) изолятов, Haarlem и Tur - по 1 (6,7%) изоляту.
Пять изолятов LAM (3 - MIT248 и по одному MIT140 и MITorphan) имели сочетание мутаций katGSer315Thr1, inhA_T15, rpoBAsp516Val. По данным сполиготипирования, 4 изолята (сполиготип SIT252) были отнесены к семейству LAM9 и один изолят (сполиготип SIT496) - к семейству T5_RUS1. По данным культурального метода у этих пяти изолятов наблюдалась одновременная устойчивость ко всем противотуберкулезным препаратам первого ряда. Интересно отметить, что у четырех изолятов этой группы (MIT248, MITorphan), в отличие от всех остальных изолятов, в локусе MIRU10 было по 2 повтора и у одного изолята - 4 повтора. Два изолята LAM содержали только мутации katGSer315Thr1 и inhA_T15, ответственные за возникновение фенотипической резистентности к изониазиду. Таким образом, выявлена ассоциация сполиготипа SIT252 с наличием сочетания мутаций katGSer315Thr1, inhA_T15, rpoBAsp516Val (р=0).
Такое же сочетание мутаций у представителей генетического семейства LAM (сполиготип SIT252), ранее было описано у штаммов, циркулирующих в Псковской области [11] и в г. Санкт-Петербурге [22], мутация rpoBAsp516Val также была характерна для изолятов LAM, SIT252, выделенных в Тульской области [98]. Полученные данные указывают на роль штаммов SIT252 в распространении МЛУ туберкулеза на территории России, в том числе на территории Уральского ФО РФ.
Среди представителей генотипа URAL (семейства H3, по данным сполиготипирования) сочетание мутации в генах rpoB, katG и inhA, ответственных за формирование МЛУ, выявлены у шести (28,6%) изолятов, среди них 2 изолята с ПЦР-профилем SIT262/MIT251 имели сочетания мутаций rpoBLeu511Pro и katGSer315Thr1. По одному изоляту: SIT262/MIT253 - rpoBSer531Leu, katGSer315Thr1, inhA_T15; SIT262/MIT249 - rpoBMet515Ile и katGSer315Thr1; SIT3781/MITorphan -rpoBSer531Leu и katGSer315Thr1; SITorphan/MITorphan - Asp516Val и Ser315Thr2. У пяти (23,8%) изолятов установлены только замены, ответственные за устойчивость к изониазиду. Мутация katGSer315Thr1 обнаружена у изолятов со следующими ПЦР-профилями: SIT262/MIT249; SIT262/MIT250; SIT262/MIT252; SIT762/MIT252, сочетание замен katGSer315Thr1 и inhA_T15 – SIT262/MIT253. По данным MIRU-VNTR типирования, девять из десяти изолятов, обладающих лекарственной чувствительностью содержали по 8 повторов в локусе QUB 26, а семь из них принадлежали к сполиготипу SIT35 (Н3).
Согласно данным Мокроусова И. [136] упоминаний о существовании закономерности между принадлежностью штаммов к генотипу URAL и лекарственной устойчивостью в литературе не встречается. Однако в настоящем исследовании показана зависимость между наличием мутации устойчивости к изониазиду katGSer315Thr1 и принадлежностью к сполиготипу SIT262 генотипа URAL (p=0,013). МЛУ изоляты данной группы характеризует разнообразие мутаций в гене rpoB, ответственных за устойчивость к рифампицину.
Из 14 изолятов, принадлежавших к линии Haarlem, только один имел сочетание мутации устойчивости к рифампицину и изониазиду (rpoBSer531Leu и katGSer315Thr1), ассоциированные с МЛУ. Остальные 13 (92,9%) изолятов не содержали мутаций устойчивости к данным препаратам.
У неклассифицированных изолятов группы Unknown сочетания мутаций устойчивости к рифампицину и изониазиду не выявлено. Четыре изолята (21,1%) несли только мутации устойчивости к изониазиду, причем три из них, содержащие сочетание замен katGSer315hr1 и inhA_T15, имели одинаковые ПЦР-профили (MIT256 / SIT2255). По данным культурального метода эти изоляты помимо изониазида были устойчивыми к стрептомицину.
Результаты определения ЛУ к изониазиду и рифампицину молекулярно-генетическим и культуральным методами совпадали у 89,65% и 91,95% изолятов соответственно. В 5 (2,9%) и 2 (1,2%) случаях мутаций выявлено не было, в то время как культуры M. tuberculosis была фенотипически устойчивы к изониазиду и рифампицину. Расхождение данных может быть связано с наличием у изолятов мутаций устойчивости, которые не определяются тестом «ТБ-Биочип». Мутации в генах rpoB – устойчивость к рифампицину и katG и/или inhA – устойчивость к изониазиду были определены у 13 (6,8%) и 13 (7,5%) изолятов соответственно, при чувствительной культуре. Данный факт можно объяснить отсутствием фенотипического проявления выявленных мутаций.
