Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы 12
1.1. Природа и значение фенотипической и генотипической вариабельности штаммов М. tuberculosis 12
І.І.І. Фенотипическое разнообразие штаммов М. tuberculosis и модели для его изучения 13
1.1.2.Генотипическая вариабельность штаммов М. tuberculosis и методы ее выявления 25
1.2. Филогения M.tuberculosis и наиболее распространенные штаммовые кластеры M.tuberculosis 37
1.3. Заключение 48
Собственные исследования 50
Глава 2. Материалы и методы 50
Глава 3. Полиморфизм штаммов M.tuberculosis W кластера 58
Глава 4. Репликация штаммов M.tuberculosis различных генотипических кластеров в опытах in vitro и ex vivo 63
4.1. Уровень синтеза РНК штаммов M.tuberculosis различных генотипических кластеров in vitro 63
4.2. Уровень синтеза РНК штаммов M.tuberculosis после фагоцитирования макрофагами (ex vivo) 67
Глава 5. Изучение особенностей туберкулезного процесса при заражении мышей штаммами M.tuberculosis разных генотипических кластеров 77
5.1. Заражение в дозе 5x106 КОЕ M.tuberculosis 77
5.1.1. Сроки жизни мышей после инфицирования 77
5.1.2. Динамика потери массы инфицированных животных 80
5.2. Заражение в дозе 4x105 КОЕ М. tuberculosis 83
5.2.1. Сроки жизни мышей после инфицирования 83
5.2.2. Динамика потери массы инфицированных животных 85
5.2.3. Высеваемость M.tuberculosis из легкого мышей 86
5.2.4. Патоморфология экспериментального туберкулеза, вызванного штаммами M.tuberculosis различных генотипических кластеров 88
Обсуждение результатов 122
Выводы 136
Практические рекомендации 137
Список литературы 138
- Фенотипическое разнообразие штаммов М. tuberculosis и модели для его изучения
- Уровень синтеза РНК штаммов M.tuberculosis различных генотипических кластеров in vitro
- Сроки жизни мышей после инфицирования
- Патоморфология экспериментального туберкулеза, вызванного штаммами M.tuberculosis различных генотипических кластеров
Введение к работе
Актуальность проблемы
Туберкулез по-прежнему остается одной из актуальных проблем здравоохранения во всем мире. По данным ВОЗ, глобальная среднегодовая смертность, обусловленная туберкулезом, составляет около 2 млн. случаев. Россия входит в число стран с высоким уровнем заболеваемости (85,4 на 100 тысяч населения - 2004 г.) и смертности (21,4 на 100 тысяч населения — 2004 г.) по туберкулезу. Сложные социально-экономические условия жизни населения, миграция, увеличение числа штаммов, устойчивых к противотуберкулезным препаратам, являются одними из основных причин напряженной эпидемической ситуации в России [16, 26]. Следует отметить, что после 1999 года темпы роста основных эпидемиологических показателей снизились, по сравнению с 1991-1995 гг. Однако тенденция к продолжению накопления резервуара инфекции остается и по настоящее время [27]. Особо настораживает увеличение распространенности случаев заболевания с первичной лекарственной устойчивостью [3, 7, 22].
Для улучшения мероприятий по контролю и предотвращению туберкулеза необходимо идентифицировать клинически важные штаммы, характеризующиеся повышенной трансмиссивностью или вызывающие тяжелое течение болезни.
Благодаря внедрению в область эпидемиологии туберкулеза молекулярных подходов и разнообразию применяемых методов типирования, стало возможным проследить пути распространения определенных штаммов, оценить недавнюю передачу возбудителя, определить факторы риска для заболеваемости, отличить эндогенную реактивацию от экзогенной реинфекции, а также кластеризовать циркулирующие в популяции штаммы [43, 59, 66, 197, 198, 207, 223, 226].
Было показано, что штаммовые полиморфизмы, полученные с разными маркерами, тесно связаны между собой, что свидетельствует о
7 том, что вид M.tuberciilosis имеет строго клональную популяционную структуру и, с учетом того, что геном M.tuberciilosis крайне консервативен, считается, что свойства штамма передаются без значительных изменений [200]. Поэтому представляется важной характеристика фенотипических свойств штаммов, составляющих генотипический кластер, которые, возможно, влияют на особенности распространения данной группы штаммов.
Известно, что при контакте человека с возбудителем исходы туберкулеза существенно варьируют: из 95% инфицированных только у 10% развивается болезнь; среди заболевших существуют различия» по длительности болезни, тяжести течения и по локализации поражения. На данный момент больше изучено влияние факторов окружающей среды и факторов организма хозяина, которые вносят несомненный вклад в клиническое и эпидемиологическое поведение штаммов v М. tuberculosis. Это было показано иммунологическими исследованиями человеческой популяции и убедительно доказано экспериментальными работами на инбредных мышах чувствительных (I/St) и резистентных (A/Sn) к туберкулезу линий [41, 80, 121, 132, 163, 166, 179]. В экспериментах при заражении МФ было подтверждено влияние генотипа хозяина на рост M.tuberculosis в МФ. При этом было показано, что микобактерии, в свою очередь, оказывают цитопатогенное действие на МФ. Однако в этих работах были использованы микобактерии только вирулентного лабораторного штамма M.tuberculosis H37Rv [143].
В настоящее время существуют лишь единичные работы, описывающие влияние возбудителя на особенности течения туберкулезного процесса, и в основном эти работы касаются штаммов1 с лекарственной устойчивостью без связи с определенным генотипическим кластером. Этими исследованиями было показано, что штаммы M.tuberculosis обладают разной способностью вызывать заболевание и влиять на тяжесть его течения. Накопление данных об особенностях
8 генотипов и фенотипическом; разнообразии штаммов М. tuberculosis сделало актуальной проблему определения биологических свойств возбудителя в связи с его принадлежностью к генотипическому кластеру. Доказательства этого могут быть получены в экспериментах in vivo при заражении лабораторных животных и в наиболее приближенной к in vivo модели с заражением МФ микобактериями туберкулеза.
Наибольший интерес в последнее время вызывают штаммы M.tuberculosis W кластера, которые широко распространены во всем мире и, попадая в человеческую популяцию, способны.быстро распространяться^ [34,47,51, 177].
Генотипирование более 1000' штаммов микобактерий туберкулеза, выделенных от больных из России, проведенное ЦНИИТ РАМН совместно
г-
с PHRI ТВС в 1998-2003 г.г., показало широкое разнообразие генотипических вариантов M:tuberculosis. Типированием по ПДРФ IS6110 было выявлено 42 штаммовых группы. Были определены преобладающие кластеры М. tuberculosis, в? том числе и W (до 40-50%) и описана группа M.tuberculosis, названная AI, штаммы которой до 2000 г. циркулировали только на территории России (название кластеров приведены, по номенклатуре PHRI ТВС). Кроме того, было выявлено 20% штаммов, с уникальным, ранее не встречавшимся, генотипом [130]. Изучение лекарственной чувствительности М. tuberculosis различных генотипических кластеров показало, что устойчивость штаммов к основным противотуберкулезным препаратам не зависит от генотипа по IS6110. Однако почти 70% штаммов W кластера были устойчивы одновременно к рифампицину и изониазиду (МЛУ) [94].
Нашими работами было также продемонстрировано широкое распространение (до 70%) микобактерий этого кластера в тюрьмах [24; 25]. Факторы, способствующие успешному распространению? штаммов; W кластера, все еще не известны.
Целью исследования являлось изучение генетического полиморфизма и биологических свойств штаммов M.tuberculosis W кластера в условиях in vitro, ex vivo и in vivo.
Задачи исследования
1. Исследование генетического полиморфизма штаммов
M.tuberculosis W кластера по маркеру IS6J10.
Изучение репликации in vitro штаммов M.tuberculosis W кластера по сравнению с клиническими штаммами M.tuberculosis, относящимися к другим генотипическим кластерам по ПДРФ IS6I10.
Определение роста ex vivo в перитонеальных макрофагах (МФ) мыши клинических штаммов M.tuberculosis разных генотипических кластеров.
Изучение влияния генотипа штаммов M.tuberculosis на время жизни и динамику потери массы при заражении мышей 5x106 КОЕ.
Характеристика экспериментального туберкулеза при заражении 4х105 КОЕ M.tuberculosis кластеров W, AI, HD.
Научная новизна
Впервые на ex vivo модели было проведено сравнительное изучение роста в МФ клинических штаммов M.tuberculosis, генотипированных и кластеризованных по специфическому маркеру IS6110. Использование метода включения 5,6-[ Н]-урацила в жизнеспособные M.tuberculosis позволило количественно оценить, статистически обработать полученные данные и определить достоверность отличий разных кластеров M.tuberculosis по исследованным показателям.
Сопоставление роста in vitro и ex vivo каждого штамма M.tuberculosis способствовало оценке выживаемости популяции M.tuberculosis разных кластеров в клетках хозяина (МФ). С помощью впервые изученной зависимости роста в МФ от величины бактериальной нагрузки на МФ было выделено две группы штаммов, взаимодействие с МФ которых зависело и не зависело от величины бактериальной нагрузки.
Сравнительная характеристика туберкулезного процесса, вызванного несколькими штаммами M.tuberculosis W кластера и группой штаммов других генотипических кластеров, позволила выявить разнообразие штаммов W кластера по биологическим свойствам и впервые опровергнуть мнение о гипервирулентности W штаммов M.tuberculosis.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Выявлен генетический полиморфизм внутри W кластера
M.tuberculosis с преобладанием в России штаммового варианта W148.
2. При культивировании на питательной среде штаммы
M.tuberculosis W кластера имели скорость репликации, сравнимую с рядом
штаммов, принадлежащих к другим генотипическим кластерам.
3. Фагоцитированные макрофагами штаммы M.tuberculosis W
кластера обладали большей жизнеспособностью по сравнению с
M.tuberculosis других генотипических кластеров.
4. В модели экспериментального туберкулеза у мышей штаммы
M.tuberculosis W кластера обладали разной вирулентностью, но не
являлись высоко вирулентными по сравнению с другими штаммами
M.tuberculosis.
Научно-практическая значимость
1. Охарактеризованы модели для оценки вирулентности и
приспособляемости штаммов M.tuberculosis для выживания в клетках
хозяина.
Повышенная способность штаммов W кластера приспосабливаться к внутриклеточному росту в МФ позволит использовать штаммы этого кластера в модели изучения взаимодействия патоген - хозяин.
Штамм M.tuberculosis, вызывающий казеозную пневмонию при заражении мышей, может быть использован в модельных исследованиях остро прогрессирующего туберкулеза.
Апробация диссертационной работы.
Работа апробирована на совместном заседании отделов микробиологии и иммунологии ГУ ЦНИИТ РАМН (06.03.2007 г.). Материалы диссертации доложены на I Национальном конгрессе «Клинической иммунологии, аллергологии и иммунореабилитации» (Алмааты, 1999), на 9 национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1999), на научной сессии, посвященной 85-летию ЦНИИТ РАМН "Актуальные проблемы туберкулеза и болезней легких", (Москва, 2006), на конференциях молодых ученых, посвященных Всемирному дню борьбы с туберкулезом (Москва, 2001, 2003, 2005), на заседаниях секции микробиологии и иммунологии туберкулеза Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2001, 2003, 2004, 2006).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 5 в рецензионных изданиях, рекомендованных ВАК России.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 169 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 27 отечественных и 209 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 20 таблицами и 34 рисунками.
Фенотипическое разнообразие штаммов М. tuberculosis и модели для его изучения
Инфекционный процесс является следствием взаимодействия между иммунной системой организма хозяина и способностью микроорганизма противостоять защите хозяина и воспроизводиться в нем. Все болезнетворные микроорганизмы характеризуются патогенностью -признаком, отражающим потенциальную возможность возбудителя проникать в макроорганизм (инфективность), размножаться в нем (инвазивность) и вызывать комплекс патологических процессов, возникающих при заболевании [6]. Мерой патогенности, присущей определенному штамму возбудителя, является вирулентность [9]. В зависимости от вирулентности возбудителя инфекционный процесс может иметь различные проявления - от бессимптомного носительства до тяжелейших форм инфекционного заболевания с летальным исходом [6].
В последнее время в зарубежной литературе для характеристики взаимодействия патогена и хозяина используется термин фитнес (от англ. to fit — приспосабливаться). Фитнес, или приспособляемость, подразумевает способность микроорганизма выживать, реплицироваться и диссеминировать в макроорганизме и описывает приспособляемость различных бактериальных штаммов для переживания ответа хозяина в процессе инфекции [148]. Фитнес может включать специфические ростовые свойства микроорганизма в его природном хозяине (например, рост M.tuberculosis в макрофагах человека), бактериальную нагрузку (число бактерий, обнаруживаемое в инфицированном макроорганизме после заражения), устойчивость к стрессовым воздействиям (например, недостатке питательных веществ, гипоксии) и трансмиссивность [148, 209, 211, 218, 236]. До сих пор не существует точного ответа на вопрос, что делает M.tuberculosis вирулентными, несмотря на данные, полученные за последние более 100 лет. M.tuberculosis не имеет классических факторов вирулентности, подобных тем, которые являются главной причиной болезней, вызванных другими бактериальными патогенами, например, токсинами, продуцируемыми Corynebacterium diphtheriae, Escherichia coli 0157:H7, Shigella dysenteriae и Vibrio cholerae [196]. Для поиска гена, ответственного за те или иные биологические свойства M.tuberculosis, важные при взаимодействии с макроорганизмом, часто используют полученные в лабораторных условиях мутантные штаммы M.tuberculosis с инактивированным геном-кандидатом и изучают эффект этих модификаций на течение экспериментального туберкулеза по сравнению с процессом, вызванным M.tuberculosis дикого типа.
Первые исследования по изучению и сравнению биологических свойств клинических штаммов M.tuberculosis in vitro датируются концом 50-х годов XX века, когда RJ. Dubos описал различия штаммов по способности выживать в атмосфере недостатка кислорода или его избытка, и сделал вывод, что существует широкий спектр фенотипов M.tuberculosis [96]. В другом исследовании было показано, что некоторые штаммы M.tuberculosis in vitro имели повышенную чувствительность к перекиси водорода [155].
При изучении ростовых характеристик ЛУ и не ЛУ штаммов методом радиометрии на жидких средах (в системе ВАСТЕС) также был показан широкий диапазон фенотипических свойств штаммов M.tuberculosis, но не было выявлено понижения или повышения скорости роста у ЛУ штаммов [12, 21, 212]. O.J. Billington с соавторами изучали in vitro фитнес клинических штаммов со спонтанными мутациями в гене гроВ, ответственном за формирование устойчивости к рифампицину, и сравнивали его с фитнесом штаммов M.tuberculosis дикого типа. Для части мутантных штаммов ими было показано снижение фитнеса, в то время как другие штаммы с мутациями в гене гроВ были подобны штаммам дикого типа [52].
Основным недостатком модели in vitro является то, что эта модель не отражает поведение M.tuberculosis в макроорганизме, а поскольку M.tuberculosis - облигатные паразиты, которые не размножаются1 вне хозяина в окружающей среде, то для получения адекватных результатов, характеризующих биологические свойства M.tuberculosis, применяются модели ex vivo и in vivo.
Как известно, M.tuberculosis является внутриклеточным патогеном и инфицирует первоначально макрофаги, что позволяет использовать фагоцитирующие клетки для изучения свойств штаммов M.tuberculosis. Исследования ex vivo служат моделью для ранних стадий инфекции, которые включают фагоцитоз M.tuberculosis макрофагами в альвеолах легкого. Для исследования чаще всего применяются макрофаги мыши и человека.
Первичные макрофаги мыши выделяют непосредственно из костного мозга, легочных альвеол или бронхиального смыва и из перитонеального экссудата. Первичные макрофаги являются естественными (не иммортализованными) и более показательны для реальной ситуации in vivo, но их обычно труднее получать. Существует много мышиных макрофагальных клеточных линий, наиболее широко используются линии J774 и MH-S. Последняя является иммортализованной линией; альвеолярных МФ, свойства которой очень похожи на свойства первичных мышиных альвеолярных МФ [154]. Преимуществом мышиных МФ является то, что мыши широко используются при изучении туберкулеза. Кроме того, использование первичных клеточных линий позволяет получать макрофаги от животных с определенными мутациями для того, чтобы протестировать влияние специфических факторов хозяина на взаимодействие с M.tuberculosis на уровне МФ [100].
Преимуществом исследования человеческих МФ является то, что на них можно изучать ранние стадии болезни человека: МФ человека; используемые для этих экспериментов, могут быть первичной культурой, получаемой или из моноцитов периферической крови, которым дают возможность дифференцироваться в МФ, или из бронхоальвеолярного смыва (альвеолярные МФ). Также часто используются трансформированные моноцитарные клеточные линии, типа ТНР-1, которые могут дифференцироваться в макрофаго-подобные фагоцитирующие клетки добавлением форболового эфира, и иммортализованные моноцитарные клеточные линии типа U937 [216, 228]. Было показано, что по ответу на заражение M.tuberculosis дифференцированные ТНР-1 макрофаги похожи на человеческие МФ, полученные из моноцитов крови [204].
Контролировать биологические свойства M.tuberculosis можно по их росту в МФ и по цитотоксической активности.
Изучение роста M.tuberculosis в МФ можно проводить путем посева лизированной макрофагальной культуры, зараженной M.tuberculosis, на плотную питательную среду с последующим подсчетом КОЕ M.tuberculosis, а также по оценке включения 5,6-[ Н]-урацила M.tuberculosis в процессе синтеза РНК. Последний метод показал высокое совпадение с результатами посева (коэф. корреляции 0,9),.что позволяет использовать этот современный метод для оценки роста M.tuberculosis в: МФ [143].
Изучение в модели ex vivo двух оппозитных лабораторных штаммов H37Rv и H37Ra, показало, что H37Rv превосходит H37Ra по скорости-роста внутри макрофагов, по скорости удваивания в моноцитах человеческой крови (36 часов для H37R.V, 247 часов для H37Ra) и по
продукции ФНО-а инфицированными моноцитами [39, 150, 194].
В рамках интереса к изучению свойств клинических штаммов M.tuberculosis, Е. Janulionis с соавторами проводили работы по сравнению репликации клинических штаммов и 5 лабораторных штаммов в культуре клеток цельной крови человека. Была показана существенная изменчивость в способности клинических штаммов реплицироваться» в клетках хозяина, причем ряд штаммов рос в культуре клеток быстрее, а ряд медленнее, чем контрольный вирулентный штамм H37Rv; аттенуированный лабораторный штамм H37Ra показал наименьшую способность к репликации в клетках хозяина, по сравнению со всеми тестированными штаммами [123].
Изучение жизнеспособности в МФ штаммов M.tuberculosis, устойчивых к рифампицину, показало снижение скорости роста в макрофагах у мутантных штаммов по сравнению с чувствительными штаммами [146].
Уровень синтеза РНК штаммов M.tuberculosis различных генотипических кластеров in vitro
Определение уровня включения 5,6-[3Н]-урацила M.tuberculosis через 90 часов инкубации показало, что он существенно различался у штаммов, относящихся к разным генетическим кластерам. При исходном числе M.tuberculosis 12,5-104 КОЕ он колебался от 1703,7 до 11889,7 имп/мин, при 25-Ю4 КОЕ - от 3054,3 до 19685 имп/мин и при 50-Ю4 КОЕ -от 4658 до 31827,7 имп/мин в зависимости от штамма (табл. 3).
64 Определение достоверности различий с использованием коэффициента Стьюдента между уровнем включения 5,6-[3Н]-урацила для разных штаммов позволило разделить штаммы на две группы — 1-ю (до 13400 имп/мин) и П-ю (от 16000 имп/мин). Формирование группы осуществлялось по принципу: члены одной группы имеют близкие по величине значения уровня включения 5,6-[3Н]-урацила, как правило, без достоверных отличий, при этом обязательно достоверно отличаются от членов другой группы (Р 0,05). Интервалы уровня включения 5,6-[ Н]-урацила для каждой группы штаммов при разном исходном числе внесенных в лунку M.tuberculosis представлены в таблице 4.
Как видно из рисунков, при всех исходных числах КОЕ M.tuberculosis прослеживалась следующая тенденция: штаммы M.tuberculosis W кластера, штамм HD кластера, все 3 штамма KQ кластера, характеризовались более низким уровнем синтеза РНК. К этой же группе были отнесены контрольные штаммы H37Rv и H37Ra. Штаммы AI кластера и некластеризованные штаммы характеризовались более высоким уровнем синтеза РНК.
Таким образом, штаммы при равном исходном числе КОЕ через 90 часов культивирования in vitro, отличались по уровню синтеза РНК, который отражал скорость размножения M.tuberculosis. Для определения роста M.tuberciuosis в МФ {ex vivo) измеряли уровень включения 5,6-[ Н]-урацила в M.tuberciuosis, внесенные в культуру перитонеальных МФ мыши в соотношении МБТ: МФ 2,5:1; 5:1 и 10:1, что соответствовало 12,5-Ю4 КОЕ, 25-Ю4 КОЕ и 50-Ю4 КОЕ M.tuberculosis.
Измерение включения 5,6-[ Н]-урацила через 90 часов инкубации показало снижение уровня синтеза РНК для всех штаммов, по сравнению с M.tuberculosis, инкубированными тот же период времени без МФ {in vitro). Уровень включения 5,6-[ Н]-урацила существенно различался между штаммами и колебался при соотношении МБТ:МФ 2,5:1 - от 152,0 до 2176,3 имп/мин, для 5:1 - от 299,0 до 3450,0 имп/мин и для 10:1 - от 511,7 до 6110,7 имп/мин (табл. 5).
На основании определения достоверности различий по принципу, описанному выше, все штаммы были разделены на 4 группы - с низким (I), средним (II), высоким (III) и очень высоким (IV) уровнем синтеза РНК.
Интервалы уровня включения 5,6-[ Н]-урацила для каждой группы штаммов при разном соотношении МБТ:МФ представлены в таблице 6.
При внесении М. tuberculosis в соотношении 2,5 КОЕ на МФ в 1-ю группу вошли штамм HD кластера, все три штамма KQ кластера и H37Ra. Во П-ю группу вошли два штамма AI кластера (R427 и R429) и два некластеризованных штамма (R807 и R275). В Ш-ю группу - с высоким уровнем синтеза РНК - вошли 5 штаммов W кластера (R535, R123, R270, R882, R284), 1 штамм AI кластера (R33), один некластеризованный штамм (R807) и H37Rv. В IV-ю группу вошли 3 штамма М. tuberculosis W кластера (R806, R64 и R101) (рис. 6).
. Уровень включения 5,6-[ Н]-урацила в М.tuberculosis через 90 часов культивирования в МФ при соотношении МБТ:МФ 2,5:1
При соотношении 5 КОЕ М. tuberculosis на МФ существенного изменения в составе групп не произошло по сравнению с предыдущим соотношением: штамм HD кластера, при меньшей бактериальной нагрузке входивший в 1-ю группу, вошел во П-ю группу. Состав Ш-ей и IV-ой групп не изменился по сравнению с предыдущим соотношением (рис. 7).
Сроки жизни мышей после инфицирования
По результатам исследования in vitro для исследования in vivo были отобраны следующие штаммы M.tuberculosis: W кластера - R806, R64, R284, R535, R270, R882, R101, AI кластера - R33, R427, HD кластера -R120, KQ кластера - R125, кластеризованные - R807, R504, лабораторные - H37Rv, H37Ra.
Изучение туберкулезного процесса проводили на мышах инбредной линии С57В1/6 на 2-х моделях с внутривенным заражением высокой летальной дозой M.tuberculosis (5x106 КОЕ) и более низкой дозой M.tuberculosis (4x105 КОЕ). В эксперименте использовали самцов в возрасте 3-4 месяцев.
Оценку туберкулезного процесса проводили по выживаемости и по изменению массы тела животных.
Анализ срока жизни мышей, зараженных летальной дозой штаммов M.tuberculosis, принадлежащих к разным генотипическим кластерам, выраженный как среднее время жизни группы из 10 мышей, представлен в табл. 8.
Как видно из таблицы, среднее время жизни (СВЖ) мышей,
зараженных клиническими штаммами и лабораторным вирулентным штаммом H37Rv, колебалось от 28 до 76 дней. Мыши, зараженные аттенуированным лабораторным штаммом H37Ra, не погибли на протяжении всего срока эксперимента (100 дней).
Анализ достоверности различий среднего срока жизни мышей, зараженных вирулентными штаммами, позволил выделить 5 групп штаммов, вызывающих гибель мышей в достоверно разные сроки (р 0,01) (табл. 9). Штамм H37Ra, не приведший к гибели животных, был отнесен к 6 группе. Как видно из таблицы, в 1-ю группу вошли штаммы, инфицирование которыми приводило к наименьшему сроку жизни мышей (27-29 дней), что позволяет их отнести к группе наиболее вирулентных штаммов.
Мыши, зараженные контрольным лабораторным штаммом H37Rv, входили в 3-ю группу (45-50 дней). По сравнению со штаммом H37Rv выявлялись как более вирулентные, так и менее вирулентные штаммы, а также штаммы, вирулентность которых была сравнима с H37Rv.
Мыши, зараженные штаммами W кластера, различались по срокам жизни после заражения, СВЖ для них составляло 39-60 дней (штаммы вошли во 2-4-ю группы). Два штамма W кластера - R64 и R806, имели меньшую вирулентность, чем контрольный вирулентный штамм H37Rv, и СВЖ зараженных ими мышей составило 55-60 дней. Два штамма - R535 и R882 входили в ту же группу, что и H37Rv, а СВЖ зараженных мышей было 46 и 48 дней соответственно. Два штамма этого кластера - R101 и R270 обладали большей вирулентностью, чем H37Rv, и СВЖ зараженных ими мышей составило 39 дней.
Оба штамма AI кластера вошли во 2-ю группу с СВЖ мышей 40 дней, то есть были более вирулентными, чем H37Rv.
Штамм R120, принадлежащий к HD кластеру, и некластеризованный штамм R807 вошли в 1-ю группу со СВЖ мышей 28 дней. Еще один некластеризованный штамм - 504 - вошел во 2-ю группу со СВЖ мышей 37 дней.
Наибольший срок жизни (СВЖ 76 дней) наблюдался у мышей, зараженных штаммом R125, принадлежавшем к KQ кластеру, что свидетельствовало о низкой вирулентности штамма, который был отнесен к 5-ой группе.
Еще один важный показатель тяжести течения туберкулезной инфекции - это скорость потери массы тела, отражающий кахексию инфицированных животных.
После заражения исследуемыми штаммами у мышей было замечено 3 тенденции изменения массы: 1) снижение массы сразу после заражения; 2) первоначальный подъем массы с выходом на плато и развитием кахексии в терминальной фазе процесса и 3) повышение массы с выходом на плато до конца наблюдения (рис. 12).
Первый тип изменения массы - потеря веса сразу после заражения -был характерен для мышей, зараженных штаммами M.tuberculosis, принадлежащими к кластерам W, AI, HD, некластеризованными штаммами и лабораторным вирулентным штаммом H37Rv. Скорость снижения массы тела за 10 дней у них колебалась от 4,2 до 11%, а процент потери веса ко дню гибели составил 23,7-31,9% (табл. 10). Второй тип изменения массы был характерен для мышей, зараженных штаммом кластера KQ. У мышей, зараженных этим штаммом, масса увеличивалась до 20 дня после заражения, набранный вес держался на том же уровне до 50 дня, после чего масса неуклонно снижалась вплоть до дня гибели. При этом увеличение массы шло со скоростью приблизительно 5%, а снижение - 13,1% в 10-дневный период. Тяжесть кахексии ко дню гибели была сравнима с таковой у описанных выше животных, и потеря массы составила 33,3%.
По третьему типу масса изменялась у мышей, зараженных аттенуированным штаммом H37Ra и у интактных мышей. Они набирали массу до 30 дня, со скоростью 4,7-5,6% за 10 дней, после чего масса держалась на том же уровне до последнего дня наблюдения
Патоморфология экспериментального туберкулеза, вызванного штаммами M.tuberculosis различных генотипических кластеров
Вирулентность штаммов разных генотипических кластеров M.tuberculosis оценивали и по патоморфологии легкого мышей, подвергнутых эвтаназии на 30 и 41 день после заражения. Особенности патоморфологии паренхиматозных органов зараженных мышей оценивали макроскопически, осматривая с помощью лупы (х16) ультратонкие срезы органов, и микроскопически при увеличении хЮО и х400 через 30 (1 месяц) и 41 день (1,5 месяца) после заражения.
Тканевые реакции у мышей при заражении лабораторными штаммами M.tuberculosis H37Ra и H37Rv
После заражения штаммом H37Ra - через 1 месяц в легких были отмечены единичные продуктивные бугорки. Бугорки состояли из эпителиоидно-макрофагальных элементов, расположенных в центре гранулем, и лимфоидно-гистиоцитарных клеток, образующих вал в наружных зонах гранулемы. Окружающая легочная ткань оставалась воздушной, в стенках альвеол наблюдалась умеренная диффузная лимфоидно-гистиоцитарная реакция (рис. 14, 15).
Через 1,5 месяца бугорки в легких рассасывались, формировались лимфоидно-гистиоцитарные узелки крыловидной формы, расположенные чаще в кортикальной зоне легких. В плевре и межальвеолярных перегородках сохранялась очаговая и диффузная лимфоидно-гистиоцитарная пролиферация. В стенках мелких сосудов имела место умеренная лимфоидная и гистиоцитарная реакция (рис. 16).
При заражении штаммом H37R.V через 1 месяц в легких наблюдались множественные сливные экссудативные бугорки, образующие очаги пневмонии. В бугорках преобладала лимфоидно-плазмоцитарная реакция; в центре бугорков наблюдались единичные эпителиоидные и макрофагальные элементы с некробиозом; имелись микроциркуляторные нарушения. Вокруг фокусов, в стенках альвеол и плевре наблюдалась выраженная лимфоидно-плазмоцитарная инфильтрация (рис. 17).
К 1,5 месяцам количество и диаметр очагов пневмонии увеличивалось; они чаще имели подплевральную локализацию. В глубине фокусов усиливался некробиоз и диффузная и очаговая лимфоидно-плазмоцитарная реакция в плевре, подплевральных зонах и стенках альвеол. Возникали очаговая лимфостатическая пневмония и микроциркуляторные нарушения, стаз (рис. 18).
Штамм H37Ra имел низкую вирулентность, при которой к первому месяцу развивался ограниченный туберкулез, характеризующийся единичными продуктивными бугорками в легких (3 балла). К 1,5 месяцам наблюдалась картина регрессии, бугорки в легких рассасывались, сохранялась параспецифическая реакция (0 баллов).
Штамм H37Rv обладал выраженной вирулентностью, и в легких мышей наблюдался прогрессирующий туберкулез (8 баллов через 1 месяц и 11 баллов через 1,5 месяца) с формированием к 1,5 месяцам крупных экссудативных и экссудативно-альтеративных очагов.
Тканевые реакции при заражении M.tuberculosis W кластера
Для оценки тканевых реакций мышей, зараженных M.tuberculosis W кластера, использовали штаммы R64 и R101.
Патоморфологический анализ показал, что через 1 месяц после заражения штаммом R64 в легких формировались множественные сливные экссудативные бугорки, состоящие из эпителиоидных и макрофагальных элементов - в центре, лимфоцитов, мононуклеарных макрофагов - в периферической зоне бугорков. Сливаясь, гранулемы формировали очаги туберкулезной пневмонии. Вокруг очагов выражен отек, перифокальная десквамативная пневмония, микроциркуляторные нарушения (рис. 19, 20).
К 1,5 месяцам крупные очаги пневмонии не выявлялись, эпителиоидные и макрофагальные элементы не наблюдались. В гематогенных бугорках, сохраняющих плевро-кортикальную локализацию, преобладала лимфоидно-плазмоцитарная реакция. Бугорки были более изолированными, в перифокальной зоне преобладали лимфоидно-гистиоцитарная реакция, стаз (рис. 21). Это говорит о неполной регрессии туберкулезного воспаления в легких и об усилении параспецифической лимфоидно-плазмоцитарной и лимфоидно-гистиоцитарной реакции.
При заражении штаммом R101 в легких через 1 месяц-формировались более крупные, по сравнению с R64 в тот же срок, фокусы пневмонии. Просветы и стенки альвеол были заполнены эпителиоидными и макрофагальными клетками, наблюдался некробиоз в глубине очагов. Усиливались лимфоидно-плазмоцитарная реакция, микроциркуляторные нарушения, стаз (рис. 22, 23). Все это свидетельствует о более остром и токсическом туберкулезном процессе в легких, чем при заражении R64.
К 1,5 месяцам крупные экссудативные очаги в легких сохранялись. Сливаясь, они образовывали более крупные фокусы туберкулезной пневмонии, состоящие из эпителиоидных, макрофагальных и лимфоидно-гистиоцитарных элементов. В глубине очагов имел место некробиоз, усиливались лимфоидно-гистиоцитарная реакция, васкулит и микроциркуляторные нарушения (рис. 24). Легочная ткань становилась более воздушной, в стенках альвеол лимфоидно-гистиоцитарная реакция уменьшалась, по сравнению с 1 месяцем.
