Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Бактерии-продуценты нитрилгидратазы 13
1.1. Пути метаболизма нитрилов карбоновых кислот у бактерий 13
1.2. Бактерии, утилизирующие нитрилы карбоновых кислот 14
1.3. Классификация и характеристика нитрилгидратаз 18
1.4. Механизм нитрилгидратазной реакции 22
1.5. Биохимическая регуляция активности нитрилгидратаз 25
1.6. Механизмы генетической организации и регуляции синтеза нитрилгидратаз 30
1.7. Перспективы использования штаммов-продуцентов нитрилгидратазы 33
Глава 2. Объекты и методы исследования 38
2.1. Бактериальные штаммы 38
2.2. Среды и субстраты 38
2.3. Селекция штаммов-продуцентов нитрилгидратазы 39
2.4. Методы таксономического анализа 41
2.5. Условия культивирования бактерий и определение ростовых характеристик 42
2.6. Определение активности ферментов метаболизма нитрилов карбоновых кислот, субстратов и продуктов биотрансформации 44
2.7. Методы энзиматического анализа 49
2.8. Выделение ДНК и полимеразная цепная реакция 50
2.9. Статистическая обработка 53
Глава 3. Выделение и характеристика. штаммов - продуцентов нитрилгидратазы 54
3.1. Выделение культур, утилизирующих нитрилы карбоновых кислот 54
3.2. Идентификация штаммов-продуцентов нитрилгидратазы 55
3.3 Выделение ДНК и ПЦР-амплификация генов нитрилгидратаз 60
Глава 4. Исследование влияния факторов среды на рост и нитрилгидратазнуго активность штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl 63
4.1. Зависимость нитрилгидратазной активности клеток от фазы роста культуры 63
4.2. Нитрилы и амиды как ростовые субстраты 64
4.3. Оценка токсичности нитрилов и амидов 67
4.4. Утилизация ацетонитрила 68
4.5. Зависимость роста клеток и нитрилгидратазной активности от концентрации ацетонитрила 71
4.6. Индукция ферментов нитрилами и амидами 74
4.7. Влияние источника углерода на рост и нитрилгидратазную активность бактерий 77
4.8. Влияние источника азота на рост и нитрилгидратазную активность бактерий 81
4.9. Влияние ионов металлов на рост и нитрилгидратазную активность бактерий S5
Глава 5. Характеристика нитрилгидратаз штаммов Д. erythropolis и R ruber gtl 87
5.1. Субстратная специфичность нитрилгидратаз 87
5.2. Влияние температуры на активность нитрилгидратаз 89
5.3. Влияние рН среды на активность нитрилгидратаз 89
5.4. Действие ряда ингибиторов на активность нитрилгидратаз 90
5.5. Конверсия акрилонитрила биомассой R. ruber gtl 93
Заключение 95
Выводы 103
Список литературы
- Бактерии, утилизирующие нитрилы карбоновых кислот
- Условия культивирования бактерий и определение ростовых характеристик
- Идентификация штаммов-продуцентов нитрилгидратазы
- Зависимость роста клеток и нитрилгидратазной активности от концентрации ацетонитрила
Введение к работе
В настоящее время во многих отраслях народного хозяйства, а также для очистки питьевой воды и промышленных стоков широко используют полимеры и сополимеры акриламида. Мировая потребность в этих продуктах удовлетворена не полностью и ежегодно увеличивается на 4-5 %. В отличие от традиционных способов каталитической конверсии акрилонитрила в акриламид на неорганических катализаторах, биокаталитический способ производства акриламида имеет ряд важных в экономическом и экологическом отношении преимуществ: высокую специфичность и селективность, одностадийность, малую энергоемкость, отсутствие побочных продуктов синтеза, технологических стоков и вредных отходов. В настоящее время широко внедряется метод промышленного производства акриламида с использованием биокатализаторов на основе биомассы штаммов-продуцентов фермента нитрилгидратазы Rhodococcus rhodochrous Л и ряда других бактерий [127]. Это первый успешный опыт применения биокатализа в области крупнотоннажного химического синтеза. Расширение исследований бактерий, метаболизирующих нитрилы, обусловлено необходимостью улучшения способа производства акриламида, а также перспективой применения микроорганизмов для получения ряда других коммерчески значимых соединений [7, 22, 117].
Несмотря на значительные успехи в области селекции продуцентов ферментов, потребность промышленности в новых штаммах непрерывно возрастает. Большое значение в последнее время приобретает также возможность использования микроорганизмов в процессах биоремедиации почв и сточных вод, загрязненных нитрилами [10, 16, 114].
Таким образом, актуальными задачами микробиологии, имеющими фундаментальное и практическое значение, являются выделение из природных сообществ и селекция новых штаммов, конвертирующих нитрилы карбоновых кислот, исследование процессов конверсии нитрилов, биохимической и генетической регуляции метаболизма этих соединений [139].
Состояние вопроса. Изучение биотрансформации нитрилов началось с исследования растительных ферментов [146, 149, 157]. Впоследствии было установлено, что способность утилизировать нитрилы широко распространена и среди микроорганизмов [39, 74].
Известно, что бактерии утилизируют нитрилы посредством двух основных альтернативных путей метаболизма: нитрилазного и нитрилгидратазно-амидазного [29, 30, 90].
Нитрилгидратазно-амидазная система обнаружена у ряда почвенных бактерий рода Rhodococcus, в частности, у Rhodococcus sp. R312 [126], Rhodococcus rhodochrousN-771 [137], Л [87, 130], R. rhodochrous M8 [6], a также у представителей родов Agrobacterium, Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Nocardia, Rhizobium [27, 51, 93, 95, 124, 134]. Штаммы-суперпродуценты нитрилгидратазы P. chlororophis B23, Rhodococcus sp. R312, R, rhodochrous N-774, Ли M8 нашли применение в биотехнологии синтеза акриламида [3, 86, 89]. Однако, несмотря на значительные успехи в области селекции продуцентов ферментов, потребность промышленности в новых штаммах непрерывно возрастает.
Долгое время считалось, что ароматические нитрилы конвертируются преимущественно посредством фермента нитрилазы [32, 49, 67]. В настоящее время известны нитрилгидратазы, катализирующие гидролиз как алифатических, так и ароматических нитрилов [8, 24, 92, 115,154].
В настоящее время у микроорганизмов идентифицировано два типа нитрилгидратаз, различающихся простетическими группами (ионы железа или кобальта). Железосодержащие нитрилгидратазы встречаются чаще и были описаны первыми [34,60,124,126,144,155,170]. Ионы кобальта обнаружены в активных центрах нитрилгидратаз штаммов R, rhodochrous Л [130], M8 [174], Pseudomonas putida B5 [143] и Bacillus smithii SC-J05-1 [154].
До недавнего времени в литературе были описаны только нитрилгидратазы мезофильных бактерий. R.A. Cramp и R.A. Pereira выделили несколько умеренно термофильных видов Bacillus, имеющих двухступенчатую ферментативную систему метаболизма нитрилов [51, 144].
Нитрилгидратазы различных видов бактерий выделены и исследованы [27, 41, 50, 60, 73, 92]. Показано, что активные формы этих ферментов состоят из 2 неидентичных субъединиц: аир, соединенных в эквимолярном соотношении. За исключением гомотетрамерного фермента Agrobacterium tumefaciens d3 [34], все известные нитрилгидратазы являются ар-гетеромультимерами, как правило, димерами или тетрамерами. У R. rhodochrous Л было обнаружено образование двух видов нитрилгидратаз: высокомолекулярной (520 к Да) и низкомолекулярной (130 кДа) [128, 160]. Известна кристаллическая структура железосодержащих нитрилгидратаз из Rhodococcus sp. R312 и R. rhodochrous N-771 и строение каталитического центра фермента [25, 70]. Менее подробно изучена кристаллическая структура Co-содержащих нитрилгидратаз [41, 46]. Описан эффект фотоактивации нитрилгидратаз у R. rhodochrous N-771 и N-774 [123,132].
Большинство нитрилгидратазных ферментов, известных по литературе, подвержены индукции различными нитрилами, амидами или карбоновыми кислотами [6, 60, 80]. Высокомолекулярная нитрилгидратаза R. rhodochrous Л индуцируется амидами - продуктами реакции, но не нитрилами [99]. Мочевина, мощный индуктор нитрилгидратазы для R. rhodochrous Л и R. rhodochrous М8, незначительно повышет активность фермента у Agrobacterium tumefaciens В-261 [80,121,174].
Влияние аммония на активность ферментов биотрансформации нитрилов изучено только у штамма R, rhodochrous М8 [4, 5]. Показано, что нитрилгидратаза и амидаза R. rhodochrous М8 коиндуцируются рядом алифатических нитрилов и амидов, а избыток аммония подавляет индукцию. Адаптация клеток R. rhodochrous М8 к изменению природы и концентрации источника азота происходит с помощью механизма, известного у грамотрицательных микроорганизмов как азотный контроль [108].
В настоящее время опубликованы немногочисленные данные о влиянии глюкозы на метаболизм нитрилов. Глюкоза подавляет индуцированную амидами активность нитрилгидратазы и амидазы у R. rhodochrous М8 [6], угнетает образование нитрилгидратазы у Pseudomonas chlororaphis В23 [125], но не влияет на экспрессию фермента у A. tumefaciens В-261 [80].
Для штамма R. rhodochrous М8 показана кобальтзависимая транскрипция генов, кодирующих нитрилгидратазу [145]. Это редкий пример специфической регуляции внутриклеточных ферментов на уровне транскрипции ионами металла, которые являются простетическими группами энзима. Ионы кобальта индуцируют нитрилгидратазу R. rhodochrous Л, а также необходимы для формирования активного центра белка, его вторичной структуры, стабилизации, и соответственно, уровня активности фермента [91,128].
В литературе представлена информация по генетическому контролю конверсии нитрилов карбоновых кислот у некоторых штаммов бактерий. В штаммах почвенных бактерий обнаружены хромосомные гены нитрилгидратазы и амидазы, контролирующие гидролиз нитрилов до соответствующей кислоты и аммония [86]. Клонированы и секвенированы гены высоко- и низкомолекулярной нитрилгидратазы R. rhodochrous Л [88], гены нитрилгидратазы Rhodococcus erythropolis BL-1 [56], R, rhodochrous N-774 [69] и M8 [8]. Структурные гены а- и р-субъединиц нитрилгидратаз находятся в одном локусе ДНК, но порядок расположения их кодирующих последовательностей у разных штаммов различен [85, 86]. Показано, что гены нитрилгидратазы и амидазы у ряда штаммов Rhodococcus тесно связаны и, по-видимому, организованы как оперон. Гены, ответственные за метаболизм нитрилов у кобальтсодержащего штамма R. rhodochrous М8, имеют другую организацию и составляют регулон [174].
Таким образом, нитрилгидратазный путь метаболизма нитрилов широко распространен у бактерий. Биохимическая регуляция активности, генетическая организация и энзиматические свойства нитрилгидратаз разных штаммов различаются в значительной степени. Опубликованные данные исследований не дают полного представления о разнообразии и механизмах регуляции метаболизма нитрилов у бактерий.
Цель настоящего исследования — Изучение физиолого-биохимических свойств новых селектированных штаммов бактерии-продуцентов нитрилгидратазы.
Основные задачи исследования:
Выделить микроорганизмы, способные утилизировать нитрилы карбоновых кислот путем двустадийного гидролиза. Отобрать и идентифицировать штаммы с высокой нитрилгидратазной активностью.
Определить локализацию генов нитрилгидратаз селектированных штаммов.
Исследовать влияние различных факторов среды на рост и нитрилгидратазную активность штаммов-продуцентов.
Охарактеризовать нитрилгидратазы: определить субстратную специфичность ферментов, рН- и температурную зависимость, действие ингибиторов на ферментативную активность.
Дать сравнительный анализ выделенных культур по каталитическим свойствам и оценить возможность их применения в технологии синтеза акриламида.
Научная новизна. Селектированы и исследованы новые высокоактивные штаммы-продуценты нитрилгидратазы Rhodococcus erythropolis 84 и Rhodococcus ruber gtl. Разработан оригинальный спектрофотометрический метод измерения нитрилгидратазной активности. Показана хромосомная локализация генов нитрилгидратаз данных штаммов. Установлено, что нитрилгидратазная активность изученных штаммов снижается при повышении концентрации глюкозы в среде, а биосинтез железозависимой нитрилгидратазы R. erythropolis 84 - при увеличении концентрации аммония. Установлено, что присутствие индуктора, нитрила или амида, не является обязательным для проявления нитрилгидратазной активности у обоих штаммов. Выявлены существенные различия влияния факторов среды на нитрилгидратазную активность Л. erythropolis 84, R. ruber gtl и ранее известных штаммов - продуцентов нитрилгидратазы. Показано, что нитрилгидратазы выделенных штаммов обладают широкой субстратной специфичностью и гидратируют бензонитрил и 3-цианопиридин с более высокой скоростью, чем известные промышленные штаммы. Обнаружено, что нитрилгидратаза R. ruber gtl имеет более широкий диапазон термо- и рН-устойчивости, чем фермент R. erythropolis 84.
Теоретическое и практическое значение работы. Создана лабораторная коллекция бактерий, конвертирующих нитрилы карбоновых кислот. Выполненные исследования расширяют представления о разнообразии бактерий, экспрессирующих нитрилгидратазы, регуляции метаболизма нитрилов, возможности использования новых штаммов для синтеза амидов. Выделенные штаммы и полученные результаты могут быть использованы для усовершенствования технологии синтеза акриламида, для получения других химических соединений, а также для разработки биотехнологических методов очистки окружающей среды.
Основные положения, выносимые на защиту
Селектированные штаммы R. erythropolis 84 и R. ruber gt\ метаболизируют алифатические и ароматические нитрилы, динитрилы и амиды нитрилгидратазно - амидазным путем.
Гены а-и р-субъединиц нитрилгидратаз имеют хромосомную локализацию. Нитрилгидратаза R. erythropolis 84 является железозависимым, а нитрилгидратаза R. ruber gtl - кобальтзависимым ферментом.
Нитрилгидратазная активность исследованных штаммов снижается при повышении концентрации глюкозы в среде, а у Л. erythropolis 84 - также при увеличении содержания аммония. Присутствие индуктора, нитрила или амида, не является обязательным для проявления активности фермента.
Нитрилгидратазы штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl обладают широкой субстратной специфичностью. Наилучшими субстратами являются ацетонитрил и акрилонитрил. Кобальтзависимая нитрилгидратаза имеет более широкий диапазон термо- и рН-устойчивости.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены на областных конференциях молодых ученых и студентов «Проблемы химии и экологии», г. Пермь, 2000, 2003; Научно-практическом семинаре «Биотехнология-2000», г. Пущино, 2000, 2003; IX и X Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Экология: проблемы и пути решения», г.Пермь, 2001, 2002; Международном семинаре МНТЦ "Научно-технический потенциал Западного Урала в конверсии военно-промышленного комплекса" г. Пермь, 2001; V Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды», Волгоград - Пермь, 2001; Конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии», Пермь, 2002, 6-ой и 7-ой Пущинских конференциях молодых ученых «Биология -наука 21-го века», г. Пущино, 2002,2003.
По теме диссертации опубликовано 24 научные работы, в т.ч. статья в журнале «Прикладная биохимия и микробиология», 2003, №1, с.63-68. Получены патенты Российской Федерации: №2196822 «Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis — продуцент нитрилгидратазы», дата приоритета 25.07.2001, и №2223316 «Штамм бактерий Rhodococcus ruber - продуцент нитрилгидратазы», дата приоритета 06.12.2001.
Связь работы с научными программами. Исследования выполнены при поддержке гранта РФФИ № 01-04-96465, ФЦП «Интеграция науки и высшего образования России на 2002-2006 гг.», программы Президиума РАН «Научные основы сохранения биоразнообразия России» и программы
Отделения биологических наук РАН «Фундаментальные основы управления биологическими ресурсами».
Список принятых сокращений: ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ГХ - газовая хроматография;
ДАПК - диаминопимелиновая кислота; МРПС - минимальная ингибирующая концентрация; МПА - мясопептонный агар; МННГ - К-метил-№-нитро-М-нитрозогуанидин; НГ - нитрилгидратаза; ОП - оптическая плотность; ПЦР - полимеразная цепная реакция; СЕ - субъединица; LB - среда Луриа-Бертани.
13 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ '
Бактерии, утилизирующие нитрилы карбоновых кислот
Физиологическая роль нитрилгидролизующих ферментов у бактерий до конца не исследована. В растениях эти ферменты входят в комплекс путей, контролирующих синтез и метаболизм цианогликозидов, где альдоксимы являются ключевыми интермедиатами [37, 150, 151]. Y. Asano и Y. Kato обнаружили альдоксим-деградирующие штаммы Bacillus и Rhodococcus, которые метаболизирутот альдоксимы через нитрильные соединения до карбоновых кислот посредством нового фермента альдоксимдегидратазы и ферментов гидролиза нитрилов [28,75,76].
Микроорганизмы, конвертирующие нитрилы карбоновых кислот, концентрируются и подвергаются естественной селекции в очистных сооружениях предприятий, а также в почвах, загрязненных нитрилами, в местах складирования и использования этих соединений. Известное таксономическое распределение бактериальных нитрил-конвертирующих ферментов {Arthrobacter, Pseudomonas, Rhodococcus) может быть обусловлено тем, что многие группы микроорганизмов никогда не исследовались, а также технологиями скрининга, использующими накопительное выделение в углерод- или азот-лимитирующих средах с добавлением нитрилов для отбора выживших и быстрорастущих микроорганизмов. Таким методом обогащенной культуры были изолированы Rhodococcus rhodochrous (ранее Arthrobacter sp.) J-1 и P. chlororaphis B23 [27, 79] как ацетонитрил- и изобутиронитрил - утилизирующие штаммы, соответственно. M.J. DiGeronimo и A.D. Antoine изолировали из почвы штамм R. rhodochrous (ранее Nocardia rhodochrous) LL100-21 на среде с ацетонитрилом, который использовался в качестве единственного источника углерода и азота [54]. Данный микроорганизм конвертировал алифатические нитрилы и амиды. Для обнаружения микроорганизмов, способных к гидролизу акрилонитрила, в качестве селективного субстрата часто используют малотоксичный для бактерий ацетонитрил. Ацетонитрил, обладающий хорошей растворимостью в водной и липидной средах, а также низким молекулярным весом, путем пассивного транспорта легко попадает в микробную клетку [23]. I. Watanabe и соавт. показали, что можно выделить более 1000 изолятов, способных утилизировать ацетонитрил, но очень малое их количество трансформирует акрилонитрил в акриламид [164]. Т. Yamada и др. впервые описали штамм Arthrobacter sp. 1-9, способный использовать акрилонитрил в качестве единственного источника питания [168]. M.S. Nawaz и соавт. изолировали из промышленных стоков штамм Klebsiella pneumonia NCTRl, способный трансформировать 12,4 мМ акрилонитрил и другие алифатические нитрилы, при добавлении в среду глюкозы в качестве источника углерода [134]. В 1990 году К. Narayanasamy описал штамм рода Arthrobacter, выделенный из нефтехимических отходов, использующий акрилонитрил в концентрации 30 мМ как единственный источник питания. Более высокие концентрации нитрила подавляли клеточный рост [133]. N. Layh с соавторами показали, что штаммы, выделенные методом обогащенной культуры, имеют высокую нитрилдеградирующую способность именно к тем субстратам, которые использовались для селекции [103].
Для целенаправленного выделения штаммов, способных к деградации определенного химического вещества, обычно неприродного и очень токсичного, применяют также метод адаптивной селекции [26]. Данный метод требует более длительного времени, в отличие от предыдущего. Типичный пример адаптивной селекции - получение акрилонитрил -утилизирующих бактерий Rhodococcus rhodochrous К22 (1-1) с нитрилазной системой, и R. rhodochrous N-774, имеющего нитрилгидратазно-амидазную систему гидролиза нитрилов [163, 168]. Штамм Л. rhodochrous К22 был способен конвертировать широкий спектр алифатических и ароматических нитрилов, включая глутаронитрил [95, 169]. R. rhodochrous N-774 показал высокую акриламидсинтетическую активность и способность к утилизации различных моно- и динитрилов, но практически не использовал ароматические нитрилы в качестве ростового субстрата. Штамм R. rhodochrous Л эффективно утилизировал ароматические нитрилы (бензонитрил, 3-хлоробензонитрил и др.) посредством нитрил азы [87, 90]. При добавлении в среду ионов кобальта нитрилазная активность снижалась, а нитрилгидратазная появлялась и увеличивалась при добавлении в эту же среду алифатических нитрилов или амидов [128,130].
Нитрилгидратазы штаммов В. smithii SC-J05-1, R. rhodochrous Л, М8 и С. nitrilophilus АТСС21419, катализируют гидролиз как ароматических, так и алифатических нитрилов, но у большинства показана преимущественная селективность для определенных субстратов [24, 68, 78, 79, 82, 154, 174]. Высказана и другая точка зрения: возможно, что специфичность нитрилгидратазы к алифатическим нитрилам обусловлена не низким сродством фермента к ароматическим нитрилам, а тем, что последние действуют скорее как высокоаффинные ингибиторы, чем как субстраты [50]. Так, бензонитрил и ряд других нитрилов и цианидов легко ингибируют нитрилгидратазную активность. Например, нитрилгидратазы Rhodococcus sp. R312, С. pseudodiphteriticum ZBB-41 и С. nitrilophilus АТСС21419 ингибировались изобутиронитрилом, цианидом, и а-гидроксинитрилами, соответственно [24, 105, 126]. R. Cramp сообщила о необратимом ингибировании бензонитрилом нитрилгидратазной активности В. pallidus Dae 521 [51]. Известны микроорганизмы R. rhodochrous Л и В. pallidus Dac521, содержащие две ферментные системы - нитрилгадратазно-амидазную и нитрилазную, проявление активности которых зависит от условий роста микроорганизмов [49, 85,96]. Возможно, это объясняется приспособлением бактерий к условиям окружающей среды [63,162],
Условия культивирования бактерий и определение ростовых характеристик
Идентификация штаммов проводилась на основании культурально-морфологических, биохимических и хемотаксономических характеристик согласно определителю Берджи [18], руководствам О.А. Нестеренко и соавт. [17]иИ.Б.Ившиной[11]. Морфологию и жизненный цикл изучали у 12-72 часовых культур, выращенных на агаризованной среде LB с использованием световой микроскопии (фазовый контраст). Дифференциацию бактерий по Граму проводили общепринятым методом окрашивания [14], а также с использованием теста с КОН [15]. Для изучения хемотаксономических признаков культуры выращивали в аэробных условиях на среде Луриа-Бертани. Диагностические аминокислоты и сахара клеточной стенки определяли стандартными методами с модификациями [15]. Определение мезо-диаминопимелиновой кислоты. Навеску 10 мг сухой биомассы помещали в ампулу и заливали 0,1 мл 6Н H2SO4. Ампулу запаивали и автоклавировали 3 ч при 120С. После охлаждения до комнатной температуры ампулу вскрывали и наносили 10 мкл гидролизата на хроматографическую пластинку Cellulose С (Merck). В качестве стандарта использовали ОД М растворы мезо-ДАПК, лизина и орнитина. Для разделения аминокислот использовали систему растворителей метанол : дистиллированная вода : пиридин : 6Н НС1 (80:26:10:4). Разделение проходило в течение 2-3 часов. Пластинку опрыскивали 0,5 % раствором нингидрина в ацетоне, высушивали и прогревали в течение 2 минут при 100С. Пятна мезо-ДАПК окрашивались в оливковый цвет.
Выявление Сахаров. Навеску 10 мг сухой биомассы помещали в ампулу и заливали 0,1 мл IHH2SO4. Ампулу запаивали и автоклавировали 30 мин при 120С. Для обнаружения Сахаров гидролизаты клеток наносили на хроматографическую пластинку Sorbfil («Сорбполимер») в количестве 4 мкл. В качестве стандарта использовали раствор, содержащий галактозу, глюкозу, арабинозу, ксилозу, рамнозу в 1,0 % концентрации. Для разделения Сахаров использовали следующую систему растворителей: бутанол: уксусная кислота : дистиллированная вода (4:1:1). Разделение проводили в течение 3-4 часов. Сахара обнаруживали обработкой хроматограммы раствором, содержащим 5 г анилинфталата, растворенного в 100 мл водонасыщенного бутанола, с последующим высушиванием и прогреванием в течение 4 мин при 100С. Пятна гексоз окрашивались в буро-коричневый цвет, пентоз - в розово-коричневый.
Определение миколовых кислот (липида LCN-A). Сухую биомассу в количестве 100 мг помещали в стеклянную ампулу, добавляли 5 мл метанола, 5 мл толуола и 0,2 мл конц. H2S04, после чего смесь тщательно перемешивали. Метанолиз проводили в течение 12-16 часов при температуре 75С. После охлаждения к смеси добавляли 2 мл гексана и интенсивно встряхивали. Липид LCN-A обнаруживали методом тонкослойной хроматографии. Гексановый экстракт (20 мкл) наносили на пластинку Силуфол и разгоняли в системе петролейный эфир : диэтиловый эфир (85 : 15). После высушивания хроматограмму проявляли 5 % спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты при нагревании (105С, 5 мин). Миколовые кислоты визуализировались как синие пятна на желтом фоне. В качестве контроля использовали гексановые экстракты продуктов метанолиза клеток R. erythropolis ИЭГМ62Т и R. ruber ИЭГМ70Т, предоставленных чл.-корр. РАН И.Б. Ившиной.
Клетки бактерий выращивали в 100 мл среды N в конических колбах объемом 250 мл, либо в 40 мл среды N в конических колбах объемом 100 мл на роторной качалке при постоянном перемешивании со скоростью вращения 120 об/мин и температуре 28, либо в ферментёре «Фермус-4» в периодическом режиме. Бактериальный рост измеряли на фотоэлектроколориметре КФК-3 с использованием 0,5 см кюветы или на спектрофотометре СФ-46 с использованием кварцевой 1 см кюветы. Плотность культуры бактерий оценивали по оптической плотности клеточной суспензии при Я,=540 нм с учетом разведения. Одна единица ОП540 соответствует 0,42 мг сухого веса клеток.
Определение минимальных ингибирующих концентраций нитрилов и амидов Минимальные ингибирующие концентрации нитрилов и амидов измеряли в суспензионном тесте на 96-луночных планшетах следующим образом. В каждую лунку планшета вносили по 100 мкл свежей питательной среды. В рядах планшета последовательно готовили серийные двукратные разведения тестируемых нитрилов и амидов в диапазоне концентраций от 0,1 до 10 %. После этого в каждую лунку добавляли свеже выращенную культуру одного из исследуемых штаммов до рабочей концентрации 105 клеток/мл. В отдельных лунках готовили контроли роста и стерильности среды [19].
Идентификация штаммов-продуцентов нитрилгидратазы
Отбор проб проводился на территории производства «Акрилат» Пермского завода им. СМ. Кирова и Березниковского химического завода (ОАО «Бератон»), на площадях которых расположены производственные мощности для получения акриламида.
С целью выделения активных штаммов, способных трансформировать акрилонитрил, проанализировано 12 образцов почвы. Для первичного отбора микроорганизмов использовали минеральную среду N, содержащую в качестве селективных субстратов ацетонитрил, наиболее легко метаболизируемое соединение в ряду нитрилов [23], а также трудно усваиваемые нитрилы - акрилонитрил и изобутиронитрил. Изобутиронитрил, метаболизм которого затруднен вследствие наличия метальной группы, вызывает сильную индукцию некоторых нитрил- и амидгидролизующих ферментов [164].
Клоны микроорганизмов, способных к утилизации нитрилов, выделяли методами накопительной культуры и прямого высева. У всех клонов измеряли нитрилгидратазную активность. Из накопительных культур, в которых наблюдался микробный рост, при высеве на агаризованные среды были выделены клоны, способные утилизировать нитрилы. Наибольшее их количество получено на среде с ацетонитрилом. Микробный рост из большинства образцов почв не проявлялся на среде, содержащей в качестве единственного источника углерода акрилонитрил. Установлено, что до 90 % выделенных клонов были способны к утилизации как нитрилов, так и амидов. У большинства клонов было обнаружено образование амида в качестве промежуточного продукта гидролиза нитрила, что свидетельствует о наличии у них ферментной системы нитрилгидратаза — амидаза. Все культуры были проверены на нитрилгидратазную активность. В результате предварительного отбора получено более 250 клонов, имеющих нитрилгидратазную активность выше З ЕД.
Проведена адаптивная селекция со ступенчатым повышением концентрации нитрилов и удалением из среды других источников углерода. Для повышения гетерогенности популяции и ускорения селективного процесса культуры обрабатывали мутагеном N-Memrr-N -HHTpo-N-нитрозогуанидином. На каждом этапе селекции удавалось повысить активность культуры на 5-8 %.
В результате были получены клоны микроорганизмов, активно растущие при 1,5 % концентрации акрилонитрила и при 5,5 % концентрации ацетонитрила в отсутствии других источников углерода. В то же время по данным литературы, ранее были известны микроорганизмы, устойчивые к концентрации лишь 0,1 % нитрила акриловой кислоты и 5 % ацетонитрила
В дальнейших исследованиях были использованы клоны, имеющие высокую нитрилгидратазную активность (более 10 ЕД). Для получения клонов с высокой нитрилгидратазной и пониженной амидазной активностью проводили селекцию с хлорацетамидом. В результате проведенной селекции были получены 2 культуры грамположительных нокардиоподобных бактерий с рабочими номерами 84 и gtl и, которые обладали наиболее высокой нитрилгидратазной активностью по акриламиду (до 112ЕД и 248 ЕД соответственно). Оба штамма были выделены методом рассева на агаризованную селективную среду из накопительной культуры, полученной на минеральной среде с ацетонитрилом.
По данным окрашивания по Граму и КОН-теста установлено, что штаммы 84 и gtl являются грамположительными бактериями. Штамм 84 при росте на МПА и LB-arape образовывал крупные круглые с ровным краем колонии кремового цвета, которые отличался обильным слизистым ростом. В процессе роста колонии увеличивались в размерах (на 5-7 день инкубации до 3-8 мм в диаметре), цвет колоний становился более интенсивным, розово-палевым. Штамм gtl образовывал круглые, матовые, выпуклые колонии с ровным краем, среднего размера и красно-оранжевого цвета.
Оба штамма имели характерный для нокардиоподобных бактерий трехстадийный морфогенетический цикл развития. Клетки штаммов несколько отличались по морфологии в разные стадии жизненного цикла. Клетки 12-ти часовой культуры штамма 84 были представлены короткими нитями, в результате фрагментации распадающимися на мелкие палочки. К 24 часам роста колонии штамма 84 состояли из палочек неправильной формы и кокков. Двенадцатичасовая культура gtl была представлена длинными обильно ветвящимися гифами. Фрагментация клеток штамма gtl заканчивалась к 40 часам роста культуры, а клетки 2-суточного возраста состояли только из коротких палочковидных и кокковидных элементов.
В гидролизатах клеток исследуемых штаммов были обнаружены мезо-диаминопимелиновая кислота (рис. 10), арабиноза, галактоза, миколовые кислоты, идентичные таковым для представителей рода Rhodococcus. Таким образом, селектированные культуры обладали клеточной стенкой IV типа. По ряду культурально-морфологических и хемотаксономических признаков штаммы 84 и gtl были отнесены к роду Rhodococcus [11, 18].
Зависимость роста клеток и нитрилгидратазной активности от концентрации ацетонитрила
При культивировании штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl на среде без нитрилов или амидов уровень активности нитрилгидратазы был также достаточно высок. В то же время показано, что на степень индукции фермента влияют и другие факторы среды (источники углерода и азота, ионы железа и кобальта и др.). Таким образом, присутствие нитрилов или амидов в среде не является обязательным для экспрессии нитрилгидратаз R. erythropolis 84 и Л. ruber gtl.
Известно, что многие индуцибельные ферменты подвержены катаболитной репрессии легкометаболизируемыми источниками углерода, такими, как глюкоза. Снижение индукции нитрилгидратазы при внесении в среду глюкозы может быть связано с нарушением проникновения индуктора в клетку, ретроингибированием уже синтезированного фермента или с подавлением его биосинтеза на уровне транскрипции [109]. Данные о влиянии глюкозы на активность ферментов гидролиза нитрилов немногочисленны. Глюкоза, фруктоза и сукцинат подавляют индуцированную амидами активность нитрилгидратазы и амидазы R. rhodochrous М8 [174]. Образование нитрилгидратазы у P. chlororaphis В23 также сильно угнетается при добавлении глюкозы в среду [170]. В то же время, активность нитрилгидратазы A. tumefaciens В-261 не репрессируется глюкозой [80], а нитрилгидратаза штамма Rhodococcus sp. CGMCC 0497 проявляет максимальную активность на среде, содержащей 1 % глюкозу или сахарозу [167]. Штамм В. imperialis CBS 498-74 показал максимальную нитрилгидратазную активность при росте на среде с начальным содержанием глюкозы 5 %, но максимум ферментативной продукции приходился на период снижения ее концентрации до 0,5 % [45].
Нами показано, что нитрилгидратазная активность R. erythropolis 84 и R. ruber gtl снижается при добавлении глюкозы в среду культивирования. У обоих штаммов значительное подавление активности зарегистрировано при концентрации глюкозы 0,3 %. Дальнейшее увеличение количества глюкозы в среде приводило к постепенному снижению активности нитрилгидратазы. Также было установлено, что глюкоза не снижает нитрилгидратазную активность отмытых от среды клеток и бесклеточных экстрактов штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl, следовательно, ее угнетающее действие не может быть объяснено ретроингибированием. Исходя из полученных результатов, снижение активности нитрилгидратазы в ответ на добавление в среду глюкозы может быть рассмотрено как доказательство катаболитной репрессии у штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl, аналогично тому, как это установлено для штамма R. rhodochrous М8 [174].
Нами исследовано влияние альтернативных источников углерода на рост и ферментативную активность штаммов R. erythropolis 84 и R, ruber gtl. Показано, что оба штамма хорошо растут на ряде естественных субстратов, таких как глюкоза, ацетат, цитрат, сорбит, маннит. Высокая скорость роста наблюдается также в присутствии ацетонитрила и ацетамида, однако они не являются наилучшими источниками углерода для роста клеток штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl, как это было показано для штамма R. rhodochrous МО [6]. Установлено, что оптимальным субстратом для роста и проявления нитрилгидратазной активности R. erythropolis 84 является цитрат. В то же время штамм A ruber gtl проявляет высокую общую активность при использовании многоатомных спиртов сорбита и маннита.
Установлено, что исследуемые штаммы хорошо растут на низкомолекулярных алифатических нитрилах и амидах в качестве единственного источника питания. Высокая активность нитрилгидратазы у штаммов A erythropolis 84 и A ruber gtl проявлялась при росте в присутствии аммония. При добавлении аммония (до концентрации 5 мМ) в среду с ацетонитрилом или ацетамидом в концентрации 10 мМ скорость роста возрастала для обоих штаммов. При этом нитрилгидратазная активность штамма R. erythropolis 84 снижалась, а активность фермента A ruber gtl повышалась. Очевидно, что активность нитрилгидратазы R. ruber gtl зависит в большей степени от общей концентрации азота, чем от концентрации нитрила или амида. При культивировании клеток R. erythropolis 84 в среде, содержащей 10 мМ ацетамид, нитрилгидратазная активность снижалась пропорционально концентрации вносимого аммония. Возможно, это связано с тем, что синтез нитрилгидратазы подчинен азотному контролю подобно тому, как это было показано для R. rhodochrous МО и М8 [5, 6].
Среди альтернативных источников аммония для штамма A ruber gtl предпочтительным является нитрит натрия, при росте на котором наблюдалась максимальная плотность культуры и высокая активность нитрилгидратазы.
Известно, что уровень нитрилгидратазной активности большинства известных штаммов зависит от присутствия ионов железа или кобальта в ростовой среде [59, 130, 146]. Высокая нитрилгидратазная активность штамма R. erythropolis 84 проявляется при росте клеток на средах, в состав которых было внесено железо, и практически не изменяется при добавлении солей кобальта. С учетом результатов ПЦР-анализа генов нитрилгидратаз, это свидетельствует о том, что культура R. erythropolis 84 является продуцентом железосодержащей нитрилгидратазы. Штамм R. ruber gtl проявляет максимальную активность нитрилгидратазы при росте на средах, содержащих ионы кобальта. Таким образом, штамм R. ruber gtl образует кобальтзависимую нитрилгидратазу аналогично бактериям суперпродуцентам нитрилгидратазы R. rhodochrous Л и R. rhodochrous М8. Показано, что нитрилгидратазная активность клеток R, erythropolis 84 составляет 64 % от исходной после инкубации в течение суток с 10 мМ ЭДТА. Нитрилгидратаза штамма Л ruber gtl в аналогичных условиях сохраняет 96% ферментативной активности. Это согласуется с литературными данными о том, что кобальтзависимые нитрилгидратазы более устойчивы к хелатирующим агентам, что предполагает прочную связь ионов кобальта с ферментом [9, 92].
Установлено, что нитрилгидратазы штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl заметно различаются по своим каталитическим свойствам.
Многие известные по литературе нитрилгидратазы имеют низкий уровень термостабильности. Так, для штаммов P. chlororaphis В23 и Rhodococcus sp. R312 температурный оптимум работы ферментов составляет 20С и 35 С, соответственно [125, 126]. Нами показано, что фермент из штамма R. erythropolis 84 менее термостабилен, чем нитрилгидратаза R. ruber gtl. Максимальная активность фермента R. erythropolis 84 проявляется при температуре около 37С, а при 45-50С детектируется лишь в следовых количествах. В то же время нитрилгидратаза штамма R. ruber gtl проявляет наибольшую активность при 55С. Таким образом, нитрилгидратаза штамма R. ruber gtl сопоставима по термостабильности с ферментом Л. rhodochrous Л [129].
