Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Пневмококковые инфекции. их особенности у детей, болеющих туберкулезом 14
1,1, Вторичные иммунодефициты и туберкулез как фактор риска развития тяжелых пневмококковых инфекций 15
1.2. Общая характеристика пневмококков. Факторы вирулентности 19
1.3. Носительство пневмококков 26
1.4. Неинвазивные пневмококковые инфекции 29
1.5. Инвазивные пневмококковые инфекции 30
1.6. Резистентность штаммов S. pneumoniae к антибактериальным химиопрепаратам 31
1.7. Иммунопрофилактика пневмококковых инфекций 37
1.8. Методы индикации пневмококков и их свойств 38
Глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Направления исследования 41
2.2. Материал и объект исследования 44
2.3. Методы исследования 46
2.3.1. Эпидемиологический метод 46
2.3.2. Микробиологические методы 46
2.3.3. Молекулярно-генетические методы 47
2.3.3.1. Идентификация штаммов пневмококка и изучение факторов вирулентности с помощью полимеразнои цепной реакции (ПЦР) 47
2.3.3.2. Изучение серотипового состава штаммов и факторов вирулентности пневмококков методом Multipex ПЦР 51
2.3.3.3. Изучение резистентности S. pneumoniae к антибиотикам методом ПЦР 53
2.3.3.4. Секвенирование 55
2.3.4. Статистические методы 56
Глава 3. Заболеваемость пневмококковыми инфекциями детей с туберкулезной инфекцией. Структура носительства условно-патогенных микроорганизмов верхних дыхательных путей 59
3.1. Изучение структуры и особенностей сопутствующей инфекционной заболеваемости пациентов специализированного стационара 59
3.2. Структура носительства условно-патогенных микроорганизмов верхних дыхательных путей у пациентов специализированного стационара 62
3.3. Структура носительства условно-патогенных микроорганизмов верхних дыхательных путей у медицинского персонала специализированного стационара 62
3.4. Структура носительства условно-патогенных микроорганизмов у пациентов соматического стационара 66
Глава 4. Серотиповая и генотиповая характеристика штаммов S. pneumoniae 70
4.1. Определение детерминант основных факторов вирулентности 71
4.2. Изучение серотипового состава штаммов S. pneumoniae с помощью ПЦР 73
4.3. Исследование комплекса факторов вирулентности штаммов S. pneumoniae 80
Глава 5. Мониторинг формирования антибиотикорезистентности штаммов S.pneumoniae 82
5.1. Чувствительность к антибиотикам штаммов S. pneumoniae 82
5.2. Изучение генетически обусловленной резистентности к антибиотикам штаммов S. pneumoniae 91
5.3. Распространение геновариантов резистентности к антибиотикам штаммов S. pneumoniae 98
Глава 6. Геноварианты штаммов S. pneumoniae по сочетанию генов, кодирующих факторы вирулентности, серотипового разнообразия и чувствительности к антимикробным препаратам 102
Заключение 112
Выводы 128
Рекомендации для внедрения в медицинскую науку и практическое здравоохранение 129
Список литературы 130
- Общая характеристика пневмококков. Факторы вирулентности
- Структура носительства условно-патогенных микроорганизмов верхних дыхательных путей у медицинского персонала специализированного стационара
- Изучение серотипового состава штаммов S. pneumoniae с помощью ПЦР
- Геноварианты штаммов S. pneumoniae по сочетанию генов, кодирующих факторы вирулентности, серотипового разнообразия и чувствительности к антимикробным препаратам
Введение к работе
Актуальность проблемы. По литературным данным, ежегодно в мире от пневмококковых инфекций погибают около 1 млн. детей (Р.С. Козлов 2005, В.К. Таточенко 2007).
Пневмококки (Streptococcus pneumoniae) часто являются составляющей микрофлоры верхних дыхательных путей и встречаются повсеместно. Уровень носительства пневмококков различен у людей разного возраста. У детей до 4,5 лет отмечается наибольшая частота носительства (у 90%), среди взрослых – у 5–10%. Согласно международным и российским данным, на пневмококковую инфекцию приходится до 76% этиологически расшифрованных случаев внебольничной пневмонии у взрослых и до 94% осложнённых случаев - у детей.
Заболеваемость пневмококковыми инфекциями в Европе составляет 16-20 (R. Jones 2002). В России заболеваемость колеблется от 5-6 до 16-20, и регистрируется практически во всех возрастных и социальных группах, при этом 40% населения являются носителями данного микроорганизма (Л.С. Страчунский 1999; А.В. Мартынова 2004, 2007).
Рост резистентности микроорганизмов, в том числе и пневмококков, к антибиотикам является глобальной проблемой для системы общественного здравоохранения. Особое значение рост резистентности имеет для педиатрии. Это связанно с необоснованно частым использованием антибиотиков для лечения обычных детских инфекционных заболеваний в амбулаторных условиях и тяжёлых инфекций в стационарах (А. Tomasz 1995; В.Б. Туркутюков 2003, 2005).
Чаще всего резистентные пневмококки выделяются у детей дошкольного возраста. Наиболее существенными факторами риска для детей являются: пребывание в детских учреждениях, предшествующая госпитализация, недавнее использование антибиотиков (Л.И. Дворецкий 2004).
Несмотря на широкое распространение антибиотикорезистентности, клиническое значение этого явления остается в стадии изучения. До сих пор отсутствуют достоверные данные о проведении эпидемиологического анализа носительства пневмококков в различных группах населения, с учетом сопутствующей патологии, включая данные о серотиповом составе популяции штаммов пневмококков; об уровне устойчивости штаммов пневмококков к антибиотикам, выделенных у больных; о генотипических и фенотипических особенностях выделенных штаммов. Это отрицательно сказывается на возможности назначения и коррекции рациональной антибактериальной химиотерапии (А.В. Мартынова 2005, 2008; В.Б. Туркутюков 2008) .
Высокие показатели заболеваемости туберкулезом среди детей, а также интенсивная супрессия иммунной системы организма при инфицировании M. tuberculosis способствуют развитию тяжелых форм пневмококковых инфекций, что свидетельствует об актуальности изучения особенностей носительства пневмококков у детей. Это позволит повысить своевременность диагностики и эффективность лечения, а также послужить основой для совершенствования эпидемиологического надзора и обоснования проведения иммунопрофилактики пневмококковых инфекций у детей с туберкулезной инфекцией.
Цель работы
Совершенствование микробиологической диагностики, обоснование рационального применения антибиотиков и повышения эффективности профилактических мероприятий при пневмококковых инфекциях у детей с туберкулезной инфекцией на основе изучения особенностей микробиологических и молекулярно-генетических характеристик штаммов S. pneumoniae.
- Изучить частоту регистрации пневмококковых инфекций и носительства штаммов S. pneumoniae у детей с туберкулезной инфекцией.
- Изучить серотиповой пейзаж и факторы вирулентности у выделенных штаммов S. pneumoniae на основе их генотиповой характеристики.
- Оценить чувствительность выделенных штаммов S. pneumoniae к антибиотикам фенотипическими методами и установить частоту выявления детерминант резистентности к ним для повышения эффективности антибактериальной химиотерапии у пациентов с туберкулезной инфекцией при сопутствующих пневмококковых инфекциях.
- Обосновать использование молекулярно-генетических методов в идентификации S. pneumoniae и оценке их этиологической и эпидемиологической значимости.
- Разработать рекомендации по совершенствованию вопросов специфических профилактических мероприятий у носителей штаммов S. pneumoniae в специализированных противотуберкулезных стационарах.
Научная новизна исследования
Практическая значимость
Предложенные современные и экономичные молекулярно-генетические методы для идентификации чистой культуры S. pneumoniae и изучения факторов патогенности позволяют ускорить индикацию возбудителя, значительно повысить её достоверность, и оценить степень вирулентности пневмококка.
Проведенный мониторинг антибиотикорезистентности выделенных штаммов пневмококка обосновывает эффективную этиотропную антибактериальную химиотерапию при присоединении пневмококковых инфекций.
Метод ПЦР, применяемый для определения устойчивости к антибиотикам штаммов S. pneumoniae, дает значительно более достоверные результаты, чем традиционные фенотипические методы, так как такие штаммы подвергались активному селективному давлению антибактериальными химиопрепаратами.
Для определения серотиповой структуры выделенных штаммов предложен модифицированный метод multiplex ПЦР с праймерами для генов, специфичных основным серотипам, имеющий высокую достоверность и позволяющий при необходимости определить наибольшее количество известных серовариантов.
Данные о структуре носительства условно-патогенных микроорганизмов в ВДП и сопутствующей заболеваемости среди детей с туберкулезной инфекцией позволили получить представление об эпидемиологической ситуации по носительству пневмококка и других микроорганизмов в такой специфической группе, как пациенты, находящиеся на длительном лечении в противотуберкулезной больнице.
Результаты исследования внедрены в работу детской краевой клинической противотуберкулезной больницы, детской городской клинической больницы №3, Центре фармако-технической информации и клинической фармакологии департамента здравоохранения Администрации Приморского края, Приморском краевом центре иммунопрофилактики департамента здравоохранения Администрации Приморского края.
Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры эпидемиологии и военной эпидемиологии ВГМУ; кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии ВГМУ; кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии ГОУ ВПО АГМА Росздрава (Благовещенск), кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии ГОУ ВПО ДГМУ Росздрава (Хабаровск).
Изданы методические рекомендации «Прогнозирование тяжести течения пневмококковых инфекций с помощью серотипирования методом Multiplex ПЦР» (2009), информационное письмо «Рациональная антибиотикотерапия пневмококковых инфекций у пациентов специализированного противотуберкулезного стационара» (2009). Оформлены рационализаторские предложения: «Идентификация Streptococcus pneumoniae с помощью ПЦР» (2009); «Прогнозирование течения пневмококковой инфекции с помощью серотипирования методом полимеразной цепной реакции» (2009). Определенные последовательности гена rpoB S.pneumoniae зарегистрированы в базе данных National Center for Biotechnology Information (NCBI/GenBank) под номерами GQ336504, GQ336505, GQ336506, GQ336507.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Пациенты противотуберкулезных стационаров и медицинский персонал составляют группы риска по развитию пневмококковых инфекций дыхательных путей, что связано с действием на организм туберкулезной инфекции, длительным нахождением в закрытом коллективе в процессе лечения, преобладанием в структуре носительства микроорганизмов S. pneumoniae, обладающих полирезистентностью к различным современным антибактериальным препаратам широкого спектра действия, таким как макролиды, фторхинолоны и рифампицин.
-
Для микробиологической диагностики S. pneumoniae при возникновении заболевания предположительно пневмококковой этиологии необходимо комплексное обследование, методом ПЦР с праймерами для гена ply, обладающим высокой чувствительностью и достоверностью. Для прогнозирования течения инфекционного процесса рекомендуется использовать серотипирование S. pneumoniae методом Multiplex ПЦР, который является экономичным и имеет высокую специфичность.
-
Серотиповой состав штаммов S. pneumoniae среди детей с туберкулезной инфекцией и пациентов детских соматических стационаров существенно различается. Так в первой из них доминирует серотип 3 и 19А, а во второй - серотип 6В. Серотип 3 является высоковирулентным, чаще вызывает осложненные формы пневмококковой инфекции и поэтому является клинически значимым, так как позволяет прогнозировать степень и интенсивность инфекционного процесса, а также обосновывает необходимость проведения специфической иммунопрофилактики пневмококковых инфекций в группах риска.
Личный вклад автора в исследование
Автором проведена систематизация и анализ материалов по заболеваемости пневмококковыми инфекциями в специализированном и соматическом стационарах. Лично автором проведено выделение, идентификация и оценка чувствительности к антибиотикам штаммов S. pneumoniae, полученных в ходе исследования. При непосредственном участии автора подготовлены и проведены молекулярно-генетические методы исследования штаммов S. pneumoniae. Все методы статистической обработки результатов исследования выполнены автором лично.
Апробация работы
Материалы диссертации представлены и обсуждены на Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых учёных с международным участием (Владивосток, 2005, 2006, 2007, 2008); XV Европейском Конгрессе по Клинической Микробиологии и Инфекционным Заболеваниям (Копенгаген, 2005); XVI Европейском Конгрессе по Клинической Микробиологии и Инфекционным Заболеваниям (Франция, Ницца, 2006); 5th International Symposium on Pneumococci and Pneumococcal Diseases (Australia, 2006); IX съезде Всероссийского Научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); Дальневосточном региональном конгрессе «Человек и лекарство» (Владивосток, 2007, 2008, 2009). Работа обсуждена на заседании проблемной комиссии по инфекционным болезням эпидемиологии, микробиологии и иммунологии Владивостокского государственного медицинского университета (2009).
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано 25 научно - исследовательских работ, из них 5 в иностранной печати, 4 в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 4 электронных публикации; 1 методические рекомендации, 2 рационализаторских предложения.
Структура диссертации
Материалы диссертации изложены на 156 страницах машинописного текста, иллюстрированы 30 таблицами, 27 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 4 глав собственных исследований, общих выводов, рекомендаций для внедрения в медицинскую науку и практическое здравоохранение. Библиографический указатель включает 235 источник литературы, из них 112 отечественных и 123 иностранных авторов. Диссертационная работа выполнена по плану НИР ГОУ ВПО ВГМУ Росздрава, номер государственной регистрации 01.2.006.13618.
Содержание, результаты и обсуждение работы
Общая характеристика пневмококков. Факторы вирулентности
В настоящее время существует несколько классификаций факторов вирулентности пневмококка. Одна из них предложена исследователями, секве-нировавшими геном пневмококка. Они выделили пять групп факторов: осуществляющие адгезию (9 факторов), утилизирующие питательные вещества (37 факторов), действующие как переносчики протеазы (30 факторов), защищающие от агрессии хозяина (25 факторов), факторы с неизвестной функцией (23) [9, 15, 16, 17, 19, 23, 31, 31, 35, 43, 45, 46, 47, 65, 91, 124].
Есть и другая - классическая классификация, которая отражает критерий локализации фактора в бактериальной клетке. Этой классификации придерживаются в основном не генетики, а микробиологи. Согласно ей, выделяют факторы, локализованные в клеточной стенке (поверхностный протеин А, аутолизин, полисахариды клеточной стенки), в цитоплазме (пневмолизин), и в капсуле (полисахариды капсулы) [47, 65, 167].
Для пневмококков характерно наличие мощной полисахаридной капсулы, которая выполняет защитную функцию, препятствуя опсонизации и последующему фагоцитозу. Содержащиеся в капсуле сложные полисахариды определяют серотип пневмококка. Все серотипы являются патогенными для человека, причем в клинической практике 1, 3, 4, 7, 8, 9 и 12-й типы наиболее часто вызывают заболевания взрослых, а пневмонии и отиты у детей обычно связаны с 6, 14, 19 и 23-м типами. В связи с тем, что существуют перекрестные реакции между полисахаридами пневмококков и других видов бактерий, иммунологическая диагностика (серотипирование) используется реж е, чем более специфическая - бактериологическая [32, 35, 43, 45, 46, 47, 65].
Изучение S. pneumoniae привело к значительному прогрессу в понимании патогенеза бактериальных инфекций. Важность полисахаридной капсулы микроорганизма для определения его вирулентности была обозначена при исследованиях защитной роли антикапсульных антител [228]. Именно полисахарид капсулы был первым идентифицированным фактором вирулентности пневмококка. Не менее важным было наблюдение, что декапсулирован-ные пневмококки вызывали прогрессирующее заболевание у кроликов с агранулоцитозом, демонстрируя таким образом патогенные свойства пневмококковой клетки. Изучение патогенеза пневмококковой инфекции привело к разработке первой бактериальной полисахаридной вакцины, пониманию механизма устойчивости к антибиотикам, сложной структуры стенки грампо-ложительных бактерий и воспалительной активности грамположительной бактериальной клеточной стенки [15, 16, 17, 32, 35, 43, 45, 46, 47, 65, 228, 229].
Степень вирулентности пневмококка зависит от химического состава капсулы, содержания в ней тейхоевой кислоты и ее компонента - фосфохо-лина. С помощью этого вещества пневмококки прикрепляются к клеткам эндотелия. Капсульный полисахарид защищает пневмококка от фагоцитоза по-лиморфноядерными лейкоцитами. Вирулентность пневмококка определяется и размером капсулы [15, 19, 124].
При введении в легкие очищенного капсульного полисахарида не наблюдается никакого воспалительного ответа, в отличие от недекапсуллиро-ванного пневмококка, который имеет выраженные воспалительные свойства. Капсульный полисахарид, следовательно, не является необходимым для воспаления, но вносит вклад в прогрессирование инфекции, ингибируя фагоцитоз. Очищенный полисахарид капсулы не является токсичным для животных и людей, но обладает ярко выраженной антифагоцитарной активностью в неиммунном организме [181]. Роль капсулы в патогенезе очень велика - именно она во время фагоцитоза способствует нарушению поглощения пневмококков полиморфноядерными лейкоцитами [6, 7, 15, 19, 43, 60, 65, 124, 165]. Капсульный полисахарид также стимулирует продукцию серотип-специфичных, защитных антител. Известно более 90 капсульных типов, и современная 23-валентная полисахаридная вакцина была подобрана так, чтобы включать серотипы, которые вызывают от 85 до 90% бактериемических инфекций. Различные капсульные типы имеют различную устойчивость к фагоцитозу in vitro. Эти различия зависят не только от толщины капсулы, но и от биологических свойств капсулярного полисахарида [43, 60, 158, 235].
Клеточная стенка пневмококка покрыта ка псульным п олисахаридом, но все равно она доступна для некоторых компонентов острофазового ответа, что подтверждается ее способностью фиксировать комплемент. Клеточная стенка состоит из гликопептидов. Определенные компоненты клеточной стенки изменяются с приобретением резистентности к пенициллину. Компоненты пневмококковой клеточной стенки привлекают лейкоциты в легкие и субарахноидальное пространство, увеличивают проницаемость эндотелия в мозге и легочного альвеолярного эпителия, стимулируют продукцию цито-кинов, инициируют каскад свертывания, стимулирует производство тромбо-цит-активизирующего фактора (PAF), вызывают прямое повреждение нейронов, изменяют мозговой кровоток и сосудистое перфузионное давление. Компоненты клеточной стенки, полученные путем ферментативного расщепления - более мощные хемотаксические факторы, чем неповрежденная клеточная стенка. Присутствие теихоевой кислоты в компонентах клеточной стенки увеличивает ее провоспалительную активность. Необычная и важная особенность пневмококковой теихоевой кислоты - это наличие фосфорилхо-лина. Фосфорилхолин является также критическим детерминантом биоактивности PAF. Антагонисты PAF-рецепторов и антитела против клеточной стенки нейтрализуют воспаление, вызванное и РАР и клеточной стенкой [15, 35,43,158].
Персистенция пневмококка в носоглотке происходит благодаря взаимодействию между двумя фенотипами, выделяющимися колониальной морфологией - гладким и шероховатым. S-вариант (гладкий), в отличие от R-варианта (шероховатого) чаще персистирует в носоглотке in vivo, R-формы обычно образуются при долговременном культивировании на среде [124]. Пневмококки проникают в легкое путем аспирации и могут наблюдаться связанными с альвеолярной стенкой на ранних стадиях болезни, возможно потому что они фиксируются к альвеолярным клеткам II типа. Прогрессирова-ние в пневмонию требует дополнительных условий, как предполагается, ассоциацией пневмонии с существовавшей до этого вирусной респираторной инфекцией. Существуют также наблюдения, что адгезия пневмококков in vitro усиливается вирусами и цитокинами. Увеличенная адгезивная способность к активированным клеткам может заключаться во взаимодействии между фосфорилхолином клеточной стенки и PAF-рецепторами, последний, положительно регулируется цитокиновой стимуляцией. Только S-пневмококки хорошо связываются с PAF-рецепторами — факт, свидетельствующий, что вирулентность связана со способностью распознавать новые рецепторы, появляющиеся при активации клеток хозяина [228, 229, 231].
Поверхностные белки пневмококка - Cps4A, Cps4D, Cps4E, Cps4F, Cps4G, Cps4H - ответственны за биосинтез полисахарида капсулы. Они так же относятся к факторам вирулентности пневмококка. Всего известно около 70 поверхностных белков [127, 235]. Среди других наиболее важных факторов - протеаза иммуноглобулина А1, гликозилтрансфераза, белок, ответственный за эффлюкс макролидов, металлопротеаза цинка ZmpB, белок А, белок LicC, нейраминидаза, гликозилтрансфераза, холинсвязывающие белки РсрА и СЬрА, трансдукционные двухкомпонентные сигнальные системы, бактериоцины [179].
Не все функции поверхностных белков определены в настоящее время. Некоторые белки постоянно находятся на поверхности клеточной стенки, другие - секретируются из клетки.
Из белков пневмококка наиболее изучены пневмолизин, аутолизин и протеин A (PspA). Пневмолизин это видоспецифичный белок весом 53 кДа, внутриклеточно продуцируемый всеми штаммами S. pneumoniae из клинических образцов, независимо от серотипа. Он описан более 100 лет назад, как ключевой фактор вирулентности при инвазивных пневмококковых инфекциях. В 1983 году была показана ведущая роль пневмолизина в патогенезе пневмококковых инфекций, когда при проведении эксперимента, мыши, предварительно иммунизированные пневмолизином, выживали при интра-назальном заражении пневмококками, в отличие от контрольных животных [206]. Пневмолизин относится к группе тиол-активирующихся цитолизинов, продуцируемых многими грамположительными бактериями, и инактивиру-ется холестерином. По контрасту с другими токсинами, он не секретируется пневмококками, находится внутри клетки и освобождается только при лизисе клеточной стенки. Пневмолизин является основным биополимером пневмококка, нарушает целостность эндотелиального барьера головного мозга, разрушает эпителиальные клетки, имеющие реснички, и за счет этого способствует распространению пневмококков. Пневмолизин связывает холестерин в мембранах клеток, образуются трансмембранные поры, что приводит к цитолизу эукариотических клеток. Он ингибирует летальное действие фагоцитов за счет подавления окислительного взрыва, взаимодействует с другими компонентами иммунной системы, активизируя классический путь комплемента, за счет чего способствует разрушению ткани, образованию СЗа и С5а, синтезу цитокинов IL-1, TNF-a, TNF-y, оксида азота, которые вызывают острое воспаление, лихорадку и другие патологические реакции [15, 19, 24, 32, 43, 47, 60, 65, 181, 196, 204, 212, 131, 193].
Структура носительства условно-патогенных микроорганизмов верхних дыхательных путей у медицинского персонала специализированного стационара
При анализе назофарингеальных мазков, взятых у персонала этой больницы (22 человека), S. pneumoniae был выделен у 36,4%, Streptococcus spp. — у 27,3%, Staphylococcus spp. у 27,3% и Candida spp. у 9% обследованных (рис.3.5).
Из данных, представленных в табл. 3.1 видно, что медицинский персонал специализированного стационара имеет более высокий уровень носительства большинства микроорганизмов в носоглотке. Этот факт может свидетельствовать о том, что у пациентов происходит подавление нормальной назофарингеальной микрофлоры под воздействием антибиотиков широкого спектра действия, которые они получают для лечения основного заболевания — туберкулеза.
Общая распространенность носительства микроорганизмов в исследуемых группах представлена в табл. 3.2.
Из представленных данных видно, что отсутствие носительства условно-патогенных микроорганизмов в верхних дыхательных путях наблюдается лишь у 5,9±2,7% пациентов, несмотря на длительное применение антибиотиков широкого спектра действия с целью лечения туберкулеза. Также этот показатель низок и у персонала, хотя у них отсутствуют такие факторы риска как сниженный иммунный статус, длительный прием антибиотиков.
Это свидетельствует о необходимости проведения дополнительной целенаправленной антибиотикотерапии при сопутствующих инфекционных инфекциях дыхательных путей, и специфической иммунопрофилактики как у пациентов, так и у персонала клиники.
Распространенность носительства различных видов условно-патогенных микроорганизмов среди пациентов и медперсонала ПДККТБ представлена в табл. 3.3.
Из данных таблицы следует, что уровень носительства достаточно высок, и лидирует в этой структуре S. pneumoniae, который встречается в среднем у 34,9±2,2% человек. Носительство других видов рода Streptococcus и рода Staphylococcus составляет 24,1% и 21,3% соответственно. Распространенность Candida spp. так же достаточно велика и составляет 14,2±3,5%. Acinetobacter haumanii и Haemophylus influenzae в данном исследовании встречались только у детей, в 7% всех случаев носительства.
Большое количество сопутствующих инфекционных заболеваний, вызванных условно-патогенной микрофлорой, свидетельствует о значительном угнетении иммунитета у детей с внелегочными формами туберкулеза. Высокий уровень носительства штаммов S. pneumoniae среди медицинского персонала обосновывает необходимость проведения у них специфической профилактики пневмококковых инфекций. Медперсонал может являться своеобразным резервуаром для циркуляции штаммов пневмококка внутри больницы и причиной заражения вновь поступающих детей.
Изучение серотипового состава штаммов S. pneumoniae с помощью ПЦР
Для определения серотипов исследуемых штаммов и гена cpsA, ответственного за синтез полисахарида капсулы, мы использовали метод Multiplex PCR. Были использованы праймеры к серотипам 3, 4, 6, 14, 19А, 19F, 23F, входящим в состав как отечественной 23-валентной, так и зарубежной 11-валентной вакцины. Праймеры, специфичные для гена cpsA, убиквитарного компонента генома капсульного типа пневмококка, включались во все реакции Multiplex ПЦР. В аналогичных исследованиях эти праймеры также используются для положительного контроля, поскольку абсолютное большинство пневмококков, выделяемых из клинического материала, имеют капсулу.
При изучении серотипового состава штаммов, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией, выявлено, что среди них преобладают серотипы 3, 19А (по 22,7%о) и серотип 6 (13,6%), реже встречается серотип 23F (9,1% ) и серотипы 4, 14 и 19F (по 4,6%). 18,1%) штаммов относились к иным серотипам, исследование которых не входило в план данного исследовнаия. Результаты представлены на рисунке 4.6.
При исследовании штаммов стрептококка, выделенных у персонала противотуберкулезной больницы, было установлено, что 25,0%) штаммов имеют серотип 3 и 19А, 12,5% - серотип 6 и 23F, серотип 25% штаммов определить не удалось. Как и в первой группе преобладают серотипы 3 и 19А, составляя 45,4% от всего числа исследованных штаммов (рис. 4.7).
Из приведенных данных видно некоторое сходство серотипового состава штаммов, полученных у пациентов и персонала противотуберкулезной больницы. Это еще раз подтверждает тот факт, что в стационаре могут сформироваться и циркулировать штаммы пневмококка, способные инфицировать как детей, находящихся на лечении, так и медицинский персонал.
Серотип 3, наиболее часто встречающийся среди обеих групп, является высоковирулентным и чаще вызывает осложненные формы пневмококковой инфекции.
Среди штаммов контрольной группы преобладают пневмококки серотипа 6В (25% ), серотипы 3 и 19А встречается в 15% случаев, серотип 23F - 10%), по 5% - серотипы 19F, 4, 14. 20% штаммов принадлежат другим серотипам, не определяемым данным методом (рис. 4.8).
На рисунках 4.9. и 4.10. представлены данные по серотиповой характеристике штаммов пневмококков, выделенных у всех трех исследуемых групп. Видны различия в составе серовариантов первой группы (штаммы, выделенные у детей, больных туберкулезом) и третьей группы (штаммы, выделенные у здоровых носителей). В первой и второй группе превалирует серотип 3 и 19А (22,7-25,0%)), в третьей - серотип 6В (25% ).
Известно, что серотип 3 наиболее вирулентный, и поэтому представляет собой большую эпидемиологическую опасность.
При анализе генотипового состава всех трех выборок с помощью критерия согласия Пирсона (Хи-квадрат), проводились попарные сравнения групп «дети, болеющие туберкулезом - контрольная группа» (1 - 3), «медперсонал - контрольная группа» (2-3), «дети, болеющие туберкулезом - медперсонал» (1 - 2).
Группа 1 - 3 имеет х2 = 4,59, при 9 степенях свободы для р = 0,05 табличное значение х2 = 16,92, а для р = 0,01 х2 = 21,67.
Группа 2-3 имеет х2 = 0,20, при 8 степенях свободы для р = 0,05 табличное значение х2 = 15,51, а для р = 0,01 х2 = 20,09.
Группа 1 - 2 имеет х2 s 4,59, при 9 степенях свободы для р = 0,05 табличное значение х2 = 16,91, а для р = 0,01 х2 = 21,66.
Статистически значимых различий по серотипам между исследуемыми группами не наблюдается.
При проведении метода ПЦР с праймерами для гена cps выявлено, что из 50 изучаемых штаммов амплификация не прошла в 4,0% случаев, что означает наличие мутации гена или отсутствие всего локуса cps. Поскольку видовая принадлежность этих штаммов доказана другими молекулярно-генетическими методами, можно утверждать, что эти пневмококки принадлежат к безкапсульному типу. Один из этих штаммов представлен на рисунке 4.2, дорожка 9. Такой тип редко выделяется из клинического материала, однако, учитывая, что оба безкапсульных штамма получены от детей, болеющих туберкулезом и принимающих большое количество антибактериальных препаратов, возможно, что данный вид мутации возник именно под воздействием используемых в химиотерапии данных пациентов антибиотиков.
Геноварианты штаммов S. pneumoniae по сочетанию генов, кодирующих факторы вирулентности, серотипового разнообразия и чувствительности к антимикробным препаратам
Для выявления возможных закономерностей и обобщения всех полученных результатов был проведен анализ совокупности изученных генетически детерминированных признаков (серотипы, факторы вирулентности, чувствительность к антибиотикам) у штаммов S. pneumoniae во всех исследованных группах в специализированном и соматическом стационарах.
На основе данных, полученных с помощью молекулярно-генетических методов, были составлены комбинированные геноварианты всех исследованных штаммов.
Обобщение генотипов штаммов пневмококка, выделенных у детей, болеющих туберкулезом (специализированный стационар), позволило установить наличие различных вариантов их сочетания (табл. 6.1).
При исследовании частоты встречаемости перечисленных комбинированных генотипов, обнаружено, что чаще всего выявляется штамм генотипа 133 (13,6%), который относится к серотипу 3 и имеет все изучаемые факторы вирулентности (пневмолизин, аутолизин, адгезии А, капсулу) и высокую степень устойчивости к макролидам и фторхинолонам.
Штаммы с генотипами 156 (серотип 6, все факторы вирулентности, высокая степень устойчивости к фторхинолонам и макролидам), 1219А (серотип 19А, все факторы вирулентности, умеренная устойчивость к фторхинолонам, высокая устойчивость к макролидам, устойчивость к рифампицину), 1723F (серотип 23F, все факторы вирулентности, высокая степень устойчивости к макролидам), 540 (неопределенного серотипа, присутствуют детерминанты пневмолизина и аутолизина, отсутствуют детерминанты адгезина и капсулы, умеренная устойчивость к фторхинолонам, высокая устойчивость к макролидам) встречаются в 9,1% случаев каждый (табл. 6.2).
В группе, штаммов, выделенных у медицинского персонала специализированного, стационара, получены комбинации геновариантов, представленные в табл. 6:3.
Чаще всего встречается комбинированный генотип 133 (серотип 3, все факторы вирулентности, умеренная устойчивость к фторхинолонам, высокая устойчивость к макролидам) - в 25% случаев. Обращает на себя внимание тот факт, что штамм с такими же характеристиками выделен и у пациентов. Штаммы с генотипами 590 (серотип не определен, отсутствуют гены, отвечающие за синтез адгезина и капсулы, умеренно устойчивы к фторхинолонам и макролидам - уровень резистентности 1-32 мкл/мл), 156 (серотип 6, все факторы вирулентности, высокая степень устойчивости к фторхинолонам и макролидам) и 1519А (серотип 19А, все факторы вирулентности, умеренная устойчивость к фторхинолонам, высокая степень устойчивости к макролидам) так же встречаются в среди штаммов, выделенных у детей, болеющих туберкулезом (табл. 6.4).
Генетический профиль у 10% штаммов представлен следующими комбинированными геновариантами: 176 (серотип 6, все факторы вирулентности, высокая степень устойчивости к макролидам), 1919А (серотип 19А, все факторы вирулентности, умеренная устойчивость к фторхинолонам, высокая устойчивость к макролидам - до 64 мкл/мл), 1723F (серотип 23F, все факторы вирулентности, высокая степень устойчивости к макролидам) и 163 (серотип 3, все факторы вирулентности, резистентность к макролидам и фторхинолонам на высоком уровне). Штаммы комбинации геновариантов 1723F встречается и среди штаммов, выделенных у детей, больных туберкулезом (табл. 6.6).
При анализе генотипового состава всех трех выборок с помощью критерия согласия Пирсона (х2 ), проводились попарные сравнения групп «дети, болеющие туберкулезом — контрольная группа» (1 - 3), «медперсонал - контрольная группа» (2-3), «дети, болеющие туберкулезом - медперсонал» (1-2).
Группа 1 - 3 имеет х2 = 71,06, при 29 степенях свободы для р = 0,05 табличное значение х2 = 42,56, а для р = 0,01 х2 = 49,59.
Группа 2-3 имеет х2 = 1,89, при 8 степенях свободы для р = 0,05 табличное значение х2 = 15,51, а для р = 0,01 х2 = 20,09.
Группа 1 - 2 имеет х2 30,68, при 18 степенях свободы для р = 0,05 табличное значение х2 = 28,97, а для р = 0,01 х2 = 34,81.
Значения х2 Для группы «дети, болеющие туберкулезом - контрольная группа» свидетельствуют о том, что наблюдаемые частоты генотипов пневмококков у этих групп значительно отличаются и могут быть объяснены только случайными причинами с вероятностью менее 1%, то есть различия между ними высоко достоверны.
Из данных таблицы видно, что генотип 156 встречается во всех исследуемых группах. Его характеристики: серотип 6, все факторы вирулентности, высокая степень устойчивости к фторхинолонам и макролидам. Штаммы с генотипом 1723F (серотип 23F, все факторы вирулентности, высокая степень устойчивости к макролидам) присутствуют среди полученных как у пациентов специализированного стационара, так и у детей в контрольной группе.
Комбинация геновариантов 133 (серотип 3, в наличии все факторы вирулентности, умеренная устойчивость к фторхинолонам, высокая устойчивость к макролидам), 590 (серотип не определен, отсутствуют гены, отвечающие за синтез адгезина и капсулы, умеренно устойчивы к фторхинолонам и макролидам -уровень резистентности 1-32 мкл/мл) и 1519А (серотип 19А, все факторы вирулентности, умеренная устойчивость к фторхинолонам, высокая степень устойчивости к макролидам) встречается как среди штаммов, выделенных у пациентов, так и у медперсонала специализированного стационара (рис.6.1).
Обращают на себя внимание общие черты в составе и генотиповых характеристиках штаммов пневмококка в двух изучаемых группах - детей, болеющих туберкулезом (пациентов ПДККТБ) и медицинского персонала. Можно сделать вывод, что среди этих групп, долгое время находящихся в замкнутом коллективе, циркулируют госпитальные штаммы, имеющие высокую вирулентность и резистентные к антибиотикам широкого спектра действия, в том числе и к рифампицину - антибиотику, применяемому для лечения тяжелых инфекционных заболеваний (сочетания геновариантов 1119А и 1219А).
Такие штаммы в первую очередь опасны для детей - пациентов противотуберкулезных стационаров, у которых нарушены факторы защиты организма, что может привести к развитию тяжелых инфекций, не поддающихся лечению современными антибактериальными препаратами. Опасны они и для медицинского персонала данных стационаров, постоянно находящегося в контакте с больными, особенно при возникновении вторичного иммунодефицита. Все эти факторы окончательно подтверждают необходимость назначения антибактериальных препаратов, основанного на результатах микробиологического мониторинга, и коррекции антибактериальной химиотерапии при помощи микробиологических исследований.
Полученные данные обосновывают необходимость проведения специфической иммунопрофилактики групп риска, в частности пациентов и персонала специализированного стационара.
![Этиологическая роль кампилобактеров в структуре острых бактериальных кишечных инфекций у детей в Таджикистане [Электронный ресурс]](/i/i/4703/193414.png "Этиологическая роль кампилобактеров в структуре острых бактериальных кишечных инфекций у детей в Таджикистане [Электронный ресурс] Ахмедова Гульнора Махмуджановна")
