Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 27
1.1. История изучения и общая характеристика пневмококков . 27
1.2. Пневмококковые инфекции и серотиповое разнообразие пневмококка . 31
1.3. Антибиотикорезистентность пневмококка и генетические механизмы устойчивости к бета-лактамам и макролидам . 36
1.4. Генетическое разнообразие пневмококков 42
Результаты исследования 46
Глава 2. Спектр циркулирующих серотипов пневмококка 46
Глава 3. Молекулярное типирование чистой культуры S. pneumoniae с помощью мультиплексной ПЦР 51
Глава 4. Анализ антибиотикорезистентности пневмококка и изучение молекулярных механизмов устойчивости к макролидам и генотипов полирезистентных штаммов 56
Глава 5. Детекция ДНК бактериальных отопатогенов в жидкости среднего уха у детей с острым средним отитом с использованием ПЦР в реальном времени 64
Заключение 70
Выводы 77
Практические рекомендации 78
Перспективные направления дальнейшей разработки темы 78
Список сокращений 79
Список литературы
- Пневмококковые инфекции и серотиповое разнообразие пневмококка
- Генетическое разнообразие пневмококков
- Анализ антибиотикорезистентности пневмококка и изучение молекулярных механизмов устойчивости к макролидам и генотипов полирезистентных штаммов
- Практические рекомендации
Пневмококковые инфекции и серотиповое разнообразие пневмококка
Впервые пневмококк наблюдал Л. Пастер, который обнаружил бактерию в слюне больного бешенством, что натолкнуло его на предположение о причастности пневмококка к заболеванию [130]. Однако от этой гипотезы пришлось отказаться, т.к. идентичные бактерии определялись и у здоровых людей. Этиологическая роль S. pneumoniae при пневмонии была впервые показана в 1886 г. немецким врачом А. Френкелем. Это произошло на заре развития иммунологии, когда многие инфекции пытались лечить антисыворотками, полученными путем иммунизации животных соответствующими бактериальными продуктами. «Диплококк Френкеля» (бактериальные клетки этого возбудителя в большинстве располагаются парами) получил название Streptococcus pneumoniae (пневмококк) и стал одним из главных объектов подобных экспериментов, поскольку пневмония в то время была среди основных причин смерти. Было обнаружено, что животные, которым вводили мокроту больных пневмонией, приобретали устойчивость к последующему заражению, а сыворотка больных пневмонией предотвращала развитие пневмококковой инфекции [53].
Эти данные стимулировали многих врачей и микробиологов к поиску новых способов лечения пневмонии при помощи специфических сывороток. Одним из таких ученых был немецкий бактериолог Фред Нейфельд (Fred Neufeld), который в начале 20-ого века впервые разделил пневмококки на серотипы с помощью типоспецифических антисывороток. Это наблюдение заложило основу для последующих исследований, нацеленных на борьбу с пневмококковой инфекцией, включая открытие природы типоспецифических капсульных антигенов пневмококка (они относятся к полисахаридам) и создание эффективных пневмококковых поливалентных полисахаридных вакцин [45; 53].
В своих работах для серотипирования S. pneumoniae Ф. Нейфельд использовал метод набухания (нем. quellung) капсулы. Он основан на том, что при добавлении к взвеси бактерий сыворотки, содержащей антитела против капсульных полисахаридов данного серотипа пневмококка, происходит склеивание и резкое увеличение (набухание) капсулы, которое хорошо видно под микроскопом (Рисунок 4). Методика с использованием реакции набухания капсулы под названием «реакция Нейфельда» (в англоязычной литературе часто употребляется термин quellung reaction) до сих пор остается основным методом серотипирования пневмококка и считается «золотым стандартом» дифференцировки пневмококков, а при разработке новых методов типирования стандартизация проводится с использованием именно реакции набухания капсулы.
Примечание: Слева – отрицательная реакция, справа – положительная реакция. Фазово-контрастная микроскопия, ув. х 1000 (собственные данные).
К настоящему времени в соответствии с особенностями капсульных полисахаридов описано более 90 серотипов пневмококка. На данный момент предложены 2 номенклатурные системы: американская и датская. В американской системе произведена порядковая нумерация серотипов, основанная на времени их первого описания, без учета способности к перекрестному реагированию. Согласно международной диагностической схеме, разработанной в Дании (Serum Staten Institute), сформировано 46 групп антигенно-родственных серотипов с номерами от 1 до 48 (номера 26 и 30 в данной классификации не используются), демонстрирующие перекрестную реактивность. Они обозначаются цифрами и буквами и объединяются в одну группу (серогруппа). Таким образом, 91 серотип распределяется между 21 серогруппой, каждая из которых представлена 2-5 серотипами, близкими по антигенной структуре, и 25 серологически однородными капсульными типами [96; 101].
Пневмококки представляют собой овальные или ланцетообразные кокки, располагаются парами; окрашиваются положительно по Граму, величиной около 1 мкм. Каждая пара бактерий окружена толстой капсулой, обнаруживаемой при помощи окраски эозином.
Строение клеточной стенки S. pneumoniae типично для грамположительных бактерий. Её основой является пептидогликан со встроенными углеводами, тейхоевыми кислотами, липопротеинами и поверхностными белками. Для пневмококков дополнительно характерно наличие мощной полисахаридной капсулы, которая выполняет защитную функцию, препятствуя опсонизации и последующему фагоцитозу. На простых питательных средах пневмококки обычно растут в виде коротких цепочек, неподвижны и не образуют спор. Развитие капсулы стимулирует внесение крови, сыворотки или асцитической жидкости в питательную среду. Пневмококки – это аэробы или факультативные анаэробы, при культивировании предпочтительны капнофильные условия (5-10% СО2), хорошо растут на кровяных или сывороточных средах, дополненных 0,1% глюкозы при температурном оптимуме 37С. Они чувствительны к изменениям рН питательной среды, оптимум рН составляет 7,8. На жидких средах пневмококки дают равномерное помутнение и небольшой хлопьевидный осадок; при длительном культивировании осадок увеличивается. На агаре образуют нежные полупрозрачные четко очерченные колонии около 1 мм диаметром, напоминающие росинки, иногда они могут быть плоскими с центральным углублением (Рисунок 5). На специальных питательных средах, например, на кровяном агаре, колонии окружает зона альфа-гемолиза в виде зеленоватой обесцвеченной зоны, сходной с наблюдаемой при росте на кровяном агаре зеленящего стрептококка (Streptococcus viridans) [20].
Генетическое разнообразие пневмококков
Закономерности возникновения, эволюции и распространения резистентных пневмококков отражаются в их генетическом разнообразии. С целью унификации подходов к изучению генетической структуры пневмококковой популяции было предложено использовать метод мультилокусного сиквенс-типирования (МЛСТ) [98]. Он основан на определении нуклеотидной последовательности (секвенировании) консервативных фрагментов нескольких генов «домашнего хозяйства», отвечающих, как правило, за метаболизм бактерий и не кодирующих факторы вирулентности и патогенности. Эти гены подвержены случайному мутагенезу, изменения в них постепенно накапливаются и являются маркерами генетического расстояния между различными клонами бактерий, что позволяет устанавливать степень филогенетического родства между популяциями и систематизировать их. МЛСТ пневмококка предполагает секвенирование фрагментов 7 генов «домашнего хозяйства» (aroE, gdh, gki, recP, spi, xpt, ddl). Каждому аллелю присваивается уникальный номер, который позволяет отождествлять аллели, выявленные в разных лабораториях. Данные о последовательностях накапливаются в единой базе данных PMEN (Pneumococcal Molecular Epidemiology Network), доступной в сети Интернет. Аккумулируя глобальную информацию о результатах МЛСТ во всех регионах мира, PMEN с помощью биоинформационных ресурсов позволяет определять генетически линии и кластеры пневмококков [58; 78; 113]. Это дает возможность выявлять эволюционные связи в бактериальных популяциях, группировать отдельные последовательности в сиквенс-типы (sequence type, ST) и клональные комплексы (clonal complex, CC), объединенные общими предшественниками [22].
Данные МЛСТ, накопленные в базе PMEN, свидетельствуют о том, что популяция глобально циркулирующих пневмококков является клональной. Клональность особенно выражена среди резистентных пневмококков, которые относятся к ограниченному числу клонов [95]. Среди наиболее важных из них, ответственных за глобальное распространение антибиотикорезистентности в 1980-1990-х гг., были клоны Spain23F-ST81, Spain6B-ST90, Spain9V-ST156, England14-ST9,
Taiwan19F-ST236 и ряд других [102]. После начала вакцинации ПКВ7 распространенность большинства клонов, имевших вакцинный серотип, стала снижаться [34; 100]. Однако влияние вакцинации с особой яркостью подчеркнуло высокую способность пневмококка к генетической рекомбинации. Так, полирезистентный серотип 19А, относящийся к СС320 и получивший глобальное распространение в пост-ПКВ7 периоде, является двухлокусным вариантом пневмококка Taiwan19F-ST236, имевшего капсулу ПКВ7-серотипа 19F [106]. Анализ эволюционного ответа пневмококковой популяции на вакцинацию показал, что использование ПКВ7 привело к отбору предсуществовавших невакцинных капсульных вариантов пневмококка, среди которых оказались клоны с резистентным генотипом, подобные 19А-изолятам СС320 [47].
Немногочисленные исследования генетического разнообразия инвазивных резистентных пневмококков на территории РФ показали присутствие глобальных клональных комплексов, включая СС81, СС156, СС315 и СС320 [22; 23; 120]. Обнаружение представителей СС320 с серотипом 19А еще до начала вакцинации ПКВ в РФ свидетельствует о необходимости постоянного мониторинга популяционного состава пневмококков для прогнозирования эффективности используемых вакцин [23].
Таким образом, обзор современной литературы, посвященной пневмококку и пневмококковым инфекциям, свидетельствует об актуальности исследуемой темы. Отечественные публикации по этим проблемам немногочисленны и нередко описывают ограниченное число наблюдений, что не позволяет в некоторых случаях делать надежные выводы. В то же время, именно региональные данные крайне важны для понимания тенденций сероэпидемиологии и резистентности пневмококков на конкретной территории. Несмотря на то, что резистентность – это общемировая проблема, ее истоки лежат прежде всего на местном уровне. Первичная селекция и распространение резистентных штаммов микроорганизмов происходит в отдельных популяциях, затем устойчивые клоны могут распространиться на значительные территории, преодолевая границы государств и континентов. Идентификация устойчивости к антибиотикам, описание географии и динамики распространения резистентных штаммов имеют большое теоретическое и практическое значение, поскольку дают возможность улучшить практику использования существующих антибактериальных препаратов и профилактировать возникновение резистентности. Изучение сероэпидемиологии пневмококка с описанием актуального серотипового состава поможет прогнозировать эффективность вакцинопрофилактики пневмококковых инфекций, а также даст информацию, необходимую для создания следующих поколений ПКВ.
Анализ антибиотикорезистентности пневмококка и изучение молекулярных механизмов устойчивости к макролидам и генотипов полирезистентных штаммов
Молекулярные маркеры бактериальных возбудителей были исследованы непосредственно в образцах ЖСУ 311 пациентов с ОСО (Таблица 13). Для этого полученную из ЖСУ ДНК последовательно амплифицировали с помощью ПЦР со специфическими праймерами для четырех выбранных отопатогенов (S. pneumoniae, S. pyogenes, H. influenzae и M. catarrhalis).
У всех пациентов параллельно с ПЦР проводили классическое микробиологическое исследование. Доля положительных результатов при ПЦР была статистически значимо выше доли положительных результатов при микробиологическом исследовании [70% (218/311) против 30% (93/311), р 0,001] (Таблица 13). Таким образом, с помощью ПЦР удается выявить отопатоген дополнительно у 40% пациентов с ОСО. Прирост числа положительных результатов при ПЦР дали все исследованные патогены, однако, наиболее часто обнаруживался S. pneumoniae (+108 пациентов), что повысило его долю в структуре возбудителей ОСО с 67% (62/93) при культуральном исследовании до 78% (170/218) при ПЦР (Таблица 14). ПЦР с праймерами для S. pneumoniae, S. pyogenes и M. catarrhalis дали положительный результат у всех пациентов, у которых указанные возбудители были выявлены микробиологическим методом, а в случае отрицательного ПЦР-исследования культуры также были отрицательны (Таблица 14). У 9 пациентов с бактериологически подтвержденным H. inluenzae-ассоциированным ОСО результаты ПЦР оказались отрицательными. При этом у 7 пациентов с положительной ПЦР на H. inluenzae был отрицательный культуральный результат по этому возбудителю, а у 4 пациентов положительные результаты обоих методов совпали (Таблица 14).
ЖСУ для исследования получали двумя способами: при процедуре тимпаноцентеза или после спонтанного прорыва барабанной перепонки. Сведения о способе получения ЖСУ были получены для 92% (287/311) пациентов с ОСО. Доля положительных результатов при ПЦР в материале тимпаноцентеза и при спонтанном прорыве барабанной перепонки статистически не отличались (69% (127/185) против 72% (73/102), p=0,606) (Таблица 15). Положительные результаты культурального исследования в обоих материалах также встречались примерно с одинаковой частотой [тимпаноцентез – 31% (58/185) против спонтанный прорыв – 30% (31/102), p=0,866]. Доли возбудителей как при ПЦР-исследовании, так и при микробиологическом анализе не зависели от способа получения материала (р=0,688 и р=0,558 соответственно). Таким образом, способ получения ЖСУ не влиял на результаты ПЦР-детекции и культурального выявления исследованных отопатогенов.
Далее мы оценили влияние приема антибиотиков, предшествующего взятию материала, на частоту положительных результатов детекции отопатогенов с помощью ПЦР и микробиологического анализа, а также на спектр микрофлоры. Информация об использовании антибактериальных препаратов была доступна у 90% (280/311) пациентов, из которых 22% (62/280) получили 1 и более дозу антибиотика до взятия биоматериала, а остальные 78% (218/280) пациентов не получали антибиотиков.
Прием антибиотиков значимо снижал долю образцов ЖСУ с положительным культуральным результатом с 37% (80/218) до 18% (11/62) (p=0.005) (Таблица 15). На фоне приема антибиотиков резко уменьшалась доля пациентов, у которых высевался S. pneumoniae, а именно с 69% (55/80) до 46% (5/11). При этом возрастала частота выявления S. pyogenes – с 16% (13/80) до 27% (3/11).
Частота выявления этиологического агента при ОСО сильно варьирует в зависимости от критериев диагноза ОСО, чувствительности используемых методов детекции возбудителя, преаналитических факторов при лабораторном исследовании и др. Наиболее высокие результаты дает сочетание строгих отоскопических критериев ОСО и нанесения материала непосредственно на питательную среду сразу после получения ЖСУ, когда доля положительных культур может достигать 80-90% [90]. Однако большинство исследований, приближенных к реальной клинической практике, сообщает число положительных культур при ОСО в пределах 39-52% [55; 66; 92; 119]. В связи с этим наиболее значимым является выделение и идентификация патогенов непосредственно из образца. Развитие молекулярных методов, основанных на ПЦР, в частности ПЦР в реальном времени, имеют значительные преимущества в скорости и чувствительности. Данный метод позволяет проводить детекцию продуктов амплификации в процессе реакции и вести мониторинг кинетики накопления ампликонов. Наше исследование показало, что частота выявления бактериальных отопатогенов методом ПЦР-РВ увеличивается до 70%, что согласуется с предыдущими исследованиями, где частота обнаружения отопатогенов при ОСО колебалась в пределах от 68% до 90% [51; 79; 81; 91].
Одной из причин отрицательного результата при культуральном исследовании может служить прием антибактериальных препаратов до взятия образца. В нашем исследовании более 1/3 пациентов получили одну и более доз антибиотиков до микробиологического анализа, что привело к статистически значимому снижению частоты выявления положительных культур в этой группе до 18%. При этом возрастала пропорция стерильных культур и культур с нормофлорой, что согласуется другими публикациями [127]. Однако антибиотики не оказывали значимого влияния на частоту выявления отопатогенов методом ПЦР. Обнаружение бактериальной ДНК из культуры отрицательных образцов методом ПЦР в некоторых случаях можно объяснить недавно полученной антибиотикотерапией, гибелью бактерий во время транспортировки, и/или низким количеством организмов в образце.
Таким образом, выявление и идентификация возбудителей молекулярными методами, не зависящими от жизнеспособности микроорганизмов, является перспективным направлением современной микробиологии, дальнейшее развитие которого поможет уточнению этиологического спектра ОСО.
Практические рекомендации
Резистентные штаммы принадлежали ограниченному числу серотипов, среди которых выделялись серотипы 6В, 14, 19А и 19F. Наиболее резистентными оказались 19А-пневмококки, которые обладали выраженной генетической гетерогенностью. Штаммы серотипа 19А принадлежали к четырем клональным комплексам, включая СС63, СС156, СС230 и СС320, связанным с глобальными клонами Sweden15A-25, Spain9V-3, Denmark14-32 и Taiwan19F-14 соответственно. Всего при анализе клонального родства 26 полирезистентных изолятов S. pneumoniae методом МЛСТ было выявлено 14 различных сиквенс-типов, входящих в 7 клональных комплексов. Самым распространенным стал клональный комплекс СС320, связанный с глобальным клоном Taiwan19F-14. Отметим, что 19А-пневмококки, принадлежащие к клональному комплексу СС320, стали наиболее значимыми возбудителями инвазивных пневмококковых инфекций только в пост-ПКВ7 периоде [74; 106]. Циркуляция таких штаммов на территории РФ в отсутствие вакцинации ПКВ отражает, вероятно, эволюционный прессинг нерационального использования антибиотиков. Таким образом, наши данные в очередной раз демонстрируют необходимость проведения постоянного мониторинга за распространенностью антибиотикорезистентных штаммов пневмококков и изучения их генетической принадлежности в целях совершенствования эмпирической антибактериальной терапии.
В последние годы в клинической микробиологии все более широко используются молекулярно-генетические методы исследования. Они применяются для идентификации микроорганизмов и механизмов их резистентности к антибиотикам, причем как в чистой культуре, так и в клинических образцах. Разработаны подходы для определения серотиповой принадлежности и генотипических характеристик микробов при помощи молекулярных технологий. В своем исследовании для типирования пневмококка мы модифицировали мультиплексную ПЦР, которая позволяет определить серотип у 95% циркулирующих в РФ неинвазивных штаммов пневмококков, а также все серотипы, включенные в состав существующих ПКВ. Компоновка ПЦР с учетом распространенности серотипов у нас в стране позволила добиться типирования 90% штаммов уже с помощью первых трех ПЦР из мультиплексного набора, состоящего из семи реакций. При этом сопоставление результатов классического и молекулярного типирования показало совпадение результатов в 99% случаев. Полученные данные указывают на надежность молекулярного метода, что делает возможным его внедрение в рутинную практику в качестве адекватной и доступной альтернативы классическому серологическому типированию пневмококка.
Серологическое типирование по-прежнему остается «золотым стандартом» дифференцировки пневмококков. Этот метод основан на определении капсульного варианта пневмококка с помощью специфических антисывороток в реакции агглютинации на стекле, латексной агглютинации и/или реакции набухания капсулы по Нейфельду, в основе которого лежит наличие антигенных различий в строении капсульных полисахаридов S. pneumoniae [84]. К недостаткам метода можно отнести трудоемкость, большую стоимость сывороток, субъективизм при интерпретации результатов, высокие требования к персоналу и т.п. Отсутствие производства отечественных пневмококковых сывороток, экспериментальные образцы которых использовались для серотипирования пневмококков в 1990-х гг. [7;8; 27; 114], в условиях ограниченных финансовых возможностей для закупки импортных реагентов фактически остановило исследовательскую работу в этом направлении, и в течение 20 лет данные о серотиповом составе S. pneumoniae обновлялись медленно. В связи с этим молекулярное серотипирование пневмококка с помощью ПЦР, в основе которого лежит несколько несложных манипуляций и объективная оценка результатов, без сомнения, получит широкое распространение в микробиологической практике. В сочетании с улучшением диагностических алгоритмов это будет способствовать формированию объективных представлений о частоте пневмококковых инфекций и реальном серотиповом спектре пневмококка, а значит способствовать повышению эффективности их вакцинопрофилактики.
Методы молекулярной микробиологии с использованием, в частности, ПЦР в реальном времени имеют значительные преимущества в скорости получения результата и чувствительности, позволяя определять единичные копии в исследуемом образце. В нашей работе мы изучили возможности данного метода для этиологической диагностики ОСО у детей и определения места S. pneumoniae в структуре бактериальных возбудителей при данной инфекции. ОСО является распространенным заболеванием у детей и служит одной из самых частых причин обращения за медицинской помощью и использования антибиотиков в детском возрасте [105;140]. Наиболее значимыми бактериальными отопатогенами считают S. pneumoniae и нетипируемую H. influenzae, на долю которых приходится до 60-80% микробиологически подтвержденных случаев ОСО [26; 44; 125; 139]. К менее значимым патогенам относят M. catarrhalis и S. pyogenes, хотя с последним связывают более тяжелые формы инфекции и повышенный риск развития осложнений [9; 129; 139]. В большинстве исследований, приближенных к реальной клинической практике, приводится доля положительных культуральных результатов при ОСО в пределах 39–52% [55; 66; 92; 119]. Частота обнаружения отопатогенов с помощью ПЦР может быть существенно выше, превышая обычно 70-80% [63; 118].
Результаты настоящего исследования подтвердили высокую чувствительность ПЦР для обнаружения бактериальной ДНК в образцах из ЖСУ. Доля положительных результатов достигала 70%, тем самым увеличившись на 40% по сравнению с традиционным культуральным методом, признанным в качестве "золотого стандарта ". Такая картина может быть обусловлена тем, что результат ПЦР не зависит от жизнеспособности бактерий, поэтому транспортировка и прием антибиотиков перед сбором биоматериала не являются лимитирующими факторами. Действительно, наше исследование показало, что прием антибиотика не оказывал значимого влияния на результаты ПЦР-анализа. Таким образом, выявление и идентификация возбудителей молекулярными методами, не зависящими от жизнеспособности микроорганизмов, является перспективным направлением современной
![Этиологическая роль кампилобактеров в структуре острых бактериальных кишечных инфекций у детей в Таджикистане [Электронный ресурс]](/i/i/4703/193414.png "Этиологическая роль кампилобактеров в структуре острых бактериальных кишечных инфекций у детей в Таджикистане [Электронный ресурс] Ахмедова Гульнора Махмуджановна")
