Введение к работе
Актуальность проблемы. Инфекции, этиологическим фактором которых является Haemophilus influenzae, приобретают все более актуальный характер и относятся к числу наиболее распространенных среди детей во всех странах мира. Ранее считалось, что H.influenzae (палочка Афанасьева–Пфейффера) играет роль в респираторной патологии, однако исследования последних десятилетий показали, что этот микроорганизм является причиной многих гнойно-септических заболеваний. По данным ВОЗ, во всех странах мира регистрируются заболевания, вызываемые H.influenzae, как у детей, так и у взрослых (Vaccines and Biology, 2002). Рост числа инфекций, вызванных H.influenzae, сопровождается изменением спектра заболеваемости, утяжелением течения ранее известных и появлением новых клинических форм с летальным исходом.
Наибольшее значение в патологии человека имеют капсульные серологические варианты (серовары) типа «b» (Hib), вызывающие разнообразные клинические проявления, нередко приводящие к инвалидизации заболевших. Инфекции, обусловленные H.influenzae, разделяют на острые, при которых этот микроорганизм является первичным возбудителем, и хронические, при которых он, по-видимому, играет вторичную роль. Острые инфекции включают менингит, сепсис и гнойно-септические заболевания с локальными воспалительными проявлениями местного характера.
В нашей стране истинная распространенность инфекций, вызванных H.influenzae, остается невыясненной. По мнению многих авторов, именно несовершенство лабораторной диагностики H.influenzae–инфекции, приводит к снижению истинных показателей заболеваемости. В отечественной литературе описаны, в основном, гнойные менингиты и эпиглотиты. Противоречивые выводы содержат результаты исследования этиологии пневмоний, вызванных H.influenzae, у детей (Девяткина Н.П. с соавт., 1989; Таточенко В.К., 1998; Демина А.А., 1998; Королева И.С., 2003; 2004; Сорокина М.Н с соавт., 2003; Катосова Л.К. с соавт., 2005; Покровский В.И.,2005). Настороженность вызывает отсутствие сведений о заболеваемости и распространении других нозологических форм гнойно-септических инфекций, вызванных разными серологическими вариантами H.influenzae, у детей.
Практически отсутствуют доступные тест-системы для изучения гуморального иммунитета, сероидентификации культур; не решена проблема производства питательных сред. Для диагностики инфекций, вызванных разными фенотипами H.influenzae, требуются достоверные методы микробиологических исследований, разработка и внедрение которых необходимы для полноценного мониторинга этих инфекций, лечения и профилактики.
Цель исследования — разработать новые, провести сравнительную оценку существующих методов для повышения информативности микробиологических исследований и на этой основе определить частоту инвазивных, первично-локализованных инфекций, вызываемых H.influenzae, у детей.
Задачи исследования
-
Усовершенствовать способ получения типоспецифических сывороток к капсульным сероварам «а», «b», «с», «d», «e» и «f» для конструирования диагностических тест-систем.
-
Разработать и практически внедрить питательные среды для выделения H.influenzae, определить методические особенности контроля качества питательных сред для выделения H.influenzae, установить перечень свойств для подготовки тест–штамма.
-
Разработать и оценить диагностическую значимость тест–систем иммунофементного анализа (ИФА) для определения антигенов серовара «b» в ликворе (спинномозговой жидкости) и других биосубстратах.
-
Оценить возможности использования и диагностическую значимость различны методов микробиологического исследования инфекций, вызванных инвазивными H.influenzae.
-
Выявить частоту инвазивных, первично–локализованных инфекций и назофарингиального носительства, вызванных различными фенотипическими вариантами H.influenzae, у детей Среднего Урала.
-
Изучить распространеннность капсульных сероваров «а», «b», «с», «d»,«е», «f», нетипируемых штаммов, различных биоваров, их значение при первично-локализованных и инвазивных инфекциях.
-
Определить резистентность штаммов, выделенных при инвазивных и первично–локализованных инфекциях, вызванных H.influenzae к антибиотикам различных классов.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Предложенные модификации приготовления питательных сред, методов их контроля, разработанная тест-система ИФА для выявления антигенов, в том числе капсульного полисахарида «b», обеспечивают ускоренную диагностику инвазивных и верификацию этиологического диагноза первично- локализованных инфекций, вызванных H.influenzae.
2. Фенотипы капсульных и бескапсульных штаммов, выделенных при первично-локализованных, инвазивных инфекциях и со слизистой носоглотки детей существенно отличаются.
3. Целесообразно дифференцированное использование серологической диагностики для верификации инфекций, вызванных сероваром «b» и нетипируемыми вариантами H.influenzae.
4.Выявленные изменения фенотипов резистентности к антибиотикам за исследуемый период не существенны, в то время как у нетипируемых штаммов и штаммов серовара «b», существуют различия в резистентности к различным классам антимикробных препаратов.
Научная новизна
Впервые разработаны способ и питательная среда для выделения H.influenzae со слизистой носоглотки (патент № 2186389 от 27 июля 2002 г., патент №21936000 от 27 ноября 2002 г.), двухфазная среда ЭрДС – для выделения из стерильных полостей, ЭрДС-агар – для выделения из нестерильных локусов (заявка № 2006139958 от 18.10.2006г.)
Определены методические критерии оценки тест-штамма для бактериологического контроля качества питательных сред, предназначенных для выделения H.influenzae из клинического материала.
Сконструированы отечественные тест–системы ИФА для выявления антигенов H.influenzae серовара «b».
Определена частота инфекций и назофарингеальной колонизации, вызываемых сероварами «a», «b», «c», «d», «e», «f» и биоварами I–VIII H.influenzae.
Осуществлено серологическое и биологическое типирование выделенных со слизистой носоглотки штаммов H.influenzae, вызывающих инвазивные и первично-локализованные инфекции.
Определена частота инвазивных и первично-локализованных форм инфекций, вызванных различными фенотипами H.influenzae, у детей Среднего Урала.
Проведено многоцентровое проспективное исследование назофарингеального носительства H.influenzae у больных и здоровых детей в детских коллективах.
Определена резистентность штаммов H.influenzae, выделенных в Свердловской области, к разным классам антимикробных препаратов.
Практическая значимость работы заключается в получении данных, расширяющих представление о роли H.influenzae, не только серовара «b», но и других сероваров и биоваров при гнойно-септических инфекциях у детей. Полученные диагностические препараты позволяют выявить среди капсульных изолятов серовары, которые могут вызывать различные формы инфекций. Разработанные способы приготовления и контроля качества питательных сред с использованием доступных ингредиентов позволяют выделять H.influenzae из клинического материала в лабораториях любого уровня. Разработанные латексные препараты для сероидентификации H.influenzae позволяют определить серовариант у капсульных штаммов. Предложенная схема исследования материала из стерильных полостей позволяет быстро и качественно выявить возбудитель. Определение биовара позволяет выявить потенциально патогенные биовары среди штаммов H.influenzae.
Полученные данные о резистентности H.influenzae к антибактерильным препаратам позволяют назначать рациональную этиотропную антибактериальную терапию. Практическая значимость работы подтверждена использованием её материалов в образовательных программах на теоретических, практических занятиях и семинарах профессиональной переподготовки при последипломном обучении врачей. Результаты определения резистентности штаммов H.influenzae включены в российский реестр резистентности возбудителей инфекций к антимикробным препаратам.
Внедрение результатов работы. По теме работы получено 2 патента на изобретения – «Транспортная среда для выделения Haemophilus influenzae из носоглоточной слизи» (патент № 21936000 от 27.11.2002 г.) и «Способ культивирования Haemophilus influenzae из носоглоточной слизи» (патент № 2186389 от 27.06.2002 г.). Подана заявка на изобретение «Питательная среда для выделения H.influenzae и способ её приготовления» - №2006139958 от 18.10.2006 г. Подготовлены методические рекомендации – «Лабораторные методы выделения, идентификации Haemophilus influenzae» (Екатеринбург, 1999), «Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Haemophilus influenzae» (Смоленск, 2003). «Внебольничная пневмония у детей, пособие для врачей-педиатров» (Екатеринбург, 2004), «Лабораторные методы выделения, идентификации, определения чувствительности к антибиотикам Haemophilus influenzae» (Екатеринбург, 2006).
Результаты исследований внедрены в лабораториях клинической микробиологии лечебно-профилактических учреждений Министерства здравоохранения Свердловской области, используются в учебном процессе курсов профессиональной переподготовки и тематического усовершенствования для врачей- бактериологов факультета повышения квалификации и последипломной подготовки Уральской государственной медицинской академии, в исследовательской работе лабораторного отдела Уральского НИИ дерматовенерологии и иммунопатологии, Уральского НИИ фтизиопульмонологии (Екатеринбург).
Полученные диагностические препараты применены в лаборатории менингококковой инфекции и гнойных менингитов Центрального НИИ эпидемиологии МЗ РФ, выделенные штаммы представлены для исследования по программе «Пегас I и II» для составления реестра резистентности штаммов Н.influenzae к антибиотикам в России.
Апробация работы
Материалы работы доложены на научно-практической конференции «Актуальные вопросы эпидемиологии, клиники, диагностики и профилактики инфекции, вызываемой Н.influenzae типа «b» (Москва, 1998), на научно-практической конференции «Национальные дни лабораторной медицины» (Москва, 1999), на Всероссийской научно-практической конференции «Перинатальная анестезиология и интенсивная терапия матери, плода и новорожденного» (Екатеринбург, 1999), на 9 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Берлин, Германия,1999), на научно-практической конференции Западно-Уральского региона «Вакцинопрофилактика в ХХI веке» (Пермь, 2000), на Юбилейной научно-практической конференции «Роль лабораторной диагностики в современных медицинских технологиях» (Екатеринбург, 2000), на II международной конференции «Антибиотики и антибиотикорезистентность на пороге XXI века» (Москва, 2000), на международной научно-практической конференции «Разработка и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем», посвященной 50-летию НПО «Питательные среды» (Махачкала, 2003), на V международной конференции по антимикробной химиотерапии (Москва, 2003), на IV межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы обеспечения санитарно- эпидемиологического благополучия населения» (Омск, 2003г), на III Уральской конференции «Болезни органов дыхания» (Екатеринбург, 2003г), на Юбилейной конференции, посвященной 80-летию кафедры микробиологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова «Современная микробиология – клинической медицине и эпидемиологии» (Санкт-Петербург, 2003), на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология -ХХI век» (Саратов, 2004), на первой Российской конференции «Актуальные проблемы менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов» (Москва, 2004), на заседаниях Свердловского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И.Мечникова (Екатеринбург, 2006) , на VIII международной конференции по антибактериальной химиотерапии (Москва, 2006), на межкафедральном совещании в Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (Санкт-Петербург, 2007).
Публикации
По результатам исследований опубликовано 96 печатных работ, из них 16 – в журналах, одобренных ВАК.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 372 страницах машинописного текста и состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов. Указатель литературы включает 141 источник на русском языке и 471 на иностранных языках. В текст включены 22 таблицы и 62 рисунка.
