Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
Глава 1. ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ГЕМОФИЛЬНЫХ 10
ИНФЕКЦИЙ И ВОЗМОЖНОСТИ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ
-
Эпидемиология заболеваний, вызываемых И. influenzae Ь 10
-
Вакцины, применяемые для профилактики гемофильных инфекций 14
Глава 2. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Я. INFLUENZAE В 19
-
Полноценные питательные среды 19
-
Синтетические питательные среды 22
-
О полусинтетических питательных средах и компонентах питательных
сред, влияющих на синтез капсульного полисахарида Н. influenzae b 33
ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 40
Глава 1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 40
-
Штаммы И. influenzae b, использованные в работе 40
-
Питательные среды 42
-
Полноценная питательная среда 42
-
Синтетические питательные среды 42
-
Полусинтетическая питательная среда на основе аминопептида 46
1.3. Процессы культивирования 48
1 А. Методы анализа процессов культивирования 48
-
Методы изучение динамики накопления биомассы 48
-
Методы изучения динамики накопления капсульного полисахарида в
культуральной жидкости 49
1.5. Методы статистической обработки результатов 51
Глава 2. ИЗУЧЕНИЕ ДИНАМИКИ РОСТА И СИНТЕЗА КАПСУЛЬНОГО ПОЛИСАХАРИДА ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ШТАММОВ
Я. INFLUENZAE В В СИНТЕТИЧЕСКОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ 53
Глава 3. ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ СИНТЕТИЧЕСКОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ НА РОСТ И СИНТЕЗ КАПСУЛЬНОГО
ПОЛИСАХАРИДА Я. INFLUENZAE В 60
Глава 4. РАЗРАБОТКА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ НА ОСНОВЕ
АМННОПЕПТИДА 69
-
Изучение влияния внесения в среду на основе амннопептида глутаминовой кислоты, урацила, инозина и глютатиона на рост Я influenzae Ъ и синтез капсульного полисахарида 70
-
Влияние изменения концеїгграции аминопептида на рост Я influenzae Ь и синтез капсульного полисахарида 15
-
Изучение влияния повышенных концентраций НАД и гемина при различном содержании в питательной среде аминопептида на рост
Я influenzae Ь и синтез капсульного
полисахарида 78
4.4. Динамика роста и синтеза капсульного полисахарида Я influenzae Ь
штамма № б в полусинтетической питательной среде на основе аминопептида
при масштабировании процесса культивирования 84
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 89
ВЫВОДЫ 104
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 105
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ЛАЛ-тест - тест для определения количества эндотоксина на основе лизата амебоцита
Limulus polyphemus
НАД - никотинамидадениндинуклеотид
ОП530- оптическая плотность культуры при 530 нм
ПРФ - полирибозилрибитофосфат
ПС — капсульний полисахарид Н. Influenzae Ъ
ФСБ - фосфатно-солевой буферный раствор
С-ЯМР - ядерно-магнитная резонансная спектроскопия Hib - Haemophilus influenzae Ь
Введение к работе
Актуальность проблемы. Haemophilus influenzae тип Ь (Hib) вызывает менингит, пневмонию, септицемию, эпиглоттит, остеомиелит и септический артрит. Первое место по частоте возникновения среди перечисленных заболеваний занимает менингит [81]. Группой риска для гемофильных инфекций являются дети в возрасте до пяти лет [55, 58, 64, 65, 72]. Во всем мире Hib приводит к заболеванию трех миллионов детей, семьсот тысяч из которых погибают [101].
Эпидемиологическая значимость гемофильных инфекций подтверждена в большинстве стран Европы, Америки и ряде государств Африки [7S, 81]. В России ввиду отсутствия общедоступных методов диагностики официальная регистрация случаев гемофильных инфекций не проводилась. Однако даже отдельные исследования частоты гнойных бактериальных менингитов и осложненных пневмоний, обусловленных Hib, проведенные в ряде городов Европейской части России, позволили оценить важность гемофильной инфекции в нашей стране. Высокая частота бактерионосительства, способствующая распространению гемофильной инфекции, тяжесть протекания заболеваний, множественность их осложнений, полирезистентность Hib к большинству применяемых в практике антибиотиков указывают на необходимость вакцинопрофилактики [8.П].
Установлено, что капсульный полисахарид НІЬ - полирибозилрибитолфосфат (ПРФ) определяет вирулентные свойства бактерий и позволяет микроорганизмам преодолевать воздействие неспецифических механизмов защиты макроорганизма [53, 75]. ПРФ является антигеном и способен индуцировать иммунный ответ, однако иммунитет формируется по Т-независимому типу [86]. В то же время, до 18 месячного возраста, В-лимфоциты ребенка недостаточно зрелы для того, чтобы сформировать адекватный иммунный ответ без участия Т-лимфоцитов. Для обеспечения полноценного иммунного ответа у детей младшего возраста
ПРФ конъюгиругот с белком-носителем, что придает полисахариду свойства Т-зависимого антигена. [85]. Показана высокая эффективность коныогированных вакцин у детей первых месяцев жизни [46,47, 84].
С 1986 года вакцинация против Hib введена в обязательный календарный план прививок в 38 странах [81]. К 2001 году уже 90 стран стали применять вакцину против гемофильных инфекций. В настоящее время поставлена задача включения вакцинации против Hib в национальный календарь прививок в пятидесяти наиболее развитых странах, где доказан высокий уровень заболеваемости [91].
В России вакцина против инвазивных Hib-заболеваний не производится. Вместе с тем вакцина «Акт-ХИБ» (Авентис Пастер, Франция) сертифицирована и разрешена к применению на территории России. Доказана ее высокая эффективность и безопасность [2,4, 18,39].
Для разработки высокочувствительных наборов как для диагностики возбудителя, так и для оценки поствакцинального иммунитета и, тем более, для производства вакцины, необходимы стандартные методы культивирования Н. influenzae Ь, позволяющие получать достаточное количество капсульного полисахарида высокой степени очистки.
Капсульный полисахарид в процессе роста культуры //. influenzae b накапливается в среде культивирования [41]. Поэтому, согласно требованиям ВОЗ, для получения капсульного полисахарида следует, по возможности, избегать выращивания H.influenzae b в питательных средах, содержащих высокомолекулярные продукты животного происхождения [99].
Традиционно культивирование Hib для получения капсульного полисахарида осуществляют в полноценных питательных средах. Среда с казаминовыми кислотами и дрожжевым экстрактом (Difco, США), по данным литературы, позволяет получать достаточное количество капсульного полисахарида [73]. Однако для производства отечественной вакцины и диагностических препаратов необходима доступная по цене питательная среда, обеспечивающая высокую скорость роста Hib и синтеза капсульного полисахарида.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы являлась оценка влияния отдельных компонентов питательной среды на рост и синтез капсульного полисахарида И. influenzae b. Задачи исследования:
Оценить скорость роста и уровень синтеза капсульного полисахарида различных штаммов Я. influenzae b при их культивировании в синтетических питательных средах известного состава.
Изучить влияние исключения из состава синтетической питательной среды отдельных аминокислот на рост штаммов //. influenzae Ъ и синтез капсульного полисахарида.
Подобрать составы синтетической и полусинтетической питательных сред для культивирования И. influenzae Ъ и получения капсульного полисахарида.
Выбрать штамм //. influenzae Ь, обладающий минимальными потребностями в аминокислотах и максимальной скоростью роста и синтеза капсульного полисахарида при культивировании в синтетической питательной среде.
Научная новизна работы
1. Различные штаммы И. influenzae Ъ обладают высокими скоростями роста и синтеза капсульного полисахарида при культивировании в синтетической питательной среде известного состава [Herrioi R.M et al., 1970], предназначенной для бескапсульного штамма Н, influenzae,
1. Исключение из состава многокомпонентной синтетической питательной среды серина, глицина, лизина, метионина, лейцина, тирозина и снижение концентрации инозина до 500 мг/л не приводят к снижению скорости роста и синтеза капсульного полисахарида большинства изученных штаммов.
3. Показана возможность использования аминопентида в качестве единственного источника аминокислот и нуклеозидов в составе полусинтетической питательной среды для культивирования Я. influenzae b и получения капсульного полисахарида.
4, Синтез капсульного полисахарида И. influenzae Ь зависит от концентраций аминопептида, НАД и гемина.
Практическая ценность
Выбран штамм Н. influenzae b, обладающий максимальной скоростью роста и наибольшим накоплением капсульного полисахарида (более Ї50 мг/л) при росте в синтетической питательной среде, что позволяет рекомендовать его в качестве штамма -продуцента капсульного полисахарида. Штамм депонирован в коллекцию ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича МЗ РФ под № 267 (02.07.2003).
Модифицирована жидкая синтетическая питательная среда Herriot, культивирование в которой обеспечивает высокую скорость роста и синтеза капсульного полисахарида большинства изученных штаммов Н. influenzae b.
Разработан состав полусинтетической питательной среды, содержащей аминопептид в качестве единственного источника аминокислот и нуклеозидов, который позволяет при культивировании Н. influenzae b получать более высокий выход капсульного полисахарида, чем в полноценной питательной среде - сердечно-мозговом бульоне. Подана заявка о выдаче патента РФ на изобретение № 2003126461, приоритетная справка от 1 сентября 2003 года.
Основные положения, выносимые на защиту
Отобран, охарактеризован и селекционирован штамм //. influenzae b, обладающий высоким уровнем синтеза капсульного полисахарида и высокой скоростью роста при культивировании в синтетической питательной среде.
Ряд аминокислот (серии, глицин, лизин, метионин, тирозин и лейцин) не является необходимым для роста и синтеза капсульного полисахарида Я influenzae Ь.
При использовании аминопептида в качестве единственного источника аминокислот и нуклеозидов в составе полусинтетической питательной среды синтез капсульного полисахарида Я influenzae Ь зависит от концентраций аминопептида, никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и гемина.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 3 работы в центральной печати.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2001). Диссертация апробирована на научной конференции отдела иммунохимических методов исследований ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2003).
Объем и структура диссертации
Материалы диссертации изложены на 115 страницах машинописного текста, иллюстрированы 13 рисунками и 16 таблицами, состоят из введения, обзора литературы, 4 глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы, включающего 101 источник.
