Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 9
1.1. Вода в клетках микроорганизмов 9
1.2. Термодинамическая характеристика состояния почвенной влаги 12
1.3. Влияние влажности на различные группы микроорганизмов 16
1.4. Пределы влажности для выживания разных групп живых организмов24
1.5. Приспособление микроорганизмов к условиям низкой влажности 26
1.6. Влияние свойств жидкой фазы почв на микроорганизмы и их развитие
1.7. Микробная порча продуктов питания при разных влажностях 43
Экспериментальная часть 50
ГЛАВА II. Объекты и методы исследований 50
2.1. Объекты исследований 50
2.2. Методы исследования
2.2.1. Методика приготовления моноспоровой суспензии 55
2.2.2. Методика приготовления сухих спор 56
2.2.3. Методика опытов на стеклах без питательной среды 56
2.2.4. Методика опытов на стеклах, покрытых тонким слоем агаризованной среды 57
2.2.5. Методика опытов с почвой 58
2.2.6. Методика определения свободной воды в лиофильно высушенных клетках Streptomyces odorifer 62
ГЛАВА III. Результаты исследований 65
3.1. Прорастание спор и рост мицелия актиномицетов при различной влажности, определение предела влажности прорастания спор 65
3.2. Развитие актиномицетов на стеклах, покрытых агаризованной питательной средой 68
3.3. Развитие актиномицетов в почве
3.4. Определение свободной воды в лиофильно высушенных клеткахStreptomyces odorifer 108
Обсуждение результатов 109
Заключение 115
Выводы 117
Список литературы
- Влияние влажности на различные группы микроорганизмов
- Влияние свойств жидкой фазы почв на микроорганизмы и их развитие
- Методика опытов на стеклах без питательной среды
- Развитие актиномицетов на стеклах, покрытых агаризованной питательной средой
Введение к работе
Актуальность проблемы. Способность микроорганизмов к росту и развитию определяется увлажненностью среды их обитания, характеризующейся энергетическим состоянием воды: ее давлением (Р, мегапаскалей) или активностью (aw). Энергетическое состояние воды является важным фактором, влияющим на способность микроорганизмов к росту и развитию. Традиционно существовало мнение, что прокариоты более требовательны к давлению влаги (Р), чем эукариоты, и большинство из них могут развиваться лишь при давлении влаги, большем -4 мегапаскалей (МПа), (aw > 0,95). Большинство грибов также нуждаются в довольно высокой влажности, лишь некоторые из них способны развиваться при Р = -70 МПа (aw 0.60) (Griffin, 1969, Dix, Webbster, 1995). В многочисленной литературе, касающейся способов хранения продуктов (зерна, муки, хлебобулочных и мясных изделий и т.д.), приводятся сведения о том, что оптимальным условием хранения продуктов является активность воды aw 0.40. Ксерофильные виды грибов {Aspergillus chevalieri, Asp. canidus, Wallemia sebi) способны развиваться на патоке, сухофруктах, орехах при aw 0.65-0.75. Осмофильные дрожжи (Saccharomyces rouxii, Saccharomyces bisporus) и некоторые виды плесеней {Asp. echinulatus, Monascus bisporus) развиваются и вызывают порчу сухофруктов, содержащих 15-20 % влаги, меда, карамели (aw 0.60-0.65). (Нечаев и др, 2003). Также во многих работах приводятся экспериментальные доказательства выживания микроорганизмов в условиях низкого уровне давления влаги (aw 0.1 - 0.5) (Laroche, Gervais, 2003; Pogoda de la Vega, Rettberg, Reitz, 2007; Wierchos etc, 2011).
Актиномицеты, являясь активными гидролитиками, продуцентами биологически активных веществ, обладая мицелиальным строением и апикальным ростом, составляют активное звено сапротрофных организмов почв аридных районов (Звягинцев, Зенова, 2001). По сравнению с другими бактериями, мицелиальные актинобактерии (актиномицеты) более устойчивы к высушиванию почв (Калакуцкий, Агре, 1977). Однако вопрос о том, определяется ли широкое распространение актиномицетов в почвах аридных территорий способностью мицелия развиваться при низкой влажности или устойчивостью спор к высушиванию, до настоящего времени остается открытым. Недавно Дорошенко Е.А. (Дорошенко и др., 2005) удалось обнаружить, что актиномицеты могут (хотя и очень медленно) развиваться даже при aw 0.50. Однако эти данные получены по-прежнему оставалось неясным, способны ли они развиваться при таком уровне увлажненности естественных почв. Поэтому весьма актуальными являются выявление нижнего допустимого предела увлажненности почв, при котором актиномицеты еще способны развиваться, и определение характерных параметров циклов их развития при различных уровнях увлажненности.
Поэтому целью работы явилось определение закономерностей развития актиномицетов при различных уровнях давления влаги не только на стеклах и искусственной питательной среде, но и в естественной почве.
Задачи исследования
-
Разработка методических приемов исследования способности прорастания спор и прохождения полного цикла развития актиномицетов (от споры до образования спор новой генерации) на агаризованной питательной среде и в почве.
-
Установление предельных значений уровня давления влаги для прорастания спор актиномицетов S. odorifer и S. pluricolorescens.
-
Определение закономерностей прорастания спор, роста мицелия, прохождения стадий жизненного цикла Streptomyces odorifer и S. pluricolorescens в тонком слое агаризованной среды. Эти стрептомицеты были отобраны как наиболее приспособленные к жизни при низкой увлажненности среды среди многих исследованных штаммов предыдущих экспериментах.
-
Определение интенсивности прорастания спор, роста мицелия и прохождения стадий жизненного цикла S. odorifer и S. pluricolorescens в почве.
5. Определение наличия свободной воды в лиофильно высушенных спорах
актиномицетов, находящихся в условиях низкого давления влаги.
Научная новизна. Впервые определен нижний предел увлажненности среды соответствующий aw 0.48 для прорастания спор актиномицетов (S. odorifer и S. pluricolorescens) на чистых стеклах. При более низкой увлажненности среды (aw 0.32 -0.43) споры актиномицетов не прорастали.
Впервые установлено, что при давлении влаги Р -104.8 МПа (aw 0.48) в тонком слое агаризованной питательной среды споры ксеротолерантных стрептомицетов (Streptomyces odorifer и S. pluricolorescens) прорастают, проростки увеличиваются в длину, а через 5 суток отмечается латеральное ветвление мицелия. При Р -26.7 МПа (aw 0.84) мицелий ветвится уже через 2 суток, а при Р -3.6 МПа (aw 0.98) за 5 суток проходит полный цикл развития актиномицета от прорастания споры до образования новых спор. Динамика прорастания спор подчиняется экспоненциальному закону, позволяющему вычислять время, необходимое для прорастания 50% жизнеспособных спор (to,50 = 24,2 часа) и среднюю продолжительность жизни спор до прорастания (S = 34,5 часа) в искусственной питательной среде.
Впервые установлено, что в бурой полупустынной почве при давлении почвенной влаги (Р) - 104.8 МПа (aw 0.48) в условиях лабораторного эксперимента споры ксеротолерантного штамма Streptomyces odorifer прорастают, проростки увеличиваются в длину, образуя мицелий, из которого затем формируются споры новой генерации (таким образом, осуществляется полный цикл развития актиномицета от спор до образования новых спор). Споры S. pluricolorescens в условиях эксперимента при активности воды aw 0.48 прорастали, но образовавшийся мицелий лизировался и споры новой генерации не образовывались.
Продолжительность первых циклов развития актиномицетов варьировала от 13 суток при Р -3.6 МПа до 57 суток при Р -104.8 МПа и была прямо пропорциональной абсолютной величине давления почвенной влаги (Р). В течение первых циклов развития актиномицетов скорости прироста концентрации проросших спор и мицелия (а также и логарифмы отношений концентрации мицелия к концентрации проросших спор) находились в обратной линейной зависимости от логарифма Р. Существование этих функциональных зависимостей свидетельствует о том, что именно энергетическое состояние влаги определяет ее доступность почвенной биоте и, следовательно, активность протекающих в ней физиологических и биохимических процессов.
Установленные факты позволяют считать, что жизнедеятельность мицелиальных актинобактерий (актиномицетов) может осуществляться при экстремально низкой увлажненности и в питательной среде и в естественных почвах.
Практическая значимость. Полученные результаты существенно расширяют существовавшие ранее представления об экологии актиномицетов и их роли в почвах аридных зон. В диссертации разработаны методические подходы для исследования прорастания спор и роста мицелия актиномицетов при различных уровнях увлажненности как в искусственных средах, так и в естественных почвах.
Результаты работы могут найти применение в области биотехнологии, пищевой промышленности, сельскохозяйственной биологии, медицины, астробиологии. Результаты исследования используются в курсах лекций «Биология почв» и «Строение, развитие и экология актиномицетов» для студентов факультета почвоведения МГУ имени М.В .Ломоносова.
Апробация работы. Основные положения работы доложены на международных конференцях: VI Съезда Общества почвоведов имени В.В.Докучаева (Петрозаводск, 2012); «European Geosciences Union General Assembly 2011» (Vienna, Austria, 2011); на VII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2010» (Москва, 2010); на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009); на V Всероссийском съезде общества почвоведов (Ростов-на-Дону, 2008), на заседаниях кафедры биологии почв факультета почвоведения Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.
Публикации. Материалы проведенных исследований изложены в 9 печатных работах, в том числе в 3 статьях, опубликованных в рецензируемых журналах согласно списку ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, заключение и выводы. Работа изложена на страницах текста, содержит иллюстраций и таблиц. Список литературы включает наименований, в том числе на иностранных языках.
Влияние влажности на различные группы микроорганизмов
Вода является самым распространенным веществом на Земле. Вода играет огромную роль в жизни живых организмов. В их клетках содержится до 80% воды, она является основой всех биохимических процессов, происходящих в организме. Жизнь клетки, любые проявления обмена веществ клетки в целом и ее отдельных структур возможны только в присутствии воды.
В живых клетках вода служит средой, в которой молекулы разных размеров взаимодействуют между собой. Структура воды, в которой находятся растворенные вещества, контролирует все жизненно важные процессы в клетке: действие ферментов и регуляцию их активности, ассоциацию и диссоциацию органелл, структуру мембран и их функционирование.
Вода является уникальным веществом в биологических системах благодаря ряду специфических свойств. Уникальные свойства определяются структурой ее молекул. В молекуле воды один атом кислорода образует две ковалентные полярные связи с двумя молекулами водорода. Молекула изогнута под углом: в вершине угла находится атом кислорода, а по краям -атомы водорода. Поскольку электроны притягиваются сильнее к кислороду, чем к водороду, молекулы воды полярны (Кемп, Арме, 1988). Вода имеет максимальную плотность при 4 С. У воды высокая теплота испарения (539 кал/г) и величина плавления (80 кал/г). Также у воды высокие величины поверхностного натяжения, внутреннего давления и диэлектрической постоянной (D=80) (Бекер и др. 1981).
Молекулы воды являются диполями и благодаря этому способны образовывать водородные связи между собой. Это делает воду хорошим растворителем для веществ, имеющих полярные молекулы, в том числе большинства ионных соединений. Но с другой стороны водородные связи сохраняют специфическую структуру воды обуславливают появление 3 типов эффектов, которые непосредственно влияют на формирование структуры важнейших биополимеров и на вопросы функционирования.
К первому типу эффектов относится изменение конформации макромолекул за счет включения молекул воды в структуру биополимеров и вместо прямых связей образованием водородных между участниками цепи или разными цепями, входящих в состав надмолекулярной структуры. Этот тип взаимодействия участвует в стабилизации структуры фибриллярных биополимеров, в том числе ДНК и коллагена.
Ко второму типу эффектов воды в биологических структурах относятся гидрофобные взаимодействия. Эти взаимодействия играют большую роль в стабилизации глобулярных белков (Хипполь, Шлейх, 1973).
К третьему типу эффектов относится возможность передачи заряда в биологических системах по структуре воды на расстояния, включая использование островков «льдоподобной» структуры воды вокруг макромолекул биополимеров.
Данные эффекты обуславливают исключительные свойства воды как участника биологических реакций и как среды (Аксенов, 1990). Вода уникальна среди множества жидкостей еще и тем, что сохраняет в жидком состоянии специфическую структуру благодаря образованию до 4 водородных связей (Аксенов, 1978).
Вода обладает высокой теплоемкостью, благодаря этому вода действует в клетках как тепловой буфер, сводящий к минимуму все температурные изменения. Протекание биохимических процессов в меньшем интервале температур, с более постоянной скоростью, ведет к снижению опасности нарушения этих процессов от резких отклонений температур (Ленинджер, 1985).
Можно выделить основные функции, которые вода выполняет в клетке: 1. Вода выступает в роли химического реагента в клетке, вступает в химические реакции гидролиза и конденсации. 2. Вода служит растворителем для метаболитов клеточного пула, концентрация которых играет важную роль в метаболической регуляции. 3. Вода обеспечивает тургор клеток, поддерживая гироскопическое давление внутри клеток. 4. Вода выполняет структурную функцию, обеспечивает гидратацию белка и других клеточных компонентов за счет образования водородных связей с полярными группами (Перт, 1987). 5. Вода образует дисперсную фазу сложных растворов органических и неорганических веществ, не встречается в виде чистого вещества в клетках.
Вода может принимать несколько модификаций в зависимости от температуры: 1. Вода, которая образуется ща счет водородных связей. 2. Структура льда, которая образуется при температуре ниже 4 С. 3. Вода, структура которой аналогична структуре кварца. Такая вода преобладает при обычных температурах. 4. Вода с более плотной упаковкой молекул. Такая вода преобладает при высоких температурах. В живых клетках выделяют свободную и связную воду. Связной водой называют такую воду в биологических объектах, которая вступает в прочное взаимодействие с компонентами объекта и плохо удаляется при сушке. По литературным данным, «связная вода» имеет отличительные от обычной воды свойства: труднее испаряется, не замерзает при температурах до -80С, является плохим растворителем, находится как бы под давлением и больше напоминает твердое тело, чем жидкость (Аскоченская, Петинов, 1972).
О количестве связной воды в объектах судят по калориметрическим характеристикам, изменению диэлектрической постоянной, давлению водяных паров и данным, полученным с помощью метода ядерного магнитного резонанса (ЯМР). В биомассе микроорганизмов содержится 15-20% связной воды (Бекер и др. ,1981).
При обезвоживании сначала удаляется свободная вода, при этом концентрация внутриклеточных компонентов возрастает во много раз (в 2 - 5 раз), а это изменяет скорость биохимических реакций. Поэтому не удивительно, что длительное (24 часа) пребывание микроорганизмов в условиях оптимальной температуры при влажности 20-40%) приводит к гибели значительной части микробной популяции.
Все описанное выше указывает на исключительную роль воды в клетке живых организмов. Подробное и разностороннее изучение влияния воды на микроорганизмы, механизмов адаптации микроорганизмов к водному стрессу дает возможность управления процессами, протекающими в клетке, что имеет огромное значение для таких отраслей как биотехнология, медицина, сельское хозяйство.
Влияние свойств жидкой фазы почв на микроорганизмы и их развитие
Как среда обитания для микроорганизмов почва сильно отличается от искусственных питательных сред. В первую очередь потому, что почва - это трехфазная система с очень развитой твердой поверхностью, которая непосредственно связана с жидкой и газовой фазами. Рассмотрим подробнее влияние свойств почвенной влаги на микроорганизмы. Давление почвенной влаги зависит от многих факторов, в то время как в жидкой среде оно обусловлено только концентраций растворенных веществ (Шеин, 2005).
При взаимодействии с почвой молекулы воды подвергаются действию сил различной природы, которые ограничивают движение воды и изменяют энергетическое состояние воды. Это влияние оказывают силы, которые возникают на поверхности раздела жидкой, твердой и газообразной фаз в почве, а также наличие растворенных веществ в почвенном растворе, температура, гравитационные силы, внешнее атмосферное давления.
В почве вода может находиться в капиллярах и в тонких пленках. В тонких пленках давление влаги определяется силами взаимодействия твердой и жидкой фаз на поверхности их раздела, величина которого достигает -300 атм и ниже. Такое давление существует в парах воды в воздухе, относительная влажность которого равна 80%. При более высокой влажности давление почвенной влаги определяется строением диффузного слоя ионов около поверхности твердой фазы. Давление влаги при данных условиях может находиться в интервале от -10 до -200 атм (от 100 до 88% ОВВ) (Шеин, 2005).
В засоленных почвах высокие концентрации солей в почвенном растворе приводят к сжатию диффузного слоя ионов, поэтому основная часть воды удерживается осмотическими силами, которые достигают до -60 атм (Судницын, 1995). Вода в засоленных почвах образует свободный раствор при более высоком давлении влаги равном - 30 атм. В этом диапазоне на давление влаги в почве оказывает большое влияние поверхностное давление и капиллярное давление, которое развивается в капиллярах почвы. Давление в капиллярных менисках находится в обратной зависимости от эффективного радиуса пор, определяемого гранулометрическим составов почв, их агрегированностыо, плотностью, характером и наличием гумусовых веществ и кристаллов солей, которые заполняют поры и выстилают поверхность твердой фазы (Судницын, 1999). Для определения и выражения столь разных по направлению и величине факторов на энергетическое состояние воды используют величину давления влаги. Она выражает удельную потенциальную энергию воды в почве относительно чистой воды на уровне сравнения (Воронин, 1986; Шеин, 2005). Для оценки энергетического состояния воды в почве применяют химический потенциал воды - парциальную или удельную свободную энергию Гиббса (Воронин, 1986).
В зависимости от степени связанности с почвенными твердыми частицами и, следовательно, от доступности почвенными микроорганизмам и растениям воду в почве можно подразделить на несколько категорий:
Адсорбированная прочносвязанная влага (гигроскопическая влага) представляет собой тонкий слой воды, который образуется непосредственно около поверхности твердых частиц почвы, удерживается мощными силами взаимодействия до тысячи атмосфер. Под действием таких сил вода сорбируется из воздуха на поверхности твердых почвенных частиц, приобретает устойчивую структуру, тепловое движение ее молекул значительно замедляется (Воронин, 1986; Шеин, 2005, Судницын 1979). Есть предположение, что вода при этом имеет у поверхности глинистых частиц квазиклисталлическую структуру, которая повторяет в общих чертах структуру поверхности частиц (Воронин, 1986). Пленка гигроскопической влаги покрывает почвенные твердые частицы и гидрофильные участки клеток микроорганизмов. Слой гигроскопической влаги в сотни раз меньше микробной клетки (Звягинцев, 1973). Однако многие микроорганизмы развиваются при гигроскопической влажности и даже ниже. Наибольшее количество воды, связанное почвой, называется максимальной адсорбционной влагоемкостыо (МАВ) (Воронин, 1986; Шеин, 2005, Судницын, 1979).
. Пленочная рыхлосвязанная влага представляет собой более толстые пленки около твердых почвенных частиц. Толщина данных пленок может колебаться от долей микрометров до десятка или даже нескольких десятков микрометров. Для пленочной влаги характерна несколько повышенная вязкость и меньшая диэлектрическая проницаемость в сравнении со свободной водой (Воронин, 1986). Такая влага удерживается почвенными частицами уже с меньшей силой в отличие от прочносвязанной воды и может служить средой и местом обитания для большого числа микроорганизмов (Звягинцев, Зенова, 2001, Звягинцев, 1970). При максимальном содержании пленочной воды (максимальная молекулярная влагоемкость - ММВ) влага переходит в пленочно-капиллярную.
Пленочно-катшлярпая влага образуется при еще большем увеличении влаги в почве, когда уже появляются капиллярные мениски. При такой влажности для результирующего давления определяющее значение имеют капиллярные силы (Воронин, 1986; Шеин, 2005). Такая вода является еще более доступной и служит местом обитания для большинства почвенных микроорганизмов, с легкостью может быть использована растениями. Влажность почвы, при которой происходит переход между пленочно-капиллярной и капиллярной водой называется максимальная катшлярно-сорбцнонная влагоемкость (МКСВ) (Воронин, 1986). МКСВ как правило хорошо совпадает с полевой (общей или наименьшей) влагоемкостыо в том случае, когда горизонт, в котором определяют эту величину, не подстилается малопроницаемыми плотными горизонтами или слоями почвы.
Методика опытов на стеклах без питательной среды
При низкой влажности воздуха -104.8 МПа (aw 0.48) споры исследуемых стрептомицетов в тонком слое агаризованнои среды не только прорастали, но увеличивалась длина проростков. Наиболее интенсивно увеличивалась длина мицелия Streptomyces odorifer. К 120 ч. длина мицелия этого штамма составляла 14 мкм. S. pluricolorescens рос медленнее. У S. odorifer наблюдалось к 120 ч. опыта обильное боковое ветвление мицелия. А)
Динамика прорастания спор стрептомицетов в условиях давления влаги воздуха воздухе: а) - 104.8 МПа (aw 0.48); в) -26.7 МПа (aw 0.84); с) - 3.6 МПа (aw 0.98). 1- S. odorifer, 2- S. pluricolorescens. В целом динамика прорастания спор двух штаммов стрептомицетов при различных уровнях увлажнения окружающей среды однотипна: в начале опыта интенсивность их прорастания максимальна, но затем она постепенно уменьшалась, асимптотически приближаясь к концу опыта (через 120 часов) к весьма малым значениям, близким к нулю.
Это позволяет предположить, что динамика прорастания спор подчиняется строгим закономерностям. Поиску подобных закономерностей были посвящены работы Хаттори. Ему впервые удалось (основываясь на статистическом распределении Пуассона) теоретически вывести уравнение, описывающее динамику появления бактериальных колоний на питательных средах. П.А.Кожевин (Кожевин, 1989) подтвердил высокую репрезентативность этого уравнения, полностью совпадающего с уравнениями, описывающими кинетику химических реакций 1-го порядка, а также динамику распада радиоактивных элементов (Дмитриев, 1995 ).
При соблюдении ряда условий эти уравнения легко выводятся и без помощи статистического распределения Пуассона. Эти условия следующие. Во-первых, объекты, изменяющие свое состояние (в данном случае -микроорганизмы), должны быть идентичными, чтобы вероятность изменения состояния (например, деления клеток или прорастания спор) каждого из этих объектов была одинаковой. Во-вторых, эта вероятность должна быть постоянной в течение опыта. В-третьих, объекты не должны воздействовать друг на друга. И, в-четвертых, их количество должно быть достаточно большим, чтобы обеспечить получение достаточно точных средних значений.
Судя по результатам исследований Кожевина (Кожевин, 1989,), для ряда микробиологических объектов эти условия соблюдаются. Для того, чтобы выяснить, соблюдаются ли они при прорастании спор актиномицетов в условиях низкой увлажненности среды их обитания на агаризованной питательной среде, проведем необходимые математические операции. Прежде всего, допустим, что все споры идентичны, и, следовательно, вероятность прорастания у всех спор одинакова. Допустим также, что эта вероятность постоянна в течение всего опыта. Тогда очевидно, что количество спор (dN), проросших за некоторый бесконечно малый интервал времени (dt), будет тем больше, чем больше было (к началу этого интервала времени) количество жизнеспособных спор, ещё не успевших прорасти (Nt). В виде дифференциального уравнения этот вывод выглядит так: где q — постоянный коэффициент, характеризующий среднюю вероятность прорастания каждой отдельной споры в любой из интервалов времени,
Интегрируя это уравнение и учитывая, что в начале опыта (при t = 0) число жизнеспособных спор (которые еще не проросли, но прорастут к концу опыта) равно N0, получим:
Чтобы выяснить, соответствует ли динамика прорастания спор этому уравнению, нужно нанести экспериментальные данные на график, где по оси ординат отложены значения lg(Nt/No), а по оси абсцисс - время. В случае соответствия этому уравнению, точки на графике ложатся на прямую линию, тангенс угла наклона которой к оси времени равен - 0.43 q.
Для построения графиков необходимо было определить значения Nt и N0. Для этого в каждом варианте опытов определяли количество спор {(Na)i, (Na)2 (Nab и N3)4}, проросших к концу последовательных интервалов времени (tj, t2, t3 и t4) (рис, 1-3), К моменту t4 (120 ч) проросли практически все жизнеспособные споры, которые были на среде к началу опыта; следовательно, No = (Na)4. Затем подсчитывали количество спор (Nt), ещё не проросших к началу каждого интервала времени: Nt = N0 - (Ыа)1(табл. 18). Таблица 18.
После этого каждое из полученных значений N, (N,; N2 и т.д.) делили на No. Значения отношений N/N0 (Ni/N0; N2/N0 и т.д.) для различных вариантов опыта были довольно близки: относительные ошибки средних значений находятся в пределах 3-7%. Это дает основание считать, что различные варианты опыта являются элементами опробования единой физической совокупности (Кожевин, 1989), что позволяет в дальнейшем оперировать их средними (для каждого этапа опыта) значениями. Средние значения Nt/No оказались равными 0.7 для 8 ч, 0.45 - для 24 ч и 0.12 - для 72 ч (табл. 18). Эти значения были прологарифмированы, и величины их логарифмов отложены на координате lg(Nt/N0)t против соответствующих значений на оси времени (рис.11).
Экспериментальные точки легли на прямую линию. Это означает, что выведенное экспоненциальное уравнение адекватно описывает динамику процесса. Следовательно, все перечисленные выше условия (а именно: равная вероятность прорастания всех спор; постоянство этой вероятности во времени; отсутствие их воздействия друг на друга, а также их количество, достаточно большое для того, чтобы обеспечить получение достаточно точных средних значений) характерны для прорастающих спор исследованных актиномицетов даже при экстремально низких уровнях увлажненности среды их обитания.
Тангенс угла наклона полученной прямой линии к оси абсцисс, равный [lg(Nt/No)o - lg(Nt/No)t]/t, пропорционален q. Подставляя в уравнение (3) соответствующие данные, получим: q = - 0.9/(- 0.43 72) = 0.029 [1/час] (4) Зная величину q, можно вычислить среднюю продолжительность существования спор до прорастания (S) (Дмитриев, 1995) : S = І/q = 34.5 ч (5) Уравнение (2) аналогично уравнению динамики распада радиоактивных элементов; следовательно, время, необходимое для прорастания 50% всех жизнеспособных спор (toj) аналогично периоду их полураспада (Дмитриев, 1995):
Развитие актиномицетов на стеклах, покрытых агаризованной питательной средой
При низкой влажности воздуха -104.8 МПа (aw 0.48) споры исследуемых стрептомицетов в тонком слое агаризованнои среды не только прорастали, но увеличивалась длина проростков. Наиболее интенсивно увеличивалась длина мицелия Streptomyces odorifer. К 120 ч. длина мицелия этого штамма составляла 14 мкм. S. pluricolorescens рос медленнее. У S. odorifer наблюдалось к 120 ч. опыта обильное боковое ветвление мицелия. А)
Динамика прорастания спор стрептомицетов в условиях давления влаги воздуха воздухе: а) - 104.8 МПа (aw 0.48); в) -26.7 МПа (aw 0.84); с) - 3.6 МПа (aw 0.98). 1- S. odorifer, 2- S. pluricolorescens. В целом динамика прорастания спор двух штаммов стрептомицетов при различных уровнях увлажнения окружающей среды однотипна: в начале опыта интенсивность их прорастания максимальна, но затем она постепенно уменьшалась, асимптотически приближаясь к концу опыта (через 120 часов) к весьма малым значениям, близким к нулю.
Это позволяет предположить, что динамика прорастания спор подчиняется строгим закономерностям. Поиску подобных закономерностей были посвящены работы Хаттори. Ему впервые удалось (основываясь на статистическом распределении Пуассона) теоретически вывести уравнение, описывающее динамику появления бактериальных колоний на питательных средах. П.А.Кожевин (Кожевин, 1989) подтвердил высокую репрезентативность этого уравнения, полностью совпадающего с уравнениями, описывающими кинетику химических реакций 1-го порядка, а также динамику распада радиоактивных элементов (Дмитриев, 1995 ).
При соблюдении ряда условий эти уравнения легко выводятся и без помощи статистического распределения Пуассона. Эти условия следующие. Во-первых, объекты, изменяющие свое состояние (в данном случае -микроорганизмы), должны быть идентичными, чтобы вероятность изменения состояния (например, деления клеток или прорастания спор) каждого из этих объектов была одинаковой. Во-вторых, эта вероятность должна быть постоянной в течение опыта. В-третьих, объекты не должны воздействовать друг на друга. И, в-четвертых, их количество должно быть достаточно большим, чтобы обеспечить получение достаточно точных средних значений.
Судя по результатам исследований Кожевина (Кожевин, 1989,), для ряда микробиологических объектов эти условия соблюдаются. Для того, чтобы выяснить, соблюдаются ли они при прорастании спор актиномицетов в условиях низкой увлажненности среды их обитания на агаризованной питательной среде, проведем необходимые математические операции. Прежде всего, допустим, что все споры идентичны, и, следовательно, вероятность прорастания у всех спор одинакова. Допустим также, что эта вероятность постоянна в течение всего опыта. Тогда очевидно, что количество спор (dN), проросших за некоторый бесконечно малый интервал времени (dt), будет тем больше, чем больше было (к началу этого интервала времени) количество жизнеспособных спор, ещё не успевших прорасти (Nt). В виде дифференциального уравнения этот вывод выглядит так: где q — постоянный коэффициент, характеризующий среднюю вероятность прорастания каждой отдельной споры в любой из интервалов времени,
Интегрируя это уравнение и учитывая, что в начале опыта (при t = 0) число жизнеспособных спор (которые еще не проросли, но прорастут к концу опыта) равно N0, получим:
Чтобы выяснить, соответствует ли динамика прорастания спор этому уравнению, нужно нанести экспериментальные данные на график, где по оси ординат отложены значения lg(Nt/No), а по оси абсцисс - время. В случае соответствия этому уравнению, точки на графике ложатся на прямую линию, тангенс угла наклона которой к оси времени равен - 0.43 q.
Для построения графиков необходимо было определить значения Nt и N0. Для этого в каждом варианте опытов определяли количество спор {(Na)i, (Na)2 (Nab и N3)4}, проросших к концу последовательных интервалов времени (tj, t2, t3 и t4) (рис, 1-3), К моменту t4 (120 ч) проросли практически все жизнеспособные споры, которые были на среде к началу опыта; следовательно, No = (Na)4. Затем подсчитывали количество спор (Nt), ещё не проросших к началу каждого интервала времени: Nt = N0 - (Ыа)1(табл. 18). Таблица 18.
После этого каждое из полученных значений N, (N,; N2 и т.д.) делили на No. Значения отношений N/N0 (Ni/N0; N2/N0 и т.д.) для различных вариантов опыта были довольно близки: относительные ошибки средних значений находятся в пределах 3-7%. Это дает основание считать, что различные варианты опыта являются элементами опробования единой физической совокупности (Кожевин, 1989), что позволяет в дальнейшем оперировать их средними (для каждого этапа опыта) значениями. Средние значения Nt/No оказались равными 0.7 для 8 ч, 0.45 - для 24 ч и 0.12 - для 72 ч (табл. 18). Эти значения были прологарифмированы, и величины их логарифмов отложены на координате lg(Nt/N0)t против соответствующих значений на оси времени (рис.11).
Экспериментальные точки легли на прямую линию. Это означает, что выведенное экспоненциальное уравнение адекватно описывает динамику процесса. Следовательно, все перечисленные выше условия (а именно: равная вероятность прорастания всех спор; постоянство этой вероятности во времени; отсутствие их воздействия друг на друга, а также их количество, достаточно большое для того, чтобы обеспечить получение достаточно точных средних значений) характерны для прорастающих спор исследованных актиномицетов даже при экстремально низких уровнях увлажненности среды их обитания.
Тангенс угла наклона полученной прямой линии к оси абсцисс, равный [lg(Nt/No)o - lg(Nt/No)t]/t, пропорционален q. Подставляя в уравнение (3) соответствующие данные, получим: q = - 0.9/(- 0.43 72) = 0.029 [1/час] (4) Зная величину q, можно вычислить среднюю продолжительность существования спор до прорастания (S) (Дмитриев, 1995) : S = І/q = 34.5 ч (5) Уравнение (2) аналогично уравнению динамики распада радиоактивных элементов; следовательно, время, необходимое для прорастания 50% всех жизнеспособных спор (toj) аналогично периоду их полураспада (Дмитриев, 1995):
