Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы, 8
1.1 Структура и функции воды в микробных клетках 8
1.2 Способы выражения состояния оводненности среды обитания 12
1.3 Отношение различных групп микроорганизмов к влажности среды обитания 16
1.4 Повреждения клеток водным стрессом, адаптация микроорганизмов к водному стрессу 27
1.5 Влияние свойств почвенной влаги на развитие микроорганизмов 33
1.6 Доступность воды растениям, 39
Экспериментальная часть
Глава 2. Объекты и методы исследования 44
2.1 Характеристика объектов исследования 44
2.2 Методы исследования 48
2.2.1. Определение интенсивности прорастания спор и роста мицелия актиномицетов при различной влажности воздуха 48
2.2.2 Определение радиальной скорости роста актиномицетов на агаризованных средах с различным давлением влаги 51
2.2.3 Определение динамики дыхания актиномицетов в жидкой среде с различным уровнем давления влаги 54
ГЛАВА 3. Результаты исследовании 56
3.1 Интенсивность прорастания спор и роста мицелия актиномицетов при различной влажности воздуха 56
3.2 Развитие актиномицетов на агаризованнои среде с различным давлением влаги 72
3.3 Динамика дыхания актиномицетов в жидкой среде с различным уровнем давления влаги 80
ГЛАВА 4. CLASS Обсуждение результато CLASS в 84
Выводы 88
Список литеретуры 89
- Повреждения клеток водным стрессом, адаптация микроорганизмов к водному стрессу
- Определение интенсивности прорастания спор и роста мицелия актиномицетов при различной влажности воздуха
- Определение динамики дыхания актиномицетов в жидкой среде с различным уровнем давления влаги
- Развитие актиномицетов на агаризованнои среде с различным давлением влаги
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Влажность среды обитания является важным фактором, влияющим на способность организмов к росту и развитию. Границы влажности, в которых организм способен развиваться, обусловливают его распространение в наземных экосистемах.
Наиболее ксерофильными компонентами почвенного ценоза являются некоторые грибы (Griffin, 1969). Нижней границей давления влаги, при котором возможен рост микроорганизмов, считается -70 мегапаскалей (МПа) (активность воды (aw) 0,60). Организмом, способным развиваться в таких условиях, является гриб Xeromyces bispoms (Dix, Webbster, 1995). Прокариоты гораздо более требовательны к влаге, чем грибы, и большинство из них развиваются при давлении влаги выше -4 МПа (aw 0,95). Исключение составляют лишь экстремальные галофилы.
Актиномицеты, по сравнению с другими бактериями, более устойчивы к высушиванию почвы (Калакуцкий, Агре, 1977). Экзоспоры стрептомицетов сохраняют жизнеспособность в условиях полного высушивания. В почвах аридных районов актиномицеты занимают значительное место в комплексе прокариотных организмов (Звягинцев, Зенова, 2001). Однако в публикациях отсутствуют сведения о вегетативном росте мицелиальных прокариот при низких значениях давления влаги. Поэтому вопрос о том, определяется ли широкое распространение актиномицетов в аридных системах способностью развиваться при низкой влажности среды обитания или устойчивостью их спор к высушиванию, до настоящего времени остается открытым.
Целью работы явилось определение интенсивности прорастания спор и роста мицелия актиномицетов при различных уровнях влажности среды обитания для установления возможностей их развития в условиях низкой влажности (засухи). Задачи исследования:
Г. Разработка методических приёмов для исследования способности прорастания спор представителей разных родов актиномицетов при различных уровнях влажности.
2. Определение интенсивности прорастания спор и роста мицелия представителей разных родов актиномицетов в условиях различной влажности.
3. Оценка радиальной скорости роста колоний актиномицетов при различных уровнях влажности среды.
4. Изучение специфичности развития актиномицетов в условиях заданных уровней влажности.
Научная новизна.
Впервые показано, что споры некоторых актиномицетов способны прорастать при очень низком давлении влаги в среде обитания (-96,4 МПа, aw 0,50). В наибольшей степени эта способность свойственна Streptomyces odorifer.
При исследовании роста актиномицетов на агаризованной среде с различным давлением влаги, впервые установлено, что каждому уровню влажности соответствует определенная специфика развития актиномицетов. При уровне давления влаги -53,6 МПа (а„г 0,67) развитие ограничивается стадией выхода в трубку. При влажности -22,6 МПа (aw 0,86) и -11,6 МПа (aw 0,92) большинство актиномицетов образуют микроколонии без спор, а при -2,8 МПа (aw 0,98) актиномицеты осуществляют полный цикл развития от прорастания споры до спорообразования воздушного или субстратного мицелия на макроколониях.
Установленные факты позволяют считать, что жизнедеятельность мицелиальных прокариот в почве осуществляется в условиях низкой влажности среды обитания, мало пригодной для активности немицелиальных бактерий.
Практическая значимость.
Полученные результаты расширяют представления об экологии актиномицетов и их роли в почвах аридных зон.
Разработаны методические подходы для исследования прорастания спор и роста мицелия актиномицетов при различных уровнях влажности. Первый методический прием заключается в создании определенного уровня влажности в эксикаторах над насыщенными растворами различных солей. Эксикаторы с препаратами спор помещались в термостаты, что исключало возможность выпадения росы на стекла. Во втором методическом приеме использована оригинальная методика выращивания актиномицетов на средах при строго фиксированных уровнях влажности с применением глицерина.
Результаты проделанной работы могут найти применение в области биотехнологии, сельскохозяйственной микробиологии, медицины.
Апробация работы.
Основные положения работы доложены на XI Международной конференции «Ломоносов-2004» (Москва, 2004), VII Докучаевских молодежных чтениях (Санкт-Петербург» 2004), IV съезде Докучаевского общества почвоведов (Новосибирск, 2004), заседаниях кафедры биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета им М.В. Ломоносова.
Публикации
Материалы проведенных исследований изложены в 5 печатных работах, в том числе в 2 статьях, опубликованных в рецензируемых журналах. Автор выражает свою глубокую признательность и благодарность проф. д.б.н. академику РАЕН Д.Г. Звягинцеву и проф. д.б.н. Г.М. Зеновой за помощь и постоянное внимание к работе. Автор сердечно благодарит академика РАЕН проф. д.б.н. И.И. Судницына за ценные консультации, поддержку и помощь в работе. Автор благодарит всех сотрудников кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова за сотрудничество и поддержку.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 03-04-48324, а также при частичном финансировании грантом Президента для поддержки ведущих научных школ РФ № НШ- 1518.2003.4
Повреждения клеток водным стрессом, адаптация микроорганизмов к водному стрессу
При отсутствии в среде обитания необходимого для развития организма количества воды, в нем наблюдаются различные повреждения. Это может выражаться как в замедлении развития организма, так и в различных физиологических и морфологических отклонениях.
Неоднократно было показано, что в условиях низких значений влажности многократно увеличивается продолжительность лаг-периода при прорастании спор (Mislives, Tuite, 1970; Griffin, 1972), снижается скорость роста (Hocking, Pitt, 1979). Возможно, это обусловлено тем, что при низком водном потенциале ингибируются внутриклеточные биохимические реакции и ферментативная активность (Christian, Waitho, 1962). Кроме того, в условиях недостатка воды, энергия, необходимая для роста, тратится на осморегуляцию (Bernstein, 1963).
При изменении условий влажности могут наблюдаться не только изменения длительности отдельных стадий жизненного цикла, но и нарушение их последовательности, например, как бы «выпадение» отдельных стадий, так называемое микроциклическое развитие организма (Марфенина, 2005) Для некоторых грибов характерной реакцией на понижение относительной влажности воздуха является сильная редукция как вегетативных так и репродуктивных органов. Часто весь организм гриба бывает представлен одной или несколькими гифами.
Наряду с этим отмечаются различные морфологические отклонения у организмов, развивающихся при низкой влажности. Так у грибов происходит образование спор с утолщенными оболочками (Кузнецова, 1973), виды Cladosporium при понижении влажности образуют лишь субстратный мицелий, воздушный практически отсутствует. Заметно изменяется морфология конидий Alternaria alternata: они светлеют, значительно удлиняются, становятся более тонкими, теряют продольные перегородки (Иванушкина, 1984). В почвах пустынь актинобактерии представлены в основном апигментными формами. Такие виды являются; типичными педобионтами, устойчивыми к высушиванию и голоданию (Добровольская, 2002). В актиномицетных комплексах пустынных почв, напротив, доминируют окрашенные формы (Звягинцев, Зенова, 2001).
Снижение водного потенциала приводит также к подавлению почвенных биохимических процессов: замедлению или полному подавлению нитрификации (Dubey, 1968), азотфиксации как несимбиотической (Du Bois, Kapustka, 1980) так и симбиотической (Sprent, 1971), изменению скорости окисления железа Thiobacillus ferrooxictans (Brock, 1975 а). Организмы проявляют более высокую чувствительность к матричному водному стрессу, чем к осмотическому (Brock, 1975b). Это может быть обусловлено потребностью большинства микроорганизмов в положительном тургорном давлении. Для того чтобы находиться в состоянии тургора, клетка должна поддерживать свой внутренний водный потенциал на более низком уровне, чем водный потенциал окружающей среды. Если клетка подвергается осмотическому стрессу, существует вероятность того, что она может поглотить какое-то количество растворенного вещества и; тем самым снизить свой внутриклеточный водный потенциал (Adebayo et al., 1971). Организм, подвергающийся матричному стрессу в условиях окружающей среды с низкой концентрацией растворенных веществ (например, в засушливых почвах), не имеет возможности поглощать осмотически активные соединения из внешней среды (Смит, 1981).
При недостатке экзогенной воды в условиях матричного стресса микроорганизмы используют метаболическую воду, которая образуется в результате окисления органического вещества, содержащегося в клетках. Например, из 1 кг глюкозы можно получить, таким образом, 600 г воды (Громов, Павленко, 1989).
Другой возможный способ адаптации клеток к существованию в условиях водного стресса заключается в синтезе осмопротекторов — низкомолекулярных веществ, защищающих клетку от изменений внутреннего водного потенциала, В качестве таких веществ могут выступать пролин, бетаины (метилированные производные аминокислот), у-аминомасляная кислота. Для поддержания низкого внутриклеточного водного потенциала водоросль Dunalietla в большом количестве синтезирует глицерин (Ben-Amotz, Avron, 1973). Высокая внутриклеточная концентрация многоатомных спиртов наблюдалась у дрожжей Saccharomyces
У грамотрицательных бактерий существует специфическая система регуляции осмолярности периплазматического пространства. В условиях низкой осмолярности окружающей среды, начинается интенсивный синтез периплазматических олигосахаридов. Эти олигосахариды с молекулярной массой 2200-2600 образованы остатками глюкозы и имеют сильно разветвленную структуру. В качестве заместителей они содержат остатки сукцината и фосфоглицерина, придающие им отрицательный заряд. Благодаря не слишком большой молекулярной массе олигосахариды эффективно влияют на осмолярность периплазмы, но их молекулярная масса, достаточна, чтобы воспрепятствовать их выходу через поры внешней мембраны. Являясь сильными анионами, олигосахариды удерживают в периплазматическом пространстве катионы, что также способствует повышению осмолярности периплазмы. В результате осмотический градиент создается на уровне внешней, а не цитоплазматической мембраны (Громов, Павленко, 1989).
Способность эукариот развиваться в условиях низких значений влажности, возможно, обусловлена наличием в их клетках замкнутой воды. Так, во всех исследованных методом ЯМР эукариотных клетках, после высушивания обнаруживались области, содержащие изолированную подвижную воду (Аксенов, 1978). Количество изолированной воды обычно составляло несколько процентов от веса высушенной биомассы. В клетках микроорганизмов (в частности дрожжей), обитающих в экстремальных условиях, обнаруживалось наибольшее количество воды (до 30% по отношению к весу высушенной биомассы).
Определение интенсивности прорастания спор и роста мицелия актиномицетов при различной влажности воздуха
В работе использовали моноспоровые суспензии актиномицетов, которые готовили по методу В,Д. Кузнецова (1972). Для получения моноспоровой суспензии культуры выращивали на минеральном агаре Гаузе 1 в чашках Петри при 28С в течение 14-ти суток.
Стерильным скальпелем собирали материал с поверхности агара в чашках Петри и помещали его в колбу со стерильной водой. Полученную взвесь одиночных спор, споровых конгломератов и обрывков вегетативного мицелия обрабатывали на низкочастотном ультразвуковом диспергаторе типа УЗДН — I (22 кГц; 0,44 А; 30-60 сек). Затем полученную суспензию фильтровали через слой стерильной хирургической ваты в стерильную колбу и отмьшали от среды стерильной водой. Содержимое колбы фильтровали под вакуумом через стеклянный фильтр №4.
Микроскопический контроль за распределением и количеством спор в суспензии производили с помощью камеры Горяева под микроскопом Zeizz Axiostar. Расчет количества спор в 1 мл суспензии проводили по формуле:
a = п х 1000/sh, где
а - количество спор в 1 мл суспензии;
п — среднее количество спор в малом квадрате камеры Горяева;
s - площадь малого квадрата камеры Горяева;
h — глубина малого квадрата камеры Горяева;
Приготовление препаратов и условия их инкубирования в эксикаторах
Для приготовления препаратов использовали моноспоровые суспензии чистых культур актиномицетов (105кл/мл). Одну каплю полученной суспензии наносили на предметные стекла и распределяли по площади 1см2. Стекла подсушивали на воздухе, подсчитывали среднее число спор в 100 полях зрения (хЮОО).
Препараты помещали в эксикатор с определенным уровнем влажности воздуха, который создавали с помощью насыщенных растворов солей (табл. 5).
Использовали условия трех уровней влажности воздуха, каждая из которых позволяет моделировать соответственный уровень почвенной влаги: -96,4 МПа (aw 0,50) — экстремально низкая влажность для развития живых организмов. Данные о возможности роста при столь низком уровне давления влаги в литературе отсутствуют; -22,6 МПа (aw 0,86)- уровень давления влаги, соответствующий максимальной адсорбционной влагоемкости (МАВ) и -2,8 МПа (aw 0,98) — уровень давления влаги, приближенный к полевой влагоемкости (ПВ) (табл. 6).
Эксикаторы с препаратами инкубировали в термостате при 28 С. Колебания температуры в термостате не превышали 1С, что предупреждало выпадение росы на стеклах. Уровень влажности воздуха в эксикаторах контролировали при помощи цифрового термовлагомера Viking АВ с погрешностью измерения влажности не более 1%.Стекла просматривали через 8, 24 и 72 ч экспозиции. Повторность составляла не менее ста полей зрения для одной культуры на каждый срок опыта. Подсчитывали число проросших спор, т.е. число спор с ростовыми трубками. Измеряли длину проростков. Просмотренное стекло снова в эксикатор не помещали.
Определение динамики дыхания актиномицетов в жидкой среде с различным уровнем давления влаги
Определение интенсивности дыхания, актиномицетов в среде с определенным уровнем влаги проводили методом газовой хроматографии.
В стерильные пенициллиновые флаконы (объемом 10 мл) помещали по 5 мл жидкой глицерин-нитратной среды. Различные уровни давления влаги создавали, используя разные концентрации глицерина в среде. Использовали три значения давления влаги: -53,6 МПа, (а 0,67); -22,6 МПа (aw 0,86); -2,8 МПа (aw 0,98). В случаях исследования динамики дыхания актиномицетов родов Actinomadura и Micromonospora в среду добавляли в качестве источника углерода крахмал (1%).
Культуры актиномицетов засевали в пенициллиновые флаконы, внося небольшое количество мицелия и спор на конце препаровальной иглы. Флаконы закрывали и инкубировали в термостате при 28С. На 1,.3, 7 и 14-е сутки измеряли эмиссию СОг во флаконах в газовой фазе над жидкостью при помощи газового хроматографа.
Исследования проводили в трехкратной повторности. В качестве контроля использовали стерильную среду с соответствующем уровнем давления влаги.
Условия определения С02: детектор по теплопроводности (катарометр), колонки с носителем Porapak-Q (0,3x350 см), газ-носитель гелий (25 мл/мин), температура колонки 40С (Степанов, Лысак, 2002).
В ходе исследования было установлено, что споры некоторых актиномицетов способны прорастать при давлении влаги -96,4 МПа (а 0,50). В наибольшей степени эта способность отмечена у Streptomyces odorifer, выделенного из альгобактериального мата горячего источника Камчатки. Уже через 8 ч инкубации в эксикаторе количество проросших спор (спор с ростовыми трубками) составило 25%, а через 72 ч — 36,4% от среднего количества спор в поле зрения (рис. 5). Споры других исследованных представителей рода Streptomyces — S. rectiviolaceus и S. violaceoruber, прорастали значительно менее активно в данных условиях влажности (3,4% и 1,9% от среднего числа спор в поле зрения к 72 ч экспозиции соответственно). Количество проросших спор Micromonospora ehalcea и М. nigra составляло 20% и 9% от среднего количества спор в поле зрения к 72 ч экспозиции соответственно.
Споры исследованных представителей рода Actinomadura и S. violaceus при aw 0,50 не прорастали совсем.
Образовавшиеся проростки продолжали увеличиваться в длину при aw 0,50. С наибольшей скоростью (0,081 мкм/ч) рос мицелий S. odorifer, через 72 ч средняя длина его проростков составляла 8,3 мкм. Проростки спор М. ehalcea достигали к 72-м ч длины 5,9 мкм, а скорость их роста составляла 0,07 мкм/ч. Значительно медленнее происходил рост мицелия М. nigra, S. rectiviolaceus и S. violaceoruber (рис. Є), длина проростков которых через 72 ч экспозиции не превышала 3 мкм.
Развитие актиномицетов на агаризованнои среде с различным давлением влаги
При исследовании роста актиномицетов на агаризованной среде с различным осмотическим давлением, создаваемым разными концентрациями глицерина в среде, установлено, что при низком давлении влаги (-53,6 МПа, аду 0,67) споры всех исследуемых стрептомицетов прорастали, формировались ростовые трубки, но роста мицелия и образования микроколоний к 14-м суткам роста не наблюдалось (рис. 17). Наибольшее количество мест посева стрептомицетных спор на агаризованную среду («уколов»), в которых обнаружены проросшие споры, отмечено у Streptomyces violaceoruber (90% от всех уколов на чашке), в меньшей степени прорастали споры S. odorifer (85%), S. rectiviolaceus (70%) и S. violaceus (65%).
При давлении влаги -22,6 МПа (aw 0,86) уже к 3-им суткам споры всех штаммов стрептомицетов прорастали, отмечалось боковое ветвление проростков. К 14-м суткам у всех стрептомицетов наблюдалось образование микроколоний. На микроколониях некоторых штаммов отмечалось наличие скудного воздушного мицелия.
Измерение скорости роста микроколоний проводили под микроскопом с помощью окуляр-микрометра. Наибольшая скорость роста колоний при данном давлении влаги была отмечена у S. violaceoruber — 290 мкм час", наименьшая у S. violaceus - 140 мкм2час (рис. 18, а.).
При давлении влаги -11,6 МПа (а„ 0,92) к 3-м суткам опыта происходило образование микроколоний. Наблюдали рост субстратного мицелия. К 14-м суткам отмечалось наличие скудного воздушного мицелия на микроколониях. При визуальном осмотре в центре «уколов» можно было различить макроколонии диаметром несколько миллиметров.
Скорость роста колоний при данном уровне влаги у всех исследованных штаммов стрептомицетов была практически одинакова (от 370 мю ч"1 у Streptomyces rectiviolaceus до 430 мкм2ч"1 у S. odorifer) (рис. 18, б).
При высоком, давлении влаги -2,8 МПа (aw 0,98) все исследованные культуры развивались очень активно. Скорость роста колоний была на три порядка выше, чем при более низких влажностях. Наибольшая скорость роста была отмечена у S. violaceoruber и составляла 294000 мю ч"1 (рис. 18, в). Макроколонии стрептомицетов имели хорошо развитый субстратный и вмдушный мицелий, у всех исследованных культур стрептомицетов было отмечено спорообразование к 7-м суткам роста.
Используя экспериментальные данные увеличения площади мицелия при различных уровнях давления влаги у разных стрептомицетов, представляется возможным рассчитать линейную зависимость и вывести математическую формулу зависимости скорости роста актиномицетов от влажности среды:
lgvK = - 0.7312.6 + lg(poam p)] 2.3 lg(ponm p) 2.0,
где, vK - скорость роста актиномицета (мкм ч ); р и ропт - заданное и условно оптимальное для роста данной культуры давление влаги (атм).
Были рассчитаны значения оптимального давления влаги для каждого исследованного штамма стрептомицетов (табл. 8). Для развития всех изученных стрептомицетов оптимальное давление влаги было приблизительно одинаковым (от -2,73 до -2,85 МПа; aw 0,98) .
Термином оптимальное (достаточное) давление влаги мы обозначаем давление влаги необходимое актиномицетам для прохождения полного цикла развития от прорастания споры до спорообразования.
Измерение радиальной скорости роста колоний актиномицетов других родов на агаре с различным давлением влаги показало, что не все исследованные актиномицеты способны расти в условиях низкой влажности. При давлении влаги -53,6 МПа (aw 0,67) рост отсутствовал у Micromonospora nigra и у Actinomadura aurantiaca. Споры других культур прорастали плохо. К 14 суткам наличие проросших спор было обнаружено лишь в 10% мест посева от всех «уколов» на чашке в варианте с A. yumaensis и в 40% «уколов» в варианте с М. chalcea. Образование микроколоний при данном уровне влажности не происходило (рис. 19).
При большей влажности -22,6 МПа (а 0,86) споры М. nigra по-прежнему не прорастали (рис. 20, а). Скорость роста других актиномицетов была не высокой. В некоторых случаях у актиномадур отмечалось образование микроколоний без воздушного мицелия.
Лишь при давлении влаги -2,8 МПа (aw 0,98) скорость роста всех исследованных актиномицетов была высокой. Макроколонии актиномадур имели хорошо развитый воздушный мицелий, колонии микромоноспор — хорошо развитый субстратный мицелий. У всех исследованных культур актиномицетов происходило образование спор. Наибольшая скорость роста колоний в условиях данной влажности была отмечена у A. yumaensis и составляла 118000 MKMV1 (рис. 20, б).
