Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние и проблемы изучаемого вопроса 8
1.1. Общая характеристика объекта исследований 8
1.2. Микроклональное размножение растений 11
1.3. Поведение растений земляники, размноженных через культуру ткани в полевых условиях 23
1.4. Использование регуляторов роста растений 24
1.4.1. Биопрепараты нового поколения на основе эндофитных симбионтных грибов 29
1.4.2. Применение препаратов на основе фурфурола 30
1.4.3. Новые синтетические экологически чистые препараты 32
1.4.4. Новый класс фитогормонов - брассиностероиды 33
1.5. Влияние РРР на землянике 35
1.6. Физиологическое действие фитогормонов 37
ГЛАВА 2. Объекты, методика и условия проведения исследований 41
2.1. Место проведения и объекты исследований 41
2.2. Метеорологические условия в годы проведения исследований 41
2.3. Методики исследований 47
2.3.1. Методика определения влияния РРР на растения земляники в полевых условиях 49
2.3.2.Методика определения влияния РРР на растения земляники в лабораторных условиях 51
ГЛАВА 3. Результаты исследований 55
3.1. Оптимизация условий клонального микроразмножения земляники in vitro 55
3.1.1. Введение земляники в культуру in vitro 55
3.1.2. Размножение земляники в культуре in vitro 58
3.1.3. Использование нетрадиционных регуляторов роста в культуре in vitro 61
3.1.4. Укоренение ремонтантных сортов земляники 63
3.2. Влияние регуляторов роста в полевых условиях 64
3.2.1. Влияние регуляторов роста на усообразовательную способность растений земляники 65
3.2.2. Влияние регуляторов роста на укореняемость молодых розеток земляники 72
3.2.3. Потенциальная продуктивность растений земляники под действием регуляторов роста 74
3.3. Влияние регуляторов роста на физиологические показатели 76
3.3.1. Водный обмен 76
3.3.2. Влияние регуляторов роста на накопление Сахаров 84
3.3.3. Влияние регуляторов роста на некоторые характеристики пигментной системы листьев земляники 89
3.4. Экономическая эффективность применения регуляторов роста и развития растений 98
4. Заключение 100
Выводы 103
Рекомендации производству 104
Список используемой литературы , 105
- Поведение растений земляники, размноженных через культуру ткани в полевых условиях
- Методика определения влияния РРР на растения земляники в полевых условиях
- Использование нетрадиционных регуляторов роста в культуре in vitro
- Влияние регуляторов роста на усообразовательную способность растений земляники
Введение к работе
В настоящее время установлено большое значение физиологически активных веществ - регуляторов роста и развития растений (РРР) в практике сельского хозяйства. Это объясняется тем, что регуляторы роста оказывают положительное воздействие на процессы роста и развития. Важное значение в современной с.-х. науке имеет открытие регуляторов роста не относящихся к фитогормонам. В последние годы в результате проведения крупномасштабных работ по испытанию вновь синтезированных веществ самой различной химической природы на наличие биологической активности было открыто большое количество регуляторов роста, обладающих многообразной направленностью воздействия на растения.
Множественные исследования, проведенные в нашей стране и за рубежом, убедительно доказывают целесообразность применения регуляторов роста на разнообразных культурах для повышения их продуктивности.
Известно, что природные фитогормоны стероидной природы, такие как брассиностероиды, обладают высокой биологической активностью, экологически безопасны, что позволяет широко применять их в растениеводстве. Эпин как препаративная форма брассиностероидов зарекомендовал себя как стимулятор антистрессового действия.
Крезацин - экологически безопасный биостимулятор для сельского хозяйства, повышает сопротивляемость организма к неблагоприятным условиям существования, вызванным различными причинами, стимулируя (или нормализуя) жизненные процессы на многих культурах, в частности на зерновых он выступает как специфический регулятор роста.
Кавказ относится к препаратам, которые проявляют свойства высокоэффективных активаторов роста проростков, увеличивают потенциальную продуктивность, улучшают посевные качества семян в нормальных условиях и при воздействии стрессовых факторов биотической и абиотической природы. При этом они малотоксичны или нетоксичны. Остаточные количества препаратов в продуктах отсутствуют.
По сообщениям ряда авторов применение эмистима положительно сказывается на урожайности многих культур, защищает растения от болезней и вредителей, повышает их устойчивость к стрессам.
Вместе с тем эти препараты повышают устойчивость растений к стрессам вызываемых целым рядом факторов биотического и абиотического происхождения. В частности они улучшают водный режим на зерновых культурах, на томате, огурце, плодовых деревьях, повышают устойчивость к грибным и вирусным заболеваниям, низким температурам.
В настоящее время большой интерес исследователей привлекает изучение физиологических механизмов действия РРР на разных видах растений. Однако действие данных регуляторов роста на садовую землянику изучено недостаточно полно.
Таким образом, актуальность постановки данной диссертационной работы по изучению некоторых физиологических закономерностей действия новых экологически безопасных регуляторов роста регуляторов роста на фото-синтетический аппарат и водный режим растений земляники, а также сравнительное исследование эффективности их влияния на скорость размножения и потенциальную продуктивность земляники садовой представляется достаточно обоснованной.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ. Основной целью работы являлось изучение некоторых физиологических закономерностей действия регуляторов роста на фотосинтетический аппарат и водный режим растений земляники, а также сравнительное исследование эффективности их влияния на скорость размножения и потенциальную продуктивность земляники садовой.
В этой связи нами решались следующие задачи:
1. Выявить влияние изучаемых РРР на содержание хлорофиллов а и b и степень связанности хлорофилла в листьях земляники.
Изучить влияние РРР на важнейшие характеристики водного режима растений земляники: интенсивность транспирации, оводненность тканей, водоудерживающую способность растений.
Оценить влияние изучаемых препаратов на сахаронакопление, как фактора адаптации к условиям перезимовки.
Определить влияние РРР на скорость размножения земляники в полевых условиях и в культуре ткани.
Сравнить воздействие регуляторов роста на потенциальную продуктивность земляники.
Выявить сортоспецифичность действия препаратов.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Проведено сравнительное изучение влияния исследуемых регуляторов роста и развития растений на скорость размножения земляники in vivo и in vitro. В культуре ткани все исследованные препараты оказывали значительный эффект на коэффициент размножения и были способны заменить традиционные цитокинины. В полевых условиях эффективность их влияния на усообразование в лучших вариантах достигала 200%. Также продемонстрирована значительное повышение потенциальной продуктивности после обработки всеми изученными препаратами -до 197%.
Изучена реакция на обработку РРР новых сортообразцов земляники селекции Айтжановой С.Д. и показана сортоспецифичность действия препаратов.
Все изученные вещества повышали содержание хлорофилла в листьях земляники. Важно, что при этом увеличивалась степень его связанности. Это проявлялось в уменьшении содержания хлорофилла, легко экстрагируемого неполярными растворителями, и может свидетельствовать об улучшении структурированности фотосинтетического аппарата.
Показано положительное действие всех изученных регуляторов роста на водный режим растений земляники. Они повышали водоудерживающую
способность, снижали интенсивность транспирации, увеличивали оводнен-ность тканей.
Вес РРР эффективно повышали накопление Сахаров в период закалки. Это может являться одним из элементов адаптивного действия препаратов в подготовке растений к условиям перезимовки.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. На основании полученных результатов разработаны рекомендации по производственному применению препаратов эмистим, кавказ, крезацин и эпин, позволяющих повысить потенциальную продуктивность и усообразовательную способность растений земляники. Для каждого из изученных сортов были подобраны оптимальные концентрации. В то же время препарат кавказ в концентрации 50 мг/л и эпин в концентрации 50 мкг/л проявляли достоверно высокую эффективность на всех изученных сортах в течение 3 лет исследований.
В процессе размножения земляники в культуре ткани изученные РРР
могут быть использованы вместо ЦИТОКИНИНОВ. і
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертационной работы были доложены и одобрены на заседаниях ученых советов Агроэкологиче-ского института и научно-практических конференциях Брянской государственной сельскохозяйственной академии в 2003-2005 гг.; на II Всероссийской конференции молодых ученых и специалистов аграрных образовательных и научных учреждений «Инновации молодых ученых - сельскому хозяйству России» (Москва, 2005).
ПУБЛИКАЦИИ. По результатам исследования опубликовано 5 работ.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из 4 глав, выводов и рекомендаций для практического применения, списка использованной литературы и 16 приложений. Работа содержит 24 таблицы и 21 рисунок. Список использованной литературы включает 197 наименований, в том числе 34 на иностранных языках.
Обзор литературы. Глава 1. Современное состояние и проблемы изучаемого вопроса. 1.1. Общая характеристика объекта исследовании.
Садовая земляника Fragaria ananassa Duch. - это крупноплодный гибрид, появившийся во второй половине 18 века в результате естественного скрещивания двух диких американских видов F.chiloensis (L.) Duch. и F.vurginiana Duch.
Род земляники Fragaria L. относится к семейству Розанные (Rosascae), подсемейству шиповниковые (Rosoideae) (Зубов, 1990). Дарроу (1966) разделяет одиннадцать диких видов земляники на четыре группы по числу хромосом (при основном числе хромосом семь): пять диплоидов (F. vesca L., F. vir-idis Duch., F. dalloniana J. Gay, F. nubicola Lindl. et Lacaita, F. nilgerrensis Schlechl), два тетраплоида (F. moupinensis (Franch.) Card., F. oricnllalis Los-insk), один гексаплоид (F. moschata Duch.) и три октаплоида (F.virginiana Duch., F. chiloensis (L.) Duch., F. ovalis (Lchn.) Radb). Садовая земляника F. ananassa является также октаплоидом.
Большинство исследователей землянику относят к многолетним травянистым вечнозеленым растениям. Она занимает промежуточное положение между травянистыми и древесными формами.
Куст земляники имеет укороченный стебель, у взрослых растений он сильно разветвленный и утолщенный. Разветвления стебля называются рожками. Рожки развивают розетки листьев, цветоносные побеги с соцветиями и стелющиеся плети (усы). Количество рожков, листьев и цветоносов в кусте земляники зависит от возраста растения, сортовых особенностей и условий произрастания (Айтжанова, 1999).
Подземные органы земляники состоят из корневища и многочисленных придаточных корней, расположенных, главным образом, в слое 0-30 см. Лишь отдельные корни достигают глубины 40-50 см. Корневище земляники имеет характерные признаки этого органа:
оно покрыто неопадающими прилистниками - чешуйками, чего нет на стеблях ни у одного ягодного растения;
выполняет функции вместилища запасных питательных веществ;
стеблевое происхождение корневища подтверждается наличием годичных колец;
на жизнедеятельной части корневища возникают стеблевые образования - рожки и придаточные корни.
Биологической особенностью земляники является оголение корневища в процессе роста. Это происходит из-за того, что старые придаточные корни, отходящие от нижней части корневища, с возрастом отмирают снизу, а молодые корни, отрастающие на одногодичных приростах (рожках), образуются в верхней части корневища. Таким образом, нарастание корней идет снизу вверх, и корневище поднимается над уровнем почвы. Оголение корневища ослабляет рост растений и может привести к их гибели. Чтобы не допустить этого, растения каждый год после уборки надо окучивать или мульчировать.
Высота куста земляники достигает 30-40 см и зависит от длины черешков листьев. Обновление листьев у земляники наблюдается в начале вегетации и после сбора урожая. Наибольшая потеря листьев происходит с поздней осени до весны. Сохранившиеся листья весной начинают расти, но они быстро отмирают. На смену им формируются новые. В период созревания ягод рост листьев замедляется, а у отдельных сортов совершенно прекращается. Это происходит из-за того, что большое количество питательных веществ расходуется на формирование и рост ягод. Продолжительность цветения земляники зависит от сорта и колеблется в пределах от 20 до 30 дней. Сроки начала цветения и созревания ягод в значительной степени определяются генотипом и погодными условиями. Ягоды ранних сортов созревают в конце мая - начале июня, поздних - в конце июня. В пору плодоношения земляника вступает на второй год после посадки, и в этот же год урожай ягод бывает наиболее высоким. В производственных условиях землянику размножают
усами, однако возможно и семенное размножение безусых ремонтантных форм.
Сорта земляники подразделяются на плодоносящие в июне-июле (обычные), ремонтантные и нейтралыюдневные на основании их реакций на длину дня в период формирования цветковых почек. Генеративные органы у обычных сортов формируются в условиях короткого дня (10-12 часового) и пониженных температурах (не выше +15...+17С). Для нормального цветения они должны пройти период покоя при температуре 0...+5 С в течение 20-30 дней.
Длиннодневные сорта садовой земляники, называемые ремонтантными, способны формировать генеративные органы при 14-17 часовом дне и высокой (не ниже +15 С) температуре воздуха. Особенность ремонтантных сортов состоит в том, что соцветия развиваются за 2-3 недели и растения могут и цвести и плодоносить до 3-4 месяцев в сезоне (Чухляев, 1999). Ремонтантная земляника по характеру формирования соцветий и побегов подобна обычной, t но отличается повышенной скороспелостью и энергией ветвления побегов. Ремонтантные сорта формируют на усах не цветущие розетки.
Нейтральнодневные сорта отличаются от ремонтантных и обычных тем, что могут быть запрограммированы на получение продукции приблизительно через 3 месяца после посадки, а также тем, что формируют цветущие розетки на усах. Названы они нейтральнодневными, т.к. закладывают соцветия как на длинном, так и на коротком дне.
Земляника - наименее зимостойкая ягодная культура. Кратковременное снижение температуры может привести к сильным повреждениям корней и корневища при отсутствии снежного покрова. Надземная часть, в зависимости от сорта, сильно повреждается уже при температуре -10...-15 С и полностью гибнет при температуре -16 ...-20 С. Поэтому надо проводить мульчирование посадок.
Земляника влаголюбивое растение. Однако длительный избыток влаги может вызвать выпадение кустов. При недостатке влаги в почве во время
цветения происходит плохое завязывание ягод, во время плодоношения - измельчение ягод и резкое снижение урожая, в осенний период - резкое ослабление темпов закладки цветковых почек (Айтжанова, 2002).
Земляника отличается определенной степенью выносливости к затенению. Это подтверждается тем, что в течение всего зимнего периода листья способны сохранять свою жизнедеятельность под снегом. При сильном загущении растений в узко- и широкополосных посадках размер ягод земляники остается характерным для сорта. При снижении освещенности на 15-20%, которая наблюдается в непосредственной близости от кулисных культур, урожай земляники практически не уменьшается. Однако, наиболее высокие урожаи получают на крупных промышленных плантациях с хорошим солнечным освещением.
Земляника - культура требовательная к плодородию почвы. Благоприят- ;. ной для ее выращивания считается почва, в 100 г которой содержится не менее 10-15 мг Р2О5 и 15-20 мг К2О и более 3% гумуса. Оптимальный рН - 5-6 >. (Айтжанова, 2005).
1.2. Микроклональное размножение растении.
Микроклональное размножение - это метод вегетативного размножения, который заключается в получении в условиях in vitro (в пробирке) неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализо-вывать присущую ей тотипотентность, т.е. под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму (Шевелуха, 1995).
Преимуществами клонального микроразмножения растений в сравнении с традиционными методами являются:
значительно более высокие коэффициенты размножения;
миниатюризация процесса, приводящая к экономии площадей, занятых маточными и размножаемыми растениями;
оздоровление растений от грибных и бактериальных патогенов, вирусов, микоплазменных, вироидных и нематодных инфекций;
получение генетически однородного посадочного материала;
сокращение продолжительности селекционного периода;
ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;
возможность проведения работ в течение года;
в условиях in vitro часто размножаются и укореняются те растения, которые совсем не размножаются или плохо размножаются обычными способами;
возможность автоматизации процесса выращивания.
Обязательным условием клонального микроразмножения является использование объектов, полностью сохраняющих генетическую стабильность на всех этапах процесса - от экспланта до растений в поле. Этому условию удовлетворяют апексы и воздушные почки органов стеблевого происхождения (Бутенко, 1999). По данным Д. Амато (1985), у ряда видов уже диффе-ренцировка соматических клеток в условиях in vitro ведет к утрате геномом стабильности. Однако для луковичных растений, пальм, многих декоративных растений при использовании подобных эксплантов отклонения от прототипа, как правило, не наблюдалось (Pierik, 1987).
По данным B.C. Шевелухи (1998) различные авторы, проводя индивидуальные исследования по влиянию условий культивирования эксплантов на процессы морфогенеза, наблюдали разные ответные морфогенетические реакции на изменение условий выращивания, что привело к созданию различных классификаций методов клонального микроразмножения. Исходя из предложенных в литературе методов микроразмножения растений, этот процесс можно осуществить следующими путями:
- активация развития уже существующих в растениях меристем;
индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта;
индукция соматического эмбриогенеза;
дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной кал-лусных тканях.
Основной метод, используемый при клональном микроразмножении растений - это активация развития уже существующих в растении меристем. Большая часть высших растений обладает промежуточным типом роста, при котором в пазухах листьев находятся пазушные меристематические ткани, способные сформироваться в побег, идентичный главному. В соответствии с типом ветвления пробуждается различное число боковых почек. Развитие большинства из них заторможено вследствие явления апикального доминирования. Снятие апикального доминирования позволяет добиться активации роста пазушных меристем. Это может быть достигнуто двумя путями:
удаление верхушечной меристемы стебля и последующее микрочеренкование побега in vitro на безгормональной среде;
добавление в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов.
При культивировании побегов на среде, содержащей цитокинин, происходит пробуждение пазушных меристем и образование побегов первого и последующих порядков, образуется быстрорастущий пучок побегов. Этот пучок побегов после достаточного развития разделяют на более мелкие и вновь культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пробуждение пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков. Этот процесс может продолжаться бесконечно до получения необходимого количества растений. Скорость, с которой могут образовываться пазушные побеги in vitro, варьирует в широких пределах в зависимости от вида растений и пригодности питательной среды. Для хорошо растущих растений происходит 5-10 кратное увеличение количества побегов в течение 4-8 недель (Высоцкий, 1984).
Обычно в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин), а также 2-изопентениладенин (2 ір). В литературных источниках имеются также данные о применении в качестве цитокинина тидиазурона (TDZ) в пониженных концентрациях (Ни-etteman, 1993; Соболев, 2000; Сковородников, 2001).
Методика быстрого размножения пазушными побегами может быть пригодна для любого растения, продуцирующего нормальные пазушные побеги и реагирующего на поступающий извне цитокинин. В настоящее время таким путем размножают многие сельскохозяйственные культуры, в том числе и плодово-ягодные, такие как земляника, яблоня, груша, вишня, слива, смородина, виноград, малина и др.
Второй метод - это индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта. Он основан на способности изолированных частей растения, при благоприятных условиях питательной среды, восстанавливать недостающие органы и, таким образом, регенерировать целые растения. Известно множество фактов образования придаточных побегов in vitro, на различных органах, особенно на листьях, стеблях и корнях. Такие явления часто используют на практике при размножении культур черенкованием (Туровская, 1992). Регенерация придаточных побегов на изолированных органах может быть получена in vitro у большого числа растений. У одних это достигается с легкостью, а у других этот процесс идет с большим трудом. Так, для нейтральнодневной ремонтантной земляники возможно использование в качестве исходных эксплантов даже фрагменты цветочных почек (Алексеенко, 1998). Образования адвентивных почек возможно добиться почти из любых органов и тканей растения, если их удается получить свободными от инфекции. Этот процесс происходит на питательных средах, содержащих один цитокинин или в сочетании с ауксином (Тюленев, 1991). Вид, количество и соотношение гормонов в среде для регенерации зависит от генотипа растения (Жуков, 1996).
Третий метод, практикуемый при клональном микроразмножении, основывается на дифференциации из соматических клеток зародышеподобных структур, которые по своему внешнему виду напоминают зиготические зародыши. Этот метод получил название соматический эмбриогенез. Основное отличие образования зародышей in vitro от in vivo заключается в том, что соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биполярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня. Формирование эмбриоидов в культуре ткани происходит в два этапа. На первом этапе клетки экспланта дифференцируются за счет добавления в питательную среду ауксинов, обычно 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) и затем превращаются в эмбриональные. Для формирования эмбрионов необходимо уменьшать концентрацию ауксина или полностью исключать его из состава питательной среды (Jones, 1988). Соматический эмбриогенез возможно наблюдать непосредственно в тканях первичного экспланта, а также в каллусной культуре.
Четвертый метод клонального микроразмножения - дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани. Практически он мало используется в целях получения посадочного материала in vitro. Это связано с тем, что при периодическом пересаживании каллусной ткани на свежую питательную среду, часто наблюдаются явления, нежелательные при микроразмножении: изменение плоидности культивируемых клеток, структурные перестройки хромосом и накопление генных мутаций. Наряду с генетическими изменениями наблюдаются изменения растений и по фенотипу. Однако, несмотря на некоторые недостатки, данный метод имеет свои положительные стороны и преимущества. В ряде случаев этот метод является единственно возможным способом размножения растений в культуре тканей. Он представляет большой интерес для селекции, т.к. растения, полученные этим способом, отличаются по генетическим и фенотипическим признакам.
Первые достижения в области клонального микроразмножения были достигнуты в конце 50-х гг. нашего столетия французским ученым Жоржем Морелем, которому удалось получить первые растения-регенеранты орхидей. Успеху Мореля в микроразмножении способствовала уже разработанная к тому времени техника культивирования апикальной меристемы растений в условиях in vitro.
В нашей стране работы по клональному микроразмножению были начаты в 60-х гг. в лаборатории культуры тканей и морфогенеза Института физиологии растений им академика Р.Г. Бутенко. Были изучены условия микроразмножения картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы, фрезии и некоторых других растений и предложены промышленные технологии. Таким образом, первые успехи в клоналыюм микроразмножении связаны с культивированием апикальных меристем травянистых растений на соответствующих питательных средах, обеспечивающих в конечном итоге получение рас-тений-регенерантов.
В процессе клонального микроразмножения Н.В Катаева, В.А Аветисов (1981) выделяют ряд последовательных этапов: 1) выделение экспланта и введение в культуру in vitro; 2) собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества мериклонов
; 3) укоренение размноженных побегов; 4) перенос укорененных растений в нестерильные условия.
Некоторые авторы предлагают ввести нулевой этап в методику размножения растений in vitro, предусматривающий выращивание маточных форм в строго контролируемых условиях. Четкое разграничение процедур в целом удобно, хотя и не всегда применимо ко всем растениям.
Поскольку применяемые питательные среды являются одновременно отличными субстратами для развития бактериальной и грибной сапрофитной микрофлоры, исходный материал должен быть тщательно простерилизован. При этом используют чаще всего ртутьсодержащие соединения (сулема или диоцид 0.1-0.2%) или менее токсичные соединения, содержащие активный
хлор (хлорамин 10-15%, гипохлорит натрия или кальция 5-10%) (Попов, 1979; Pierik, 1987). Для снижения инфицированности эксплантов на некоторых культурах проводят предстерилизационную обработку побегов горячей водой при температуре 48±0,5 С в течение 15-30 минут (Алексеенко, 1998). После стерилизации приступают к вычленению экспланта для введения в культуру in vitro. Он должен быть таких размеров, чтобы мог обладать достаточной жизнеспособностью и был свободным от микрофлоры. Оценку зараженности культуры проводят визуально через 7-8 суток. Следует также отметить, что размеры эксплантов из различных частей растений могут значительно различаться. Так размеры апексов рожков земляники почти вдвое превосходят таковые побегов-усов. Наибольшее количество прижившихся эксплантов в целом по сортам выявлено с меристемами, выделенными из усов (Бондаренко, 2002).
На практике было показано, что чем меньший размер меристемы верхушки побега использовался в качестве исходного экспланта, тем больше вероятность получить здоровое растение, но процент эксплантов, развившихся при этом в целые растения, снижается (Попова, 1985; Приходько, 1995; Фаустов, 1995).
Некоторые ученые считают, что освобождение растений от вирусов не всегда связано с размером вычленяемого экспланта и во многом зависит от взаимодействия вируса с хозяином (Baumann, 1981). Экспланты одного и того же размера оказываются как инфицированными, так и оздоровленными. Вероятно, это может быть связано как с неравномерным распределением вирусных частиц по растению, так и с возможным подавлением репликации вирусов под влиянием условий культивирования и состава питательной среды. При этом возможно не последнюю роль играют и внутренние факторы, обусловливающие деятельность иммунной системы растительного организма (Томилин, 1993).
В тех случаях, когда трудно получить исходные стерильные экспланты, рекомендуют вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрацик-
лин, бензилпенициллин и др.) в концентрации 10-200 мг/л (Леонтьева-Орлова, 1991). Уменьшить отрицательное действие фенольных соединений на экспланты в начальном этапе культивирования возможно снижением температуры культивирования, а также пересадкой на свежие питательные среды каждые 4-7 дней (Альшевцева, 1990; Ковальчук, 1991; Высоцкий, 1995). Некоторые исследователи для нейтрализации фенолов в среду добавляют нитрат серебра (Шмырко, 2001).
Для улучшения роста и регенерации эксплантов плодовых растений может быть применен также активированный уголь (в концентрации около 2%). Он адсорбирует ингибиторы роста, выделяемые тканями растений (Villalobos, 1991). К сожалению, активированный уголь связывает также и гормоны, поэтому такое отсутствие специфичности сужает область его применения в культуралыюй среде.
В некоторых случаях для связывания полифенолов в культуре тканей используют поливинилпирролидон (5000-10000 мг/л) (Высоцкий, 1995).
На втором этапе клонального микроразмножения необходимо добиться получения максимального коэффициента размножения, что достигается добавлением в среду различных регуляторов роста. Для большинства ягодных культур, в частности земляники, это 6-БАП в различных концентрациях (Горьковцева, 1991; Расторгуев, 1996; Ковалева, 2000; Клоконос, 2001; Муратова, 2004). Хотя для некоторых форм земляники предпочтительнее оказывалось совместное применение кинетина и 6-БАП (Хапова, 1997). На отдельных культурах возможна замена 6-БАП синтетическим препаратом тидиазу-роном (TDZ) в концентрации меньшей в несколько раз, по сравнению с оптимальной для 6-БАП (Fasolo, 1988; Chevreau, 1989; Алексеенко, 1998; Упа-дышев, 1991а).
Для успешного размножения некоторых культур необходимо присутствие в питательной среде цитокининов совместно с ауксинами (Бленда, 1991; Высоцкий, 1996). Кроме цитокининов и ауксинов в питательную среду в ка-
честве стимулятора роста и вытягивания побегов иногда добавляют гиббе-релловую кислоту (ГК) (Тюленев, 1990).
Для клонального микроразмножения земляники чаще используют среду на основе минеральных солей Мурасиге-Скуга. Питательная среда должна обеспечивать жизнедеятельность, рост и развитие биообъектов. Неотъемлемой частью питательной среды служит вода. Основными компонентами питательной среды для культуры тканей и клеток растений являются минеральные соли (макро- и микроэлементы), углеводы, витамины, регуляторы роста (Бутенко, 1987).
Потребность ткани в элементах питания зависит от ее физиологических особенностей. Для молодых тканей необходимо присутствие больших доз калия в среде; старые ткани более требовательны к присутствию кальция. Для большинства элементов имеется достаточно широкий оптимум концентраций, но незначительное изменение его в ту или иную сторону редко оказывает отрицательное действие (Бутенко, 1990).
При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием цитокинина происходит постепенное их накопление в тканях выше необходимого физиологического уровня. Это является одной из причин формирования растений с измененной морфологией (разбухание, искривление), которые необратимо становятся стекловидными и некротичными, что может вызвать гибель всех культивируемых побегов. Такое явление называется «витрификацией» или «впитыванием воды» (Hussey, 1978). Отрицательное действие цитокининов возможно преодолеть путем использования питательных сред с минимальной концентрацией цитокининов, обеспечивающей стабильный коэффициент размножения или путем чередования циклов культивирования на средах с низким и высоким уровнем цитокининов (Катаева, 1982; Хасси, 1987). Избежать появления витрифика-ции в некоторых случаях удается путем увеличения концентрации агара до 1,1%, но в этом случае для достижения высоких скоростей размножения необходимо пересмотреть содержание цитокинина.
Укоренение побегов, их последующая адаптация к почве и высадка в поле являются наиболее трудоемкими этапами, от которых зависит успех клонального микроразмножения.
На этапе укоренения, как правило, меняют основной состав среды: концентрацию минеральных солей уменьшают в два раза, а иногда и в четыре раза, количество сахара снижают до 0,5-1% (Туровская, 1987; Дорошенко, 1989; Горьковцева, 1991; Стахеева, 1998).
В качестве стимулятора корнеобразования используют ИМК, ИУК, НУК или их комбинации, например НУК с ИМК. Иногда применяют феруловую или хлорогеновую кислоты (Бургутин, 1983; Поликарпова, 1984). В некоторых случаях используют флороглюцин (Jones, 1979). Проходят испытание новые препараты мивал, укоженяч, микроцит (Леонтьева-Орлова, 1991). Есть сведения о применении в качестве индуктора ризогенеза в культуре ткани на плодовых и ягодных культурах веществ фенольного происхождения (Упа-дышев, 1996,2003).
В некоторых случаях для улучшения корнеобразования совместно с ауксинами в питательные среды вводят активированный уголь, тонко размолотые семена (виноград) (Петрова, 1999).
Индукцию корнеобразования проводят двумя основными способами:
выдерживанием микропобегов в течение некоторого времени (от нескольких секунд - до 24 часов) в стерильном концентрированном растворе ауксина (20-1000 мг/л) и последующем их культивированием на агаризован-ной среде без гормонов или непосредственно в подходящем почвенном субстрате (импульсная обработка) (Трушечкин, 1992);
непосредственным культивированием микропобегов в течение 3-4 недель на питательной среде, содержащей ауксин в невысоких концентрациях (1-5 мг/л, в зависимости от исследуемого объекта) (Упадышев, 1991b).
Кроме гормональных факторов, на процесс ризогенеза влияют и физические. Известно, что одноразовое шоковое воздействие контрастными температурами (50±2 С - 2 часа, затем 0±2 С - 24 часа) увеличивает укореняе-
мость побегов яблони. При такой обработке наблюдается активизация биосинтеза нуклеиновых кислот, резко усиливаются синтетические процессы, что выражается, в конечном итоге, в повышении укореняемости побегов (Тюленев, 1990).
Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответственным этапом, завершающим процесс клоналыюго микроразмножения. Эту операцию целесообразно проводить с конца марта-начала апреля, когда у растений начинается активный рост (Хапова, 1997; Паскеев, 2001). Для каждой культуры требуется установить оптимальную фазу развития, в которой потери от перевода в нестерильные условия будут сведены к минимуму. Лучшим для пересадки многих культур является время, когда начинают разрастаться корни, а молодые листья становятся достаточно развитыми и способными к фотосинтезу, чтобы обеспечить растению полную автотрофность (Хасси, 1987). По данным некоторых авторов, процесс переноса растений в нестерильные условия весьма негативно сказывается на состоянии растений (Попов, 1976). В связи с этим к почвенному субстрату предъявляются высокие требования. Обычно используют торф, песок, перлит, брикеты Jiffy-7 (Broom, 1978). Растения земляники, по сообщениям ряда авторов, вполне удовлетворительно переносят пересадку в обычный автоклавированный субстрат (песок, торф, почва в соотношении 1:1:1 или торф и песок - 3:1) (Стрыгина, 1990; Высоцкий, 1996). Укореняют обычно розетки высотой более 1,5 см с 3-4 хорошо развитыми листьями. Для укоренения используют разбавленную вдвое среду MS, но с полным содержанием железа и витаминов (Матушкина, 2001, Заякин, 2001).
Растения, размноженные in vitro, часто нелегко приживаются, в условиях открытого грунта, поэтому применяют специальную промежуточную стадию, на которой корешки и надземную часть постепенно адаптируют к нестерильным условиям (Трушечкин, 1972).
Нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и гибель растений. Эти явления связаны с тем, что у
пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Поэтому, для восстановления нормальной транспирации высаживаемых растений их следует поместить на некоторое время в условия повышенной влажности с постепенным ее снижением (Трушечкин, 1992).
Транспирационно-аэрационный способ, основанный на постепенном увеличении объема воздуха, используемого растением, облегчает адаптацию устьичного аппарата растений к пониженной влажности воздуха (Жуков, 1998).
Более радикальный метод применяют П.Я. Голодрига (1982) и В.Ф.
Бленда (1996) на подвоях косточковых и винограде. Авторы предлагают пе
ред высадкой растений срезать стебель, оставив 1-2 глазка. Из него разовьет
ся побег уже адаптированный к новым условиям выращивания. *
Иногда для подавления развития микрофлоры на корнях растений используют фунгициды (ридомил, фундазол) (Трушечкин, 1992). Ими обрабатывают корни побегов перед высадкой.
Адаптированные к нестерильным условиям растения могут быть перенесены в открытый грунт. Однако, для дальнейшего развития в почве саженцы некоторых культур (преимущественно древесных) нуждаются в прохождении стадии покоя при пониженной температуре (+2...+4 С в течение месяца) (Бленда, 1996). Это связано, вероятно, с тем, что при размножении in vitro период покоя у пробирочных растений отсутствует или слабо выражен вследствие действия экзогенных гормонов (Высоцкий, 1995).
Инициировать рост у покоящихся растений удается также обработкой гиббереллинами.
В настоящее время отечественный и зарубежный опыт показывает, что на поток поставлено производство посадочного материала высших категорий качества земляники, смородины, малины, вишни и др. Средства, затраченные на размножение растений через культуру ткани, окупаются лишь при решении особых задач, связанных с селекцией или с фундаментальными исследо-
ваниями, когда растения трудно размножаются обычными методами, когда при работе необходимо использовать только здоровый материал (Хасси, 1987; Хапова, 1995).
Таким образом, из представленного обзора видно, что в практике зарубежного и отечественного садоводства накоплен достаточно большой опыт по культивированию растений in vitro, позволяющий при необходимости обеспечить разработку методов клонального микроразмножения практически любой культуры.
1.3. Поведение растении земляники, размноженных через культуру
ткани в полевых условиях.
В научной литературе существуют противоречивые сведения о поведении растений земляники, полученных в культуре ткани по сравнению с растениями, размноженными традиционными способами. Некоторые исследователи отмечают отсутствие существенных различий между растениями, размноженными in vitro и их потомством первого поколения, с одной стороны, и контрольных растений, с другой стороны. Так, M.J. Hennety (1987) не отметил существенных различий по количеству и массе плодов между контрольными растениями и размноженными in vitro. Не было отмечено существенных различий по усообразователыюй способности и вегетативной массе (Бе-лошапкина, 1985).
Однако, многие авторы сообщают, что растения земляники, прошедшие через культуру ткани обладают повышенной вегетативной продуктивностью (Cameron, 1985, 1986; Жаркова, 1992). Установлено, что сила роста, число цветоносов на рожок, были выше у растений размноженных через культуру in vitro (Petrevica, 1997). Сообщается также об увеличении урожайности оздоровленных растений на 20-650% (Kristensen, 1986). Растения земляники после культуры ткани характеризуются более интенсивным образованием плетей и розеток, большей площадью листовой поверхности и большей пло-
щадью листьев на растении (Янушкевич, 2004). Эти эффекты сохраняются иногда и на следующий год (Damiano, 1980; Navatel, 1985). Однако, существует определенная зависимость между генотипом и эффектом последействия культуры ткани. Так, в год посадки ремонтантные и нейтралыюдневные сорта обладали повышенной усообразовательной способностью. На второй год данный эффект продолжал действовать только у нейтральнодневных сортов (Алексеенко, 1999). Повышение биологической продуктивности растений земляники садовой, полученной в культуре in vitro, происходит в основном за счет увеличения выхода дочерних розеток, а также увеличения количества цветоносов и ягод на одно растение (Swartz, 1981). Некоторые авторы связывают увеличение количества образующихся плетей и розеток с повышенной активностью пазушных почек, вызванной последействием цитокининов в питательных средах (Waithaka, 1980). Однако данный эффект наблюдается не у всех генотипов земляники (Marcotrigiano, 1984). Есть мнение, что это наблюдается вследствие элиминации вирусов при культивировании in vitro (Walkey, 1980).
На характеристику растений в полевых условиях влияют также методы размножения in vitro (Nehra, 1994). На качество посадочного материала земляники, а также на ее биометрические показатели влияет и количество субкультивирований (Navatel, 1986; Boxus, 1986). Экспериментально установлено, что управлять поведением микроразмноженных растений после культуры ткани можно путем включения определенных регуляторов роста в питательную среду (Mohamed, 1991).
1.4. Использование регуляторов роста растений.
Природные и синтетические регуляторы роста и развития растений (РРР), или фиторегуляторы, являются мощным средством управления онтогенезом растений. Поэтому они находят широкое применение в биотехноло-
гии сельскохозяйственных растений и в практическом растениеводстве (Ше-велуха, 1995).
Химическая регуляция онтогенеза растений имеет непосредственное отношение к решению проблем практического растениеводства. Теоретической основой этого направления является учение о фитогормонах и химических регуляторах роста (Полевой, 1982).
Согласно современным представлениям о регуляторах роста и развития растений фитогормонами называют вещества, которые синтезируются в растениях, транспортируются по ним и в малых концентрациях способны вызывать ростовые или формативные эффекты.
У нас в стране первые работы по изучению роли фитогормонов в регуляции метаболизма растений были начаты в 60-е годы в лаборатории А.Л. Курсанова. Исследования были посвящены изучению роли цитокининов в действии корневой системы на обмен веществ листьев (Кулаева, 1985).
Согласно современным взглядам насчитывают шесть известных групп фитогормонов, три из которых открыты сравнительно недавно. Однако, по-видимому, список гормонов растений не исчерпывается ими. Открытие нового фитогормона - очень редкое событие, так как эти вещества присутствуют в растении в очень небольших концентрациях. Тем не менее, очевиден прогресс в изучении регуляторных систем растения, связанный с совершенствованием методов исследования.
Фитогормоны условно разделяют на гормоны стимулирующего и ин-гибирующего действия. К первым относятся ауксины, цитокинины, гиббе-реллины, ко вторым - абсцизовая кислота и этилен (Дерфлинг, 1985). Стимуляторы, как следует из названия, вызывают деление клеток, ускоряют процесс роста и развития растений, цветение и плодоношение, выводят семена из состояния покоя. Гормоны этого типа обычно активируют процессы дыхания, обмена веществ, биосинтеза белков, нуклеиновых кислот, метаболические процессы в целом. Ингибиторы, напротив, замедляют рост и развитие, их действие связано с процессами покоя, старения и опадения органов и тка-
ней. На клеточном уровне наблюдается резкое замедление синтеза белков и нуклеиновых кислот.
Физиологическая активность подавляющего большинства РРР обусловлена их способностью влиять на какой-то компонент фитогормональной системы. Система гормональной регуляции, как совокупность взаимодействующих гормонов разных классов, во многом определяет характер таких важнейших физиологических процессов как рост и формирование различных органов, время и характер цветения, сроки созревания, переход к состоянию покоя и выход из него семян, почек и пр. Регуляция этих процессов гормонами или их синтетическими аналогами высокоспецифична.
Фитогормоны, которые нашли наиболее широкое применение в сель
ском хозяйстве, относятся к пяти классам: ауксины, цитокинины, гибберел-
лины, АБК'и этиленпродуценты (Муромцев, 1987). . <*.
Для обработки растений могут использоваться синтетические аналоги гормона, как в случае большинства применяемых на практике ауксинов, например используемого в производстве гербицида 2,4-Д или аналог природных цитокининов - 6-бензинаминопурин.
Первым фитогормоном, открытым учеными, является ауксин 3-индолилуксусная кислота (ИУК). Он был открыт в начале 20-го века. Это вещество - стимулятор роста и развития растений, оно ускоряет прорастание семян, улучшает развитие корневой системы, изменяет периодичность плодоношения, вызывает образование партенокарпических плодов, участвует в контроле развития надземной и подземной частей растения. На клеточном уровне этот гормон усиливает дыхание, ускоряет обменные процессы, активизирует синтез белков и нуклеиновых кислот. Однако сама ИУК сильно разлагается под действием света, крайне неустойчива к окислению. В производстве широко используются аналоги ИУК (ИМК, НУК, 2,4-Д, гетероауксин), которые гораздо более устойчивы к окислению, имеют высокую физиологическую активность (Муромцев, 1987). Основным местом синтеза ауксинов являются апикальные меристемы стебля, откуда они поступают в другие
органы. В меньшей степени синтез этого фитогормона происходит в листьях, причем в молодых листьях ауксина образуется больше, чем в старых.
Цитокинины были открыты в 1955 году в связи с их использованием в культуре in vitro как фактора, стимулирующего деление клеток. Влияние цитокининов распространяется на все стороны обмена веществ и структурные компоненты клетки. Они стимулируют деление растительных клеток, активируют процессы синтеза РНК и белков в клетке, обладают аттрагирующим и омолаживающим эффектами, влияют на состояние устьичного аппарата растений, принимают участие в регуляции газового режима и транспирации листьев, активизируют фотосинтез (Кулаева, 1985). В 60-е годы было высказано предположение о взаимосвязи между структурной формулой цитокини-на и его функцией (Кулаева, 1973). В дальнейших работах это предположение подтвердилось (Рахманинова, 1981). Появилась возможность изменять в ту или иную сторону цитокининовую активность вещества. Среди синтезированных веществ с цитокининовым эффектом появились гербициды, дефолианты, вещества защитного действия. Характерное свойство цитокининов состоит в том, что они повышают устойчивость клеток растений к самым различным неблагоприятным воздействиям, включая такие, как повышенные и пониженные температуры, недостаток воды, повышенные концентрации солей, токсичность различных химических агентов, грибная и вирусная инфекции (Кулаева, 1973). Синтезируются цитокинины главным образом в апикальных меристемах корня, откуда активно транспортируются с пасокой по ксилеме.
Гиббереллины были открыты в 1926 г. и выделены в 1938 г. В середине 50-х годов были установлены химическая структура гиббереллинов и присутствие этих веществ во многих видах растений. Дальнейшие исследования показали, что эти вещества являются важной составной частью гормонального компонента растения. Гиббереллины представляют собой группу близких по строению тетрациклических карбоновых кислот, относящихся к дитерпе-нам. В настоящее время открыто более 70 природных веществ растительного
происхождения, имеющих структуру и активность, сходных с гибберелловой кислотой (ГК). Физиологическое действие гиббереллинов проявляется главным образом в стимуляции ростовых процессов за счет усиления растяжения клеток и повышения митотической активности меристематических тканей. Наблюдается определенная специфика в ростовых реакциях растений различных семейств на тот или иной гиббереллин. Так, растения семейства тыквенных и некоторые крестоцветные не изменяют своего роста под действием ГКз, но активно реагируют на ГК4, который в свою очередь не изменяет интенсивность роста представителей ряда других семейств.
Помимо видовой специфичности на гиббереллин, ярко выражена спе-цифическая реакция органов одного и того же растения на повышение уровня этого фитогормона. Так, на растениях кукурузы, ГК замедлял их развитие, увеличивал высоту, не влиял на величину листовой поверхности и накопление урожая, угнетал рост корней (Зауралов, 1996).
Гиббереллины играют большую, но недостаточно изученную роль в процессах перехода к формированию генеративных органов и зацветанию. У некоторых розеточных растений обработка гиббереллинами индуцирует зацветание даже в условиях неблагоприятного светового дня, приводит к угнетению развития семян и формированию партенокарпических плодов. У растений с раздельнополыми цветками отмечен эффект сдвига пола в сторону мужских цветков. Гиббереллины способны выводить семена и клубни растений из состояния покоя.
Этилен был открыт в 1901 г. как фактор опадения листьев и фототропизма проростков гороха. Как и большинство фитогормонов, этилен обладает широким спектром регуляторных эффектов, причем даже в пределах одного растения возможны различные реакции клеток на этот фитогормон (Сарыче-ва, 1995). Этилен способен вызывать утолщение клеток. Ряд эффектов этиле-нов объясняется его антиауксиновым действием. В отличие от ауксина этилен вызывает формирование отделительного слоя, т.е. приводит к опадению листьев, цветков, завязи и плодов. Под действием этого фитогормона ускоря-
ется созревание плодов. У большинства растений он тормозит вегетативный рост, подавляя процессы деления и растяжения клеток, однако, в ряде случаев повышение его концентрации приводит к активации роста.
Способностью к биосинтезу этилена обладают практически все живые клетки растения. Биосинтез этого фитогормона резко увеличивается при стрессовых воздействиях и механических повреждениях, что дает возможность предположить об антистрессовом действии этого гормона.
Важное значение в современной сельскохозяйственной науке имеет открытие регуляторов роста не относящихся к фитогормонам. В результате проведения работ по крупномасштабному испытанию вновь синтезированных веществ самой различной химической природы на наличие биологической активности были открыты новые регуляторы роста (Greelman, 1997).
1.4.1. Биопрепараты нового поколения на основе эндофитных снм-
бионтных грибов.
Эта группа препаратов представляет собой экологически чистые вещества и получены они спиртовой экстракцией чистой культуры микоризного гриба, выделенного из корней растений.
К таким препаратам, проявляющим активность на растущих организмах в очень низких концентрациях, относят эмистим. Препарат разработан НПК «Биор».
Он служит для влажно-сухой обработки семян. Действующее вещество - композиция ростовых веществ цитокининовой и гиббереллиновой природы. Они являются продуктами метаболизма симбионтного гриба Асгетоптт lihcenicola, выделенного из корней женьшеня.
Эмистим изменяет гормональный баланс в клетках, в частности увеличивает содержание цитокининов.
По сообщениям ряда авторов применение данного препарата положительно сказывается на урожайности многих культур, защищает растения от
болезней и вредителей, повышает их стрессоустойчивость (Вакуленко, 1999). Выявлено также, что регулятор роста Эмистим является высокоэффективным индуктором устойчивости пасленовых к вирусным болезням (Рожнова, 1999). Обработка растений гречихи этим препаратом в фазу цветения способствовала увеличению длины главного и боковых побегов, числа соцветий и плодов на них. Значительно увеличилось количество крупных плодов (Ежов, 1999). При обработке растений люпина повышалась масса 1000 зерен, увеличивалось количество зерен в 1 бобе; препарат значительно увеличивал массу клубеньков на растениях. Анализ содержания сухого вещества показал, что в результате применения препарата происходило нарастание в основном сухого вещества корней, а наземная масса увеличивалась незначительно (Какшин-цев, 2000). Аналогичные данные получены и на сое (Павлютина, 2000, 2002). Использование данного препарата на свекле стимулировало ростовые процессы в период интенсивного роста растений и повышало сбор сахара и сахаристость корнеплодов (Сакало, 2001; 2004). Применение эмистима в культуре тканей в качестве регулятора роста показало, что данный препарат стимулировал рост и морфогенез изолированных тканей кукурузы, увеличивал число регенерантов в 5-6 раз по сравнению с традиционными гормонами, оказывал благоприятное воздействие на укореняемость побегов ежевики, увеличивал число и длину корней земляники (Диас, 1997; Мусияка, 1998; Карпова, 2001). Однако действие препарата эмистим сортоспецифично. Разные сорта и культуры реагируют на разные концентрации данного регулятора.
Таким образом, действие препарата такого типа действия требует дальнейшего изучения.
1.4.2. Применение препаратов на основе фурфурола.
Регуляторы роста, синтезированные на основе фурфурола, проявляют высокую эффективность при обработке ими семян, проростков, вегетирую-
щих растений овощных, злаковых, плодовых и лесных культур (Кульневич, 1986; Ненько, 1997; Норишина, 1997).
Препараты проявляют свойства высокоэффективных активаторов роста проростков, увеличивают потенциальную продуктивность, улучшают посевные качества семян в нормальных условиях и при воздействии стрессовых факторов биотической и абиотической природы (Кульневич, 1991). При этом они малотоксичны или нетоксичны, в зависимости от химической структуры вещества (Калашникова, 1992; Ненько, 1999). Остаточные количества препаратов в продуктах отсутствуют, на их применение в сельском хозяйстве РФ получено разрешение.
К данному классу относятся следующие препараты: глифур, универсальный, кавказ, фуролан, кротонолактон, Краснодар-1. Препараты - производные фурфурола, использованные в оптимальных ростстимулирующих концентрациях, улучшают посевные качества семян озимой и яровой пшеницы, кукурузы и сахарной свеклы, активируя рост проростков растяжением как в нормальных условиях, так и при водном стрессе (Ненько, 1999). При этом препараты кротонолактон и кавказ стабилизируют потенциальную продуктивность растений. Краснодар, фуролан и глифур оказывают на проростки комплексное воздействие.
Предпосевная обработка семян кукурузы препаратом Кавказ позволила увеличить урожай зерна на 3.2 - 8.2 ц/га по сравнению с контролем. Препараты кавказ, глифур и фуролан повышали урожайность при предпосевной обработке семян яровой пшеницы на 22.4-28.8%.
Данный класс регуляторов роста содержит около десяти разных веществ, при этом их действие на разные культуры весьма специфично и может существенно различаться. Поэтому необходимо проведение исследовательской работы по применению конкретного препарата на изучаемые культуры - подбор концентраций, способа обработки, периода развития растений для проведения обработки.
1.4.3. Новые синтетические экологически чистые препараты.
К таким препаратам относится крезацин. По данным ряда авторов этот препарат проявляет ауксиноподобную активность (Дьяков, 1990; Поликарпова, 1994; Ковалев, 2001).
Крезацин представляет собой триэтаноламиновую соль о-крезоуксусной кислоты.
Данный препарат обладает широким спектром биологического действия. Он усиливает или нормализует жизненные процессы на клеточном уровне и тем самым повышает сопротивляемость организма к неблагоприятным условиям существования.
По данным P.M. Маслова (2002) применение крезацина при предпосевной обработке семян свеклы повышает полевую и лабораторную всхожесть, ускоряет стартовый рост растений. У свеклы интенсивнее происходит нарастание листьев, массы корнеплодов, идет более интенсивное накопление Сахаров, уменьшается поражаемость вредителями.
В опытах Д.М. Никиточкина (2001) под влиянием препарата на яблоне, было отмечено значительное развитие корневой системы за счет корней обрастающего типа, увеличилась завязываемость плодов, их масса, повысился выход товарной продукции. На химический состав препарат существенного влияния не оказал.
Крезацин регулирует одно из центральных звеньев вторичного метаболизма (витаминов А и Е), оказывая мембрапостабилизирующее действие и стимулирует генеративное развитие. На зерновых культурах препарат выступает как специфический регулятор роста и развития растений. По данным, полученным В.М. Дьяковым (1990) крезацин стимулирует вегетативный рост и формирование урожая зерна. Аналогичные данные были получены и другими авторами (Ларионов, 1998; Троязыков, 2002).
Противоречивы сведения о применении данного препарата на картофеле. Так по данным В.Н. Казаковой (1990) при исследовании влияния препара-
та на различных сортах картофеля в концентрации 10, 20, 40, 60, 80 мг/л, было показано, что максимальная прибавка урожайности (до 57%) наблюдалась в варианте с концентрацией 40 мг/л, дальнейшее ее увеличение несколько снижало урожайность. При использовании этого гормона в культуре ткани на растениях картофеля было показано, что у проростков стимулировался рост стебля, происходило интенсивное формирование корней (Бурень, 1990). Другие же авторы сообщают, что использование крезацина в качестве индуктора корнеобразования не приводило к ожидаемым результатам (Ковалев, 2002).
В работе Шакирова Ф.Р. (2002) было показано 2 пика эффективного влияния концентраций препарата на прорастание семян. Диапазон концентраций от 0,001 до 10%. Пикам соответствуют 0,002-0,005 и 0,1%. Между этими вершинами наблюдался небольшой спад на концентрации 0,01-0,02%. Стимулирования не наблюдалось при минимальной и максимальной концентрациях.
На кукурузе препарат повышал урожайность зеленой массььна 30%, увеличивал массу початка на 40%, несколько понижал облиственность, увеличивал выход сухой массы, но практически не влиял на высоту растений (Киров, 1996).
Высоко эффективным стимулятором крезацин показал себя на льне-долгунце. После обработки растений этим гормоном увеличивалась высота растений, техническая длина, число коробочек, масса 1000 семян, возрастал урожай семян, улучшались технические характеристики (Ващенко, 1989).
Отмечена также способность крезацина изменять пол растений в мужскую сторону у различных систематических групп (Егоров, 1990).
1.4.4. Новый класс фитогормонов - брасснностсропды.
Брассиностероиды представляют новую группу фитогормонов, открытых в 70-е годы 20 века (Ковганко, 1991; Прусакова, 1996). В растительном
мире к настоящему времени идентифицировано более 40 брассиностероидов. Высокой физиологической активностью обладают три представителя этой группы соединений: брассинолид, эпибрассинолид, гомобрассинолид (Хрипам, 1993).
Отличительной особенностью брассиностероидов является действие на рост растений в очень низких концентрациях (10 - 10" М). Рострегули-рующий эффект соединений проявляется при обработке растений различными способами. Так, полусухая обработка семян ячменя брассинолидом и эпи-брассинолидом в широком спектре концентраций (Ю^-Ю'4 М) приводила к стимулирующему их действию на прорастание семян и рост 7-дневных проростков, однако, при этом наблюдалась сортоспецифичность действия соединений (Чижова, 1996).
Замачивание семян томата в растворе эпибрассинолида концентрацией 0,063 мг/л и опрыскивание растений в концентрации 0,03 мг/л значительно увеличивало сырую массу корней, повышало содержание сахара, витамина С, урожайность составила 124% к контролю (Матевосян, 2001). В исследованиях Л.К. Гуркиной (2002) наблюдалось стимулирование иммунной системы растений томата, улучшалась завязываемость плодов, уменьшалось их опадение, увеличивалось их количество, размер и масса.
При обработке семян лекарственных растений этим фитогормоном наблюдалось стимулирование полевой всхожести, а также увеличение сухой массы корней (Дулин, 2002).
Применение данного препарата на картофеле способствовало снижению распространения болезней на ботве и клубнях, повышению урожайности (Борисова, 2002).
Обработка растений люпина эпином в дозе 50 мл/га в фазу бутонизации-цветения способствовала повышению урожайности зерна на 10-30% (Какшинцев, 2001).
Обработка деревьев хурмы брассиностероидом перед цветением снижала степень опадения плодов, ускоряла их созревание, и повышала сахаристость (Iwahori, 1990).
По данным И.П. Барабаша (2001) обработка рассады земляники данным препаратом не оказывала значительных эффектов на приживаемость.
На зерновых эпибрассинолид проявил определенную специфичность действия. Так, обработка этим препаратом многолетней пшеницы приводила к увеличению массы и длины колоса, числа колосков и зерен в колоске, оказывала ингибирующее действие на рост стебля, повышала продуктивную кустистость (Хрипач, 1995). При этом снижалось накопление в зерне белков и клейковины, но качество клейковины улучшалось (Новиков, 1995). На ячмене же, наоборот, наблюдалось стимулирование роста главного стебля, незначительно увеличивалась длина главного колоса, не было обнаружено влияния на массу зерна (Прусакова, 1995).
По литературным данным известно, что одни и те же регуляторы роста в разных климатических зонах на одних и тех же объектах дают неодинаковые результаты.
Таким образом, применение регуляторов роста и развития растений в конкретных условиях и на конкретной культуре требует детального изучения.
1.5. Влияние регуляторов роста растений на землянике.
Для интенсификации выращивания здорового посадочного материала плодовых и ягодных культур, в частности земляники, используют различные физиологически активные вещества (Высоцкий, 1982; Поликарпова, 1991; Барабані, 1991;Pankov, 1992).
Сейчас широко применяются при размножении земляники как в культуре in vitro, так и в полевых условиях различные синтетические регуляторы роста (Archbold, 1987; Хаустович, 1991; Чернышев, 2001). Так при примене-
ний ИМК улучшается корнеобразование и общее развитие растений земляники. Гиббереллинн обладает свойством оказывать стимулирующее действие на вегетативный рост растений. Обработка этим препаратом ускоряет образование и увеличивает количество усов (Трушечкин, 1972). Происходит удлинение черешков листьев, увеличивается площадь листа и их количество, удлиняются междоузлия побегов (Агафонов, 1972; Moor, 1987). Ускоренное и более дружное созревание ягод земляники наблюдалось при обработке растений АНУ и ИУК, а также препаратом Этрел (Шахова 1972). При обработке ТУРом улучшалось приживаемость рассады, урожайность (Панков, 1990, 1992). Обработка земляники имунноцитофитом повышала устойчивость к болезням в период бутонизации (Белошапкина, 2000, 2002). Применение препарата Экост /з для опудривания корней при пересадке в грунт у земляники сорта Трибьют позволила более чем в 2 раза увеличить приживаемость растений (Карпова, 1999). В опытах В.В. Вакуленко (2000) при обработке эпином рассады земляники за сутки до пересадки в грунт или сразу после пересадки, приживаемость составляла практически 100%. У растений ускорялись процессы цветения и плодоношения. Они отличались хорошим ростом и развитием. Урожайность земляники возрастала на 20-40%, в плодах увеличивалось количество Сахаров и витамина С, снижалось содержание нитратов, а также количество радионуклидов и тяжелых металлов.
Обработка растений препаратом Универсальный повышает урожайность на 35-56%, его качество, стандартность, улучшается вкус, увеличивается размер ягод, ускоряет их созревание на 4-5 дней, увеличивает содержание в них сахара до 20% (Хилько, 1999, 2001).
В исследованиях О.В. Карповой (2001) при добавлении в среду укоренения эмистима в концентрации 10~3, укоренение земляники начиналось раньше, и корней было больше.
Для повышения устойчивости земляники к вертициллезному увяданию, по сообщениям М.А. Чернобровкиной (2000), в среду можно добавлять кре-зацин из расчета 2,5 мг/л.
37 1.6. Физиологическое действие фитогормонов.
Фитогормоны контролируют все этапы онтогенеза растений. Деление и растяжение клеток, лежащие в основе всех процессов роста и морфогенеза, находятся у растений под контролем ауксинов и цитокининов, поэтому полное отсутствие этих фитогормонов для растений летально. Общая форма растения определяется ауксинами и цитокининами, а также гиббереллинами. Ауксины стимулируют рост верхушки побега, подавляя при этом рост боковых почек, тогда как цитокинины это доминирование преодолевают, вызывая ветвление. Гиббереллины усиливают рост растения, активируя апикальные и интеркалярные меристемы. Ауксины способствуют образованию корней и определяют адаптивные изгибы растения в соответствии с направлением света или вектора силы тяжести (фото- и геотропизм). Формирование аппарата фотосинтеза и транспирация растений регулируются гормонами-антагонистами — цитокининами и абсцизовой кислотой: цитокинины вызывают дифференцировку хлоропластов и открывание устьиц, тогда как абсци-зовая кислота подавляет оба эти процесса. Для многих растений те или иные фитогормоны (гиббереллины, цитокинины, этилен) могут быть индукторами или стимуляторами цветения. Последовательное участие фитогормонов необходимо для нормального формирования плодов и семян. Завязывание и рост плодов стимулируются ауксинами, гиббереллинами и цитокининами, выделяемыми семяпочками или семенами. Созревание и опадение плодов, а также листьев вызываются этиленом и абсцизовой кислотой. Стрессовые воздействия на растения вызывают всплеск количества этилена, а водный дефицит — абсцизовой кислоты. Цитокинины, гиббереллины и, в ряде случаев этилен, способствуют прорастанию семян многих растений и повышают их всхожесть.
Известно, что растительные организмы в природных условиях подвергаются воздействию самых разных неблагоприятных факторов среды. Способность сопротивляться экстремальным условиям произрастания является
залогом существования растений. Реализация механизмов, лежащих в основе адаптации растений к стрессовым условиям, требует больших энергетических затрат и сопровождается одновременно снижением энергетического обеспечения процессов продуктивности. Поэтому использование эндогенных регуляторов роста, в спектре физического действия которых проявляется четко выраженный антистрессовый эффект для повышения устойчивости и продуктивности культурных растений актуально в современном растениеводстве (Тютерев, 2000).
В практике сельского хозяйства нашли применение такие фиторегуля-торы как цитокипины, брассиностероиды, салициловая кислота, а также их синтетические аналоги, характеризующиеся рострегулирующим действием и антистрессовой активностью по отношению к широкому кругу неблагоприятных факторов (Баскаков, 1988; Прусакова, 2000; Seki, 1994; Hare, 1997). Так, обработка растений картофеля в условиях засухи препаратами цитоки-нинового типа действия способствовала уменьшению потерь воды, повышению фотосинтетической активности и оптимизации продукционного процесса (Моргун, 2001). В условиях водного стресса под влиянием препаратов ци-токининового типа действия стабилизировался фотосинтетический аппарат растений пшеницы (Чернядьев, 2001; Монахова, 2004). При обработке растений ячменя картолином и крезацином наблюдалось снижение накопления радиоактивных элементов (Ульяненко, 1993). Известна также защитная роль картолинов на хлебных злаках при почвенной засухе и водном стрессе (Чернядьев, 2001; Монахова, 2002). В условиях избытка влаги в почве внесение экзогенной АБК на пшенице и овсе способствовало нормализации водного обмена, процессов фотосинтеза и роста растений (Платонов, 1999).
На зерновых регулятор роста Эмистим повышал устойчивость растений к воздействию неблагоприятных факторов за счет увеличения содержания специфических белков - лектинов, активизировал ростовые процессы и развитие ассимиляционного аппарата (Артемьева, 1999). Известно также, что этот препарат изменяет гормональный баланс в клетках, в частности увели-
чивает содержание цитокининов, стимулирует и синхронизирует вегетативное развитие растений (Троян, 1997).
Под воздействием крезацина на картофеле происходила активизация фотосинтетического аппарата растений. Сумма хлорофиллов увеличивалась в основном за счет повышения количества хлорофилла b (Казакова, 1990).
В условиях засухи интенсивность транспирации наиболее существенно снижалась в случае обработки семян гороха эпином, что можно связать либо с максимальным закрытием устьиц, либо с увеличением содержания коллоидно-связанной воды. В оптимальных условиях при обработке различными РРР интенсивность газообмена существенно не менялась. В условиях засухи интенсивность фотосинтеза снижалась, особенно при обработке эпином (Клочкова, 2004). Показана положительная роль брассиностероидов в повышении жизнеспособности черенков различных культур в условиях засоления в культуре ткани in vitro (Алиева, 2004). По сообщению некоторых авторов этот препарат влияет на содержание и активность ауксинов, цитокининов и АБК, что обуславливает переход растений от вегетативного состояния к генеративному (Деева, 1995; Шакирова, 1998). Известно также, что брассино-стероиды влияют на баланс эндогенных фитогормонов. Так, при обработке вегетирующих растений картофеля за 2 недели до уборки и клубней после уборки перед закладкой на хранение, были выявлены свойства эпибрассино-лида пролонгировать период глубокого покоя, уменьшалось количество проросших клубней, и длина проростков была ниже, чем в контроле. Под влиянием обработки содержание АБК в клубнях повысилось в 2 раза во время покоя и в 4 раза после его окончания (Кораблева, 1999). В проростках ячменя обработка эпином приводила к увеличению содержания ауксинов и цитокининов как в корнях, так и в листьях; в то время как уровень АБК снижался (Скоробогатова, 1999). В растениях люпина наблюдался аналогичный эффект (Мироненко, 1997).
В больших дозах брассиностероиды сдерживают рост и повышают устойчивость к неблагоприятным внешним факторам (перегреву, заморозкам, засухе, инфекции) (Прусакова, 1999).
Несмотря на то, что регуляторы роста в настоящее время широко применяются в сельском хозяйстве, их влияние на метаболические процессы, которые определяют продуктивность той или иной культуры, практически не изучено.
Подводя итог всему выше сказанному, можно заключить, что достигнуты значительные успехи в культивировании растений земляники in vitro. Однако новые формы земляники обладают значительным генотипическим разнообразием на всех этапах микроклонального размножения. Поэтому их изучение в культуре in vitro является необходимой задачей для ускоренного размножения новых образцов.
Достаточно неизученным остается вопрос о применении нетрадиционных регуляторов роста и развития растений в культуре ткани, и практически отсутствуют такие сведения о землянике.
Неизученным остается вопрос о влиянии новых экологически безопасных РРР на биометрические показатели растений ягодных культур, в частности земляники.
Практически отсутствуют сведения о влиянии новых РРР на физиологические показатели растений.
Поведение растений земляники, размноженных через культуру ткани в полевых условиях
В научной литературе существуют противоречивые сведения о поведении растений земляники, полученных в культуре ткани по сравнению с растениями, размноженными традиционными способами. Некоторые исследователи отмечают отсутствие существенных различий между растениями, размноженными in vitro и их потомством первого поколения, с одной стороны, и контрольных растений, с другой стороны. Так, M.J. Hennety (1987) не отметил существенных различий по количеству и массе плодов между контрольными растениями и размноженными in vitro. Не было отмечено существенных различий по усообразователыюй способности и вегетативной массе (Бе-лошапкина, 1985).
Однако, многие авторы сообщают, что растения земляники, прошедшие через культуру ткани обладают повышенной вегетативной продуктивностью (Cameron, 1985, 1986; Жаркова, 1992). Установлено, что сила роста, число цветоносов на рожок, были выше у растений размноженных через культуру in vitro (Petrevica, 1997). Сообщается также об увеличении урожайности оздоровленных растений на 20-650% (Kristensen, 1986). Растения земляники после культуры ткани характеризуются более интенсивным образованием плетей и розеток, большей площадью листовой поверхности и большей площадью листьев на растении (Янушкевич, 2004). Эти эффекты сохраняются иногда и на следующий год (Damiano, 1980; Navatel, 1985). Однако, существует определенная зависимость между генотипом и эффектом последействия культуры ткани. Так, в год посадки ремонтантные и нейтралыюдневные сорта обладали повышенной усообразовательной способностью. На второй год данный эффект продолжал действовать только у нейтральнодневных сортов (Алексеенко, 1999). Повышение биологической продуктивности растений земляники садовой, полученной в культуре in vitro, происходит в основном за счет увеличения выхода дочерних розеток, а также увеличения количества цветоносов и ягод на одно растение (Swartz, 1981). Некоторые авторы связывают увеличение количества образующихся плетей и розеток с повышенной активностью пазушных почек, вызванной последействием цитокининов в питательных средах (Waithaka, 1980). Однако данный эффект наблюдается не у всех генотипов земляники (Marcotrigiano, 1984). Есть мнение, что это наблюдается вследствие элиминации вирусов при культивировании in vitro (Walkey, 1980).
На характеристику растений в полевых условиях влияют также методы размножения in vitro (Nehra, 1994). На качество посадочного материала земляники, а также на ее биометрические показатели влияет и количество субкультивирований (Navatel, 1986; Boxus, 1986). Экспериментально установлено, что управлять поведением микроразмноженных растений после культуры ткани можно путем включения определенных регуляторов роста в питательную среду (Mohamed, 1991).
Природные и синтетические регуляторы роста и развития растений (РРР), или фиторегуляторы, являются мощным средством управления онтогенезом растений. Поэтому они находят широкое применение в биотехнологии сельскохозяйственных растений и в практическом растениеводстве (Ше-велуха, 1995).
Химическая регуляция онтогенеза растений имеет непосредственное отношение к решению проблем практического растениеводства. Теоретической основой этого направления является учение о фитогормонах и химических регуляторах роста (Полевой, 1982). Согласно современным представлениям о регуляторах роста и развития растений фитогормонами называют вещества, которые синтезируются в растениях, транспортируются по ним и в малых концентрациях способны вызывать ростовые или формативные эффекты. У нас в стране первые работы по изучению роли фитогормонов в регуляции метаболизма растений были начаты в 60-е годы в лаборатории А.Л. Курсанова. Исследования были посвящены изучению роли цитокининов в действии корневой системы на обмен веществ листьев (Кулаева, 1985). Согласно современным взглядам насчитывают шесть известных групп фитогормонов, три из которых открыты сравнительно недавно. Однако, по-видимому, список гормонов растений не исчерпывается ими. Открытие нового фитогормона - очень редкое событие, так как эти вещества присутствуют в растении в очень небольших концентрациях. Тем не менее, очевиден прогресс в изучении регуляторных систем растения, связанный с совершенствованием методов исследования. Фитогормоны условно разделяют на гормоны стимулирующего и ин-гибирующего действия. К первым относятся ауксины, цитокинины, гиббе-реллины, ко вторым - абсцизовая кислота и этилен (Дерфлинг, 1985). Стимуляторы, как следует из названия, вызывают деление клеток, ускоряют процесс роста и развития растений, цветение и плодоношение, выводят семена из состояния покоя. Гормоны этого типа обычно активируют процессы дыхания, обмена веществ, биосинтеза белков, нуклеиновых кислот, метаболические процессы в целом. Ингибиторы, напротив, замедляют рост и развитие, их действие связано с процессами покоя, старения и опадения органов и тканей. На клеточном уровне наблюдается резкое замедление синтеза белков и нуклеиновых кислот. Физиологическая активность подавляющего большинства РРР обусловлена их способностью влиять на какой-то компонент фитогормональной системы. Система гормональной регуляции, как совокупность взаимодействующих гормонов разных классов, во многом определяет характер таких важнейших физиологических процессов как рост и формирование различных органов, время и характер цветения, сроки созревания, переход к состоянию покоя и выход из него семян, почек и пр. Регуляция этих процессов гормонами или их синтетическими аналогами высокоспецифична. Фитогормоны, которые нашли наиболее широкое применение в сельском хозяйстве, относятся к пяти классам: ауксины, цитокинины, гибберел лины, АБК и этиленпродуценты (Муромцев, 1987). . . Для обработки растений могут использоваться синтетические аналоги гормона, как в случае большинства применяемых на практике ауксинов, например используемого в производстве гербицида 2,4-Д или аналог природных цитокининов - 6-бензинаминопурин.
Методика определения влияния РРР на растения земляники в полевых условиях
Фитогормоны контролируют все этапы онтогенеза растений. Деление и растяжение клеток, лежащие в основе всех процессов роста и морфогенеза, находятся у растений под контролем ауксинов и цитокининов, поэтому полное отсутствие этих фитогормонов для растений летально. Общая форма растения определяется ауксинами и цитокининами, а также гиббереллинами. Ауксины стимулируют рост верхушки побега, подавляя при этом рост боковых почек, тогда как цитокинины это доминирование преодолевают, вызывая ветвление. Гиббереллины усиливают рост растения, активируя апикальные и интеркалярные меристемы. Ауксины способствуют образованию корней и определяют адаптивные изгибы растения в соответствии с направлением света или вектора силы тяжести (фото- и геотропизм). Формирование аппарата фотосинтеза и транспирация растений регулируются гормонами-антагонистами — цитокининами и абсцизовой кислотой: цитокинины вызывают дифференцировку хлоропластов и открывание устьиц, тогда как абсци-зовая кислота подавляет оба эти процесса. Для многих растений те или иные фитогормоны (гиббереллины, цитокинины, этилен) могут быть индукторами или стимуляторами цветения. Последовательное участие фитогормонов необходимо для нормального формирования плодов и семян. Завязывание и рост плодов стимулируются ауксинами, гиббереллинами и цитокининами, выделяемыми семяпочками или семенами. Созревание и опадение плодов, а также листьев вызываются этиленом и абсцизовой кислотой. Стрессовые воздействия на растения вызывают всплеск количества этилена, а водный дефицит — абсцизовой кислоты. Цитокинины, гиббереллины и, в ряде случаев этилен, способствуют прорастанию семян многих растений и повышают их всхожесть.
Известно, что растительные организмы в природных условиях подвергаются воздействию самых разных неблагоприятных факторов среды. Способность сопротивляться экстремальным условиям произрастания является залогом существования растений. Реализация механизмов, лежащих в основе адаптации растений к стрессовым условиям, требует больших энергетических затрат и сопровождается одновременно снижением энергетического обеспечения процессов продуктивности. Поэтому использование эндогенных регуляторов роста, в спектре физического действия которых проявляется четко выраженный антистрессовый эффект для повышения устойчивости и продуктивности культурных растений актуально в современном растениеводстве (Тютерев, 2000).
В практике сельского хозяйства нашли применение такие фиторегуля-торы как цитокипины, брассиностероиды, салициловая кислота, а также их синтетические аналоги, характеризующиеся рострегулирующим действием и антистрессовой активностью по отношению к широкому кругу неблагоприятных факторов (Баскаков, 1988; Прусакова, 2000; Seki, 1994; Hare, 1997). Так, обработка растений картофеля в условиях засухи препаратами цитоки-нинового типа действия способствовала уменьшению потерь воды, повышению фотосинтетической активности и оптимизации продукционного процесса (Моргун, 2001). В условиях водного стресса под влиянием препаратов ци-токининового типа действия стабилизировался фотосинтетический аппарат растений пшеницы (Чернядьев, 2001; Монахова, 2004). При обработке растений ячменя картолином и крезацином наблюдалось снижение накопления радиоактивных элементов (Ульяненко, 1993). Известна также защитная роль картолинов на хлебных злаках при почвенной засухе и водном стрессе (Чернядьев, 2001; Монахова, 2002). В условиях избытка влаги в почве внесение экзогенной АБК на пшенице и овсе способствовало нормализации водного обмена, процессов фотосинтеза и роста растений (Платонов, 1999).
На зерновых регулятор роста Эмистим повышал устойчивость растений к воздействию неблагоприятных факторов за счет увеличения содержания специфических белков - лектинов, активизировал ростовые процессы и развитие ассимиляционного аппарата (Артемьева, 1999). Известно также, что этот препарат изменяет гормональный баланс в клетках, в частности увеличивает содержание цитокининов, стимулирует и синхронизирует вегетативное развитие растений (Троян, 1997).
Под воздействием крезацина на картофеле происходила активизация фотосинтетического аппарата растений. Сумма хлорофиллов увеличивалась в основном за счет повышения количества хлорофилла b (Казакова, 1990).
В условиях засухи интенсивность транспирации наиболее существенно снижалась в случае обработки семян гороха эпином, что можно связать либо с максимальным закрытием устьиц, либо с увеличением содержания коллоидно-связанной воды. В оптимальных условиях при обработке различными РРР интенсивность газообмена существенно не менялась. В условиях засухи интенсивность фотосинтеза снижалась, особенно при обработке эпином (Клочкова, 2004). Показана положительная роль брассиностероидов в повышении жизнеспособности черенков различных культур в условиях засоления в культуре ткани in vitro (Алиева, 2004). По сообщению некоторых авторов этот препарат влияет на содержание и активность ауксинов, цитокининов и АБК, что обуславливает переход растений от вегетативного состояния к генеративному (Деева, 1995; Шакирова, 1998). Известно также, что брассино-стероиды влияют на баланс эндогенных фитогормонов. Так, при обработке вегетирующих растений картофеля за 2 недели до уборки и клубней после уборки перед закладкой на хранение, были выявлены свойства эпибрассино-лида пролонгировать период глубокого покоя, уменьшалось количество проросших клубней, и длина проростков была ниже, чем в контроле. Под влиянием обработки содержание АБК в клубнях повысилось в 2 раза во время покоя и в 4 раза после его окончания (Кораблева, 1999). В проростках ячменя обработка эпином приводила к увеличению содержания ауксинов и цитокининов как в корнях, так и в листьях; в то время как уровень АБК снижался (Скоробогатова, 1999). В растениях люпина наблюдался аналогичный эффект (Мироненко, 1997).
Использование нетрадиционных регуляторов роста в культуре in vitro
На сорте Царица все препараты повышали водоудерживающую способность на 5-30% (рис. 15). Однако их влияние на содержание свободной воды было выражено слабо еще слабее РРР повлияли на содержание слабосвязанной и прочносвязанной воды. Транспирация растений земляники сорта Царица под действием регуляторов снижалась (рис. 16). При этом наибольшую эффективность для препаратов было характерно проявлять в своей максимальной концентрации. Содержание воды в тканях растений сильно варьировало по годам (рис. 17). При этом действие препаратов также отличалось в зависимости от года. Стабильность действия проявил препарат эпин, который за все годы исследований на данном сорте с увеличением концентрации увеличивал водосодержание (по сравнению с контролем).
В целом наблюдалась сортоспецифичность действия препаратов. На сортах Русич и Кокинская заря препараты снижали потерю воды при увядании, и тем самым повышали водоудерживающую способность. На сорте Царица сохранилась тенденция к снижению потери воды под действием РРР, однако их влияние было более слабым и не во всех случаях достоверным. Общих концентрационных зависимостей влияния препаратов на разных сортах отмечено не было.
При рассмотрении влияния РРР через 4 и 6 часов завядания были выявлены те же закономерности, что и через 2 часа завядания, но они были выражены более слабо При определении транспирации оказалось, что все препараты на всех сортах понижали этот показатель. Также была отмечена закономерность, что с повышением концентрации препарата его эффект увеличивался, но не во всех случаях действие препаратов было достоверным.
Анализируя водный режим в целом, можно отметить, что показатель транспирация листьев на всех сортах под влиянием РРР снижается. При этом можно отметить, что наибольшее снижение транспирации наблюдалось на сорте Кокинская заря, а наименьшее на Царице. На сортах Русич и Кокинская заря при этом происходило увеличение водоудерживающей способности, и в некоторой степени содержание воды в тканях листьев. На сорте Царица во-доудерживающая способность под действием препаратов изменялась слабо, однако возрастала оводненность тканей.
Согласно шкале оценки водного режима принятого в каталоге ВИР по землянике для определения относительной засухоустойчивости сортов степень потери воды при завядании отрицательно, а оводненность листьев положительно связаны с устойчивостью к водному дефициту. По показателю «потеря воды при увядании» все исследованные нами сорта относятся к группе высокоустойчивых (Каталог ВИР, 1989). Можно предполагать, что данные сорта относятся к растениям с различными типами водного обмена и приспособлениями к условиям водного дефицита.
Регуляторы роста сильнее повлияли на наиболее лимитирующий для сорта Царица показатель, т.е. повысили оводненность листьев, а на сортах Кокинская заря и Русич они еще более увеличили их водоудерживающую способность. Кокинская заря и Русич они еще более увеличили их водоудерживающую способность.
Таким образом, можно заключить, что РРР во всех случаях способствовали экономии воды и улучшению водного баланса растений.
Накопление Сахаров растениями перед зимовкой - один из важнейших показателей, характеризующий способность растений подготовится к тяжелым условиям перезимовки. Сахара синтезируются в листьях и затем накапливаются в других частях растений, обеспечивая морозостойкость зимующих частей растений. Для характеристики накопления Сахаров мы анализировали их содержание в листьях растений.
Отсутствие роста и переход к состоянию зимнего покоя в осенний период позволяет землянике хорошо подготовиться к зимнему периоду и выдерживать кратковременные морозы. Основное повреждающее влияние на растительный организм оказывает льдообразование. При этом лед может образовываться как в самой клетке, так и вне ее. Накопленные сахара препятствуют обезвоживанию клеток и защищают от повреждения мембраны, затрудняют образование и рост кристаллов льда в протоплазме. В связи с этим мы изучали влияние РРР на накопление Сахаров, анализировали содержание общих Сахаров, кетосахаров и гидролизуемых Сахаров.
Все препараты на всех сортах увеличивали сахаронакопление. Однако наблюдалась сортоспецифичность действия РРР (табл. 15). Наименьшее влияние препараты оказали на сорте Русич (эффективность действия составляла от 100 до 124% по отношению к контролю), наибольшее - на сорте Кокинская заря (122 - 159%). Сорт Царица занимал промежуточное положение.
Эффективность действия препарата Эмистим на сортах Русич и Кокинская заря с увеличением концентрации увеличивалась, содержание Сахаров при максимальной концентрации составляло 117 и 134% соответственно, на сорте Царица оптимальное действие оказала средняя концентрация (120%).
Препарат крезацин на сортах Русич и Царица наибольшее влияние оказывал в максимальной своей концентрации (124 и 131% соответственно). На сорте Кокинская заря оптимальное и наибольшее из всех препаратов действие проявилось в минимальной концентрации препарата (159%).
Влияние регуляторов роста на усообразовательную способность растений земляники
Используемые нами регуляторы роста и развития растений относятся к различным классам химических соединений и не являются явными аналогами классических фитогормонов (ауксинов, цитокининов, АБК, этилена или гиббереллинов). Если для классических фитогормонов характерно четко выраженное регуляторное действие на отдельные физиологические процессы, то выбранные нами регуляторы роста оказывают менее специфическое общее стимулирующее действие на растения. Так в нашей работе эти РРР оказывали стимулирующий эффект в культуре ткани, повышали усообразовательную способность и продуктивность растений земляники. Влияние на данные интегральные показатели складывается из воздействия препаратов на отдельные физиологические процессы или системы. В частности, было обнаружено, что РРР оказывали положительное действие на водный обмен растений, повышали сахаронакопление растений перед зимовкой, стимулировали общее накопление хлорофилла и увеличивали степень его связанности. При этом изученные нами препараты в различных физиологических процессах оказывали влияние свойственное для разных фитогормонов. Так накопление хлорофилла стимулируется цитокининами, закладка генеративных органов стимулируется цитокининами и гиббереллинами. Гиббереллины играют большую роль в стимул роста усов. Усиленное укоренение розеток земляники можно отнести к ауксиновым эффектам, а снижение транспирации и увеличение водоудерживающей способности - к эффектам АБК. Некоторые препараты в культуре ткани были вполне способны заменить цитокинины
Несколько отдельно от используемых регуляторов роста стоит эпин. В последнее время большинством ученых он относится к отдельному классу фитогормонов. Данный регулятор выступает как адаптоген и стимулятор с широким спектром физиологического действия. Поэтому по характеру своего воздействия на рост и развитие растений земляники он подобен остальным выбранным нами препаратам. Использование изученных нами регуляторов роста, как в культуре ткани, так и в полевых условиях, положительно сказывалось на росте и развитии растений.
Продуктивность растений является динамическим показателем и зависит от множества факторов. На него могут влиять климатические и почвенные условия, пораженность болезнями и вредителями, физиологическое состояние растений, в частности их водный режим.
В наших исследованиях все изученные нами регуляторы роста способствовали оптимизации водного баланса растений: снижалась транспирация, увеличивалась водоудерживающая способность, оптимизировалась оводнен-ность тканей. Улучшение водного баланса могло происходить также вследствие увеличения накопления Сахаров, под действием которых увеличивается осмотический актив клеток, что препятствует оттоку из них воды.
Известно, что продуктивность большинства с.-х. растений связана с регуляцией метаболизма Сахаров. Они являются основным фотоассимилятом растений, источником энергии и вещества для биосинтетических процессов. В нашей работе было показано, что регуляторы роста способствовали увеличению накопления Сахаров. Кроме того сахара выполняют защитную функцию при перезимовке растений. Основное повреждающее влияние на растительный организм оказывает льдообразование и обезвоживание клеток. При этом лед может образовываться как в самой клетке, так и вне нее. Сахара, накапливаясь в клетках, препятствуют образованию кристаллов льда внутри клетки и обезвоживанию цитоплазмы. Таким образом, регуляторы роста обеспечивают условия для перезимовки растений и образование запасов питательных веществ для будущего роста и развития
В основе продуктивности с.-х. растений лежит процесс фотосинтеза. Данный процесс также подвержен влиянию многих факторов. В процессе поглощения света и конверсии его энергии в биохимические реакции важную роль играет фотосинтетическая пигментная система. Под действием РРР увеличилось общее содержание хлорофилла и степень его связанности с хлорофилл связывающим белком. Увеличение мощности фотосинтетического аппарата и степени его структурированности должно способствовать повышению фотосинтетической активности. С этим хорошо кореллирует повышение усообразовательной способности, увеличение продуктивности, сахарона-копление.
В нашей работе часто наблюдалась сортоспецифичность действия препаратов, что, по-видимому, связано с особенностями использованных нами сортов. Все сорта относятся к разным группам спелости, имеют разные гено-типические особенности. Однако даже в этом случае используемые регуляторы роста проявляли высокую активность. И хотя на разных сортах оптимально действовали разные концентрации препаратов все изученные нами регуляторы роста можно использовать как достаточно мощные факторы, влияющие на рост и развитие растений земляники, что подтверждает их универсальность
