Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди микотических инфекций кандидоз занимает ведущее место. Особое значение эта патология приобретает в гинекологической практике: кандидозный вагинит (KB) составляет до 20-30% в структуре инфекций урогенитального тракта. Практически каждая вторая женщина за свою жизнь имеет хотя бы один эпизод КВ. Несмотря на то, что современная антимикотическая терапия достаточно эффективна в отношении острой инфекции, лечение хронического рецидивирующего KB не всегда является результативным. Проблема противорецидивной терапии осложняется ещё и тем, что при широком использовании препаратов азоловой группы возможно формирование устойчивости кандид к ним.
В этой связи возникает необходимость поиска альтернативных путей этиотропной терапии КВ. Возможным перспективным направлением такого поиска является изучение ферментов, воздействующих на дрожжеподобные грибы (ДПГ). Одним из них является литиказа, разрушающая маннопротеиновый комплекс - основной структурный элемент клеточной стенки ДПГ. Исходя из вышеизложенного, актуальным является изучение действия литиказы на вирулентность Candida albicans, что может служить основанием для использования указанного фермента в создании препарата, альтернативного существующим антимикотикам.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было оценить фермент литиказу, расщепляющий маннопротеиновый комплекс клеточной стенки Candida albicans, как основной элемент нового антимикотического препарата в комплексном лечении рецидивирующего кандидозного вагинита.
Поставленная цель достигалась путём последовательного решения следующих задач:
-
Выбор перспективного штамма - продуцента литиказы.
-
Отработка режима его культивирования и оптимизации получения фермента.
-
Отработка способа выделения, очистки литиказы и её стандартизации.
-
Оценка действия полученного фермента на клинические изоляты Candida albicans: определение литического действия, влияние на жизнеспособность ДПГ, адгезивные свойства, морфогенез, способность к фагоцитозу и продукцию ферментов агрессии - протеиназ.
-
Создание модели рецидивирующего KB на лабораторных животных.
-
Исследование действия литиказы на течение рецидивирующего KB у мышей.
Научная новизна. Предложена оригинальная модель рецидивирующего кандидозного вагинита, адекватная KB женщин. В опытах in vivo доказан терапевтический и противорецидивный эффект литиказы.
Определено фунгицидное и фунгистатическое действие литиказы.
Установлено, что возбудитель KB, подвергшийся действию литиказы, теряет способность адгезироваться на вагинальном эпителии, но остаётся способным коадгезироваться с лактобактериями. Кандиды, обработанные литиказой, .,
активнее фагоцитируются и становятся доступными действию лизосомных ферментов макрофагов.
Впервые было показано, что коммерческий препарат Контрикал ингибирует продукцию ферментов агрессии Candida albicans - аспартил-протеиназ, в результате чего переход ДПГ в мицелиальную форму не реализуется. А под действием литиказы происходит нарушение структуры клеточной стенки, что способствует образованию проростковых трубок без индукции протеиназ. Такой вариант морфогенеза не сопровождается повышением инвазивности.
Установленные факты позволяют считать рациональным включение в схему лечения KB литиказы и ингибиторов протеиназ.
Практическая значимость. Разработана технология получения литиказы из природного продуцента Cellulomonas cellulans АС-870. Предложенная схема выделения и очистки искомого продукта позволяет получить литиказу, превышающую по удельной активности современные коммерческие образцы. Полученный по предложенной технологии фермент может быть основой лечебного препарата, предназначенного для лечения KB и профилактике его рецидивов. Включение в схему лечения KB фермента, разрушающего маннопротеиновый комплекс клеточной стенки ДПГ и ингибитора протеиназ, можно рассматривать как альтернативу использования антимикотиков из группы азолов в случае развития к ним резистентности. Положения, выносимые на защиту.
-
Рецидивирующий кандидозный вагинит воспроизводится на лабораторной модели путём заражения мышей, предварительно обработанных антибиотиками и эстрадиолом, адаптированным штаммом С. albicans. Рецидив инфекции вызывается аналогичной повторной обработкой мышей, но без дополнительного их заражения.
-
На лабораторной модели рецидивирующего KB был продемонстрирован терапевтический эффект литиказы, заключавшийся в быстрой санации влагалища и отсутствии рецидива инфекции после попытки его индукции.
-
Выбран продуцент литиказы - Cellulomonas cellulans АС-870.
-
Разработана технология получения и очистки литиказы путём культивирования на сердечно-мозговом бульоне с добавлением пекарских дрожжей и последующим выделением искомого продукта с молекулярной массой в интервале 100-30 кД методом ультрафильтрации. Установлен терапевтический эффект литиказы за счёт частичной гибели популяции ДПГ в результате их лизиса, а также снижение адгезии оставшихся жизнеспособными кандид на вагинальном эпителии.
-
Доказано, что ДПГ, обработанные литиказой, сохраняют коадгезивные свойства в отношении лактобактерий, но становятся более доступными к действию фагоцитов.
-
Подтверждено, что ДПГ под действием литиказы, несмотря на активацию морфогенеза, не активируют ферменты агрессии - аспартил-протеиназы.
7. Разработан и рекомендуется к применению новый способ снижения патогенного потенциала С. albicans за счёт использования ингибитора аспартил-протеиназ, блокирующего переход ДПГ в мицелиальную форму. Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались:
- на Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008.
Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики
и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008);
- на Всероссийской научной конференции с международным участием
«Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных
системах» (Москва, 2009);
- на заседании кафедры микробиологии и вирусологии РУДН.
Публикации: По теме диссертации опубликовано 6 работ. Из них 3 статьи в
журналах рекомендованных ВАК РФ, остальные - тезисы докладов на
международных конференциях.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 31 рисунок. Работа состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 180 источников из них 63 отечественных и 117 иностранных.
