Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Современные представления о гидролизе и всасывании пищевых веществ в желудочно-кишечном тракте млекопитающих 10
1.2. Значение микрофлоры для макроорганизма 24
1.3. Препараты, вызывающие изменения в микрофлоре кишечника 33
1.4. Заключение 38
ГЛАВА 2. Методы исследования 40
2.1. Подготовка и проведение опытов с животными 40
2.2. Сбор материала для биохимических и бактериологических
исследований 42
2.3.Условия инкубации 43
2.4. Определение активности ферментов 44
2.5. Морфологический анализ 45
2.6. Бактериологическое исследование 45
2.7. Статистический анализ экспериментальных данных 46
Результаты собственных исследований 47
Глава 3. Предварительные эксперименты 47
3.1. Влияние способа введения бактериальных препаратов на некоторые функциональные параметры организма и пищеварительной системы 47
3.2. Влияние введения молока на кишечные пищеварительные ферменты 57
ГЛАВА 4. Действие пробиотической культуры е. faecium 13 на функциональные показатели организма и кишечные пищеварительные ферменты у здоровых животных 67
4.1. Масса тела крыс, масса слизистой оболочки и химуса 67
4.2. Пищеварительные ферменты 70
ГЛАВА 5. Влияние антимикробных препаратов на пищеварение в кишечнике
5.1. Общее состояние организма и состав кишечной микробиоты 77
5.2. Структура кишечника и масса химуса 80
5.3.Пищеварительные ферменты 83
ГЛАВА 6. Влияние различных пробиотических бактерий на общее состояние организма и функциональные показатели кишечника у крыс с экспериментальным дисбиозом 93
6.1. Общее состояние организма животных и состав кишечной микробиоты 93
6.2. Масса слизистой оболочки кишечника и масса химуса 97
6.3. Пищеварительные ферменты 97
ГЛАВА 7. Обсуждение 106
7.1. Вводные замечания 106
7.2. Изменение структурно-функциональных параметров кишечника у здоровых крыс после введения пробиотических энтерококков
7.3. Изменение структурных и функциональных показателей кишечника после введения антимикробных препаратов 111
7.4. Эффективность молочнокислых пробиотических бактерий в отношении восстановления пищеварительной функции кишечника... 115
Выводы 118
Список использованной литературы 120
- Значение микрофлоры для макроорганизма
- Морфологический анализ
- Влияние введения молока на кишечные пищеварительные ферменты
- Структура кишечника и масса химуса
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из важнейших достижений в области физиологии и медицины в последние десятилетия явилось установление того факта, что микрофлора, населяющая организм человека и животных, не только полезна, но и необходима для его жизнедеятельности. Этим определяется актуальность исследования влияния живых бактерий, входящих в состав нормальной микробиоты человека и животных, на организм в целом и его различные системы в норме и при различных нарушениях состава микробиоты.
Известно, что наиболее многочисленная и сложная по составу популяция бактерий находится в кишечнике, в особенности в его нижних отделах (Уголев, 1991; тендеров, 1998; Falk, 1998; Backhed et al., 2005; Sekirov et al., 2010). О важности этой популяции свидетельствует ее участие в питании организма (Уголев, 1991; Шендеров, 1998; Falk, 1998; Sekirov et al, 2010) и регуляции его жирового обмена (Backhed et al., 2004), в регуляции обновления кишечного эпителия (Falk, 1998; Rakoff-Nahoum, Medzhitov, 2008), в усилении воспалительных, иммунных ответов и защиты от патогенных микроорганизмов (Шендеров, 1998; Falk, 1998; Дисбиоз кишечника, 2009; Sekirov et al., 2010). Показано, что различные нарушения состава кишечной микробиоты, именуемые дисбиозами, могут провоцировать вторичные нарушения, менять реактивность организма, вызывать различные патологии (Уголев, 1991; Noverr et al., 2005; Дисбиоз кишечника, 2009; Sekirov et al., 2010).
Многие из этих представлений нашли отражение в современной теории адекватного питания и междисциплинарной науке трофологии, основы которых были заложены академиком A.M. Уголевым (Уголев, 1991).
В последнее время всё более широкое применение в клинической практике находят пробиотики - препараты или продукты, созданные на основе живых представителей резидентной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и животных или полезных микроорганизмов, выделенных из пищевых продуктов. Они позволяют существенно повысить эффективность восстановления функций органов пищеварительной системы и, как следствие, общего состояния организма после нарушений, обусловленных воздействием различных факторов окружающей среды, в том числе антимикробных препаратов (Бельмер, Гасили-на, 2005; Ардатская, Минушкин, 2006; Ткаченко, Успенский, 2006; Lutful, Kabir, 2009). Применение пробиотиков оказалось также весьма успешным при лечении многих заболеваний (Ткаченко, Успенский, 2006; Goldin, Gorbach, 2008).
Несмотря на накопленный обширный материал в отношении функциональной роли кишечной микробиоты в организме человека и животных, до сих пор остаются открытыми многие вопросы, касающиеся, в частности, структурных и
функциональных перестроек пищеварительной системы под влиянием различных изменений в составе кишечной микробиоты. Весьма существенным из них является вопрос об изменениях, происходящих в структуре кишечника и мембранном пищеварении в здоровом организме под действием пробиотиков, вводимых в профилактических целях. Исследование данной проблемы в отношении мембранного пищеварения особенно важно в связи с тем, этот тип пищеварения, будучи заключительным этапом переваривания пищевых веществ, в значительной степени определяет общий метаболизм организма и его гомеостазис.
Слабо изучен вопрос о влиянии современных антимикробных препаратов на структуру кишечника и на мембранное пищеварение.
В настоящее время практически отсутствуют сведения об эффективности и особенностях действия используемых пробиотических препаратов в отношении восстановления структурных и функциональных показателей слизистой оболочки кишечника, нарушенных, в частности, вследствие применения антибиотиков.
В связи с методическими ограничениями проведение соответствующих исследований на людях практически неосуществимо. Работа с экспериментальными животными также сопряжена с определенными методическими трудностями, чем, вероятно, объясняется незначительное число работ, посвященных этим вопросам.
Цель и задачи исследования. В экспериментах на крысах изучить влияние живых пробиотических бактерий на мембранные пищеварительные ферменты у здоровых животных и оценить эффективность и особенности действия различных пробиотических штаммов в коррекции нарушений мембранного пищеварения, вызванных применением антимикробных препаратов.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. После внутрижелудочного введения здоровым крысам живых пробиоти
ческих бактерий Enterococcus faecium L3 в течение 7 и 14 суток определить у
этих животных в слизистой оболочке и химусе кишечника активности ряда
ферментов, участвующих в заключительных стадиях гидролиза эфиров фосфор
ной кислоты (щелочная фосфатаза), углеводов (мальтаза) и белков (аминопеп-
тидаза М и глицил-Ь-лейциндипептидаза). В этих условиях оценить также
функциональное состояние организма животных (масса тела, внешний вид,
физическая активность, характер фекалий).
2. При внутрижелудочном введении крысам антимикробных препаратов
(ампициллин + метронидазол) в течение трех и пяти суток исследовать измене
ния структуры кишечника и активности указанных кишечных ферментов в
слизистой оболочке и химусе различных его отделов, а также состав кишечной
микробиоты и функциональное состояние организма.
3. В модели экспериментального дисбиоза, индуцированного введением крысам антимикробных препаратов, оценить возможность и специфические особенности коррекции нарушений мембранного пищеварения, состава кишечной микробиоты и функционального состояния организма животных с использованием живых пробиотических бактерий Enterococcus faecium L3 (Е. f. L3) и Lactobacillus fermentum Z (L.f. Z) .
Научная новизна работы. Впервые показано, что действие пробиотических бактерий E.f. L3 на структурно-функциональные параметры кишечника зависит от длительности введения препарата; характер изменений указанных параметров специфичен в отношении различных (по функциональной роли) кишечных пищеварительных ферментов.
Установлено, что трехсуточное введение антимикробных препаратов (ам-пициллин+метронидазол) в нетоксических дозах изменяет структурно-функциональные показатели кишечника, большинство из которых после пятисуточно-го введения восстанавливается в отношении слизистой оболочки, но не химуса.
Получены новые данные об эффективности применения пробиотических бактерий Е. f L3 и L. f Z животным с экспериментальным дисбиозом кишечника в отношении восстановления ряда его функциональных показателей. Выявлены сходство и специфические особенности в действии указанных пробиотиков на прирост массы тела животных, массу слизистой оболочки кишечника и активности различных кишечных пищеварительных ферментов в его слизистой оболочке и химусе.
Теоретическое и практическое значение работы. В теоретическом плане полученные результаты расширяют существующие представления об адаптации пищеварительной системы, описывая перестройки структурно-функциональных характеристик тонкой кишки у взрослых животных под влиянием изменений в кишечной микробиоте, вызванных введением пробиотических бактерий.
В прикладном аспекте данные, полученные в работе, способствуют пониманию тех процессов, которые могут иметь место в кишечнике, при назначении пробиотиков в лечебно-профилактических целях. Кроме того, они дополняют имеющиеся сведения о пробиотической эффективности штаммов E./.L3 и L.f Z, демонстрируя их эффективность в коррекции ряда структурно-функциональных нарушений в кишечнике, вызванных применением антимикробных препаратов.
Данные о нарушении структуры и пищеварительной функции кишечника после трёхсуточного введения антимикробных препаратов указывают на важность контроля состояния кишечника в ранний период и, в случае необходи-
мости, применения фармакологических средств для коррекции указанных нарушений.
Полученные результаты могут быть использованы в научно-исследовательской работе, а также в курсах лекций по физиологии, энзимологии и микробиологии.
Апробация работы. Основные положения работы докладывались на: II Съезде физиологов СНГ (2008); VI Всероссийской конференции с международным участием, посвященном 50-летию открытия A.M. Уголевым мембранного пищеварения (2008); 2-м Международном конгрессе по пробиотикам «С.-Петер-бург-Пробиотики 2009»; 7-й Научной сессии Института гастроэнтерологии и клинической фармакологии СПбГМА им. И.И.Мечникова (2010); Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 85-летию со дня основания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (2010); 13-ом Международном Славяно-Балтийском научном форуме «С.-Петербург - Гастро-2011»; Конгрессе международного союза микробиологических сообществ (IUMUS) Sapporo 2011; VIII Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 220-летию со дня рождения акад. К.М. Бэра (2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ: 3 статьи (в рецензируемых журналах) и 10 тезисов докладов.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на _147_страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов исследования, результатов собственных исследований и
Значение микрофлоры для макроорганизма
Ротовая полость. В ней обеспечивается механическое измельчение пищи, ее первичная химическая обработка, вкусовая рецепция, а также формирование пищевого комка для его последующей транспортировки через пищевод в желудок. Химическая обработка пищи, в частности, наиболее распространённого полисахарида - крахмала, в ротовой полости заключается, в основном, в его частичном расщеплении на декстрины, олигосахариды и мальтозу под действием а-амилазы слюны (Jennings, 1972; Заболотных и др., 1974; Spiller et al., 1994; Pedersen et al, 2002; Salles et al., 2011). В литературе постулируется отсутствие гидролиза жиров в ротовой полости, но некоторые исследователи обнаружили минимальные активности липазы в слюнных железах человека (Брокерхоф, Джексен, 1978; Nagato, Masuno, 1993; Chen et al., 2006).
Желудок. Характеристика желудка как пищеварительного органа представлена в целом ряде фундаментальных обзоров (Jennings, 1972; Barnard, Prosser, 1977; Ивашкин, 1981; Физиология человека, 2003; Начала физиологии, 2004). В его полости продолжается процесс механической деградации пищи за счет перемешивающего действия мускулатуры. Под влиянием соляной кислоты желудочного сока происходит денатурация белков, а под действием протеолитических ферментов осуществляются начальные стадии их гидролиза.
В полости желудка может происходить частичный гидролиз жиров благодаря действию желчи и панкреатического сока, забрасываемых антиперистальтическими движениями двенадцатиперстной кишки при приеме жирной пищи. Кроме того, при отсутствии интенсивного перемешивания в глубине содержимого желудка может сохраняться нейтральная и слабощелочная среда, что создает условия для продолжения процесса гидролиза крахмала, начавщегося в ротовой полости под действием а-амилазы слюны (Boisen, Eggum, 1991; Физиология человека, 2007).
Регуляторное сопряжение параметров эвакуаторной деятельности гастродуоденального комплекса и панкреатической экзосекреции обеспечивается ферментными, кислотно-основными и нутриентными свойствами дуоденального химуса (Коротько, 2011). Несмотря на важность предварительной физико-химической обработки пищи в полости желудка, первостепенная его роль как органа пищеварительной системы состоит, по-видимому, в реализации депонирующей и эвакуаторной функций.
Тонкая кишка. У высших млекопитающих, в том числе и человека, после эвакуации из желудка в тонкую кишку, пища подвергается дальнейшему перевариванию в полости кишки и на поверхности её слизистой оболочки в ходе мембранного пищеварения. Важную роль в этом процессе играют ферменты поджелудочной железы, собственно кишечные ферменты и желчь (Физиология человека, 2003; Начала физиологии, 2004; Физиология человека, 2007).
В тонкой кишке поддерживается ионный баланс таким образом, чтобы нейтрализовать соляную кислоту, поступающую из желудка, и сохранить pH в диапазоне 6.5 - 7.5, характерный для кишечника фактически всех позвоночных (Уголев, 1985; Kaunitz, Akiba, 2006; Mizumori et al., 2006).
Толстая кишка. Пищеварение в толстом кишечнике происходит на достаточно низком уровне. Здесь подвергаются гидролизу остатки непереваренных пищевых веществ за счёт ферментов, поступающих в составе химуса из верхних отделов кишечника, ферментов, вырабатываемых слизистой оболочкой самой толстой кишки, и ферментов микрофлоры, населяющих данный биотоп. При участии бактериальных ферментов продолжается деградация углеводов, белков и липидов, нерасщепленных в тонкой кишке. В итоге образуются органические кислоты, аминокислоты, витамины В1, В2, К, которые всасываются в кишечнике и используются макроорганизмом, газы (углекислый газ, метан, сероводород), играющие важную роль в процессе регуляции всасывания и секреции воды и электролитов, ряд токсичных веществ (фенол, скатол, индол, крезол) и др. (Митрохин и др., 1997; Gill et al, 2006; Binder, 2010; Pouokam et al., 2011). В толстой кишке преобладают процессы реабсорбции. Здесь всасывается до 95% воды и электролиты (Binder, 1978; Phillips, Devroede, 1979; Said, 2011). При нарушении функций вышележащих отделов пищеварительного тракта могут компенсаторно возрастать некоторые ферментативные активности в толстой кишке (Уголев, 1985; Иезуитова, Тимофеева, 1999).
Основными структурными элементами слизистой оболочки тонкой кишки млекопитающих являются кишечные ворсинки и крипты (Гистология, цитология и эмбриология. 2002). Кишечные ворсинки - выросты собственной пластинки слизистой оболочки кишки. Кишечные (либеркюновы) крипты - трубчатые углубления эпителия слизистой оболочки кишечника, расположенные в собственной пластинке слизистой оболочки (Физиология человека, 2003; Начала физиологии, 2004). Кишечные ворсинки покрыты однослойным эпителием, образующим единое целое с либеркюновыми криптами (Маев, Самсонов, 2005). У большинства высших животных и человека мембранный гидролиз происходит на особых структурах поверхности клеток кишечного эпителия -микроворсинках, ассоциированных со специализированной структурой -гликокаликсом (Рис. 1.1). принято считать, что основная функциональная роль кишечных ворсинок состоит в значительном увеличении площади всасывательной поверхности слизистой оболочки. Вместе с тем недавно было показано, что сложная архитектура кишечной поверхности (наличие складок, ворсинок) влияет также на пространственную организацию пищеварительных процессов, способствуя более эффективному сопряжению мембранного гидролиза и транспорта пищевых веществ (Груздков и др., 2010; Gruzdkov et al., 2012).
Состав кишечного химуса в отношении входящих в него пищевых и других компонентов, а следовательно, характер пищеварительно-транспортных процессов, существенно меняется как в продольном (по длине кишечника), так и в радиальном (от полости к поверхности эпителия) направлениях. Отражением этого является пространственная неоднородность свойств кишечника, то есть, существование так называемых проксимо-дистальных и апикально-криптальных градиентов (Адаптационно-компенсаторные процессы, 1991). Во многих экспериментальных исследованиях это показано в отнощении структурных показателей кишки: диаметра кишки, массы слизистой, высоты ворсинок, скорости обновления эпителия и др., а также в отношении ряда ее функциональных характеристик: биоэлектрической активности, интенсивности моторики, активности панкреатических и многих собственно кишечных ферментов, всасывательной способности (Spencer, 1964; Уголев, 1967; Wiseman, Booth, 1968; Уголев, Иезуитова, 1982, 1991; Кушак, 1983; Karasov, Diamond, 1987; Alpers, 1987; Madara, Trier, 1987). Существует также значительная индивидуальная вариабельность функциональной топографии тонкой кишки, которая зависит от возраста животного, его функционального состояния, состава пищи, режима питания и ряда других факторов (Moog, 1965; Koldovsky, 1983; Уголев и др., 1970, 1986а; Уголев, 1972, 1978, 1985; Corring, 1980; McCarthyet al., 1980; Смирнов, Уголев, 1981; Уголев, Иезуитова, 1982, 1991; Тимофеева и др., 1987; Адаптационно-компенсаторные процессы, 1991).
Морфологический анализ
В качестве дополнительного контроля были проведены эксперименты по оценке влияния на кишечные пищеварительные ферменты введения в желудок крыс молока. Следует отметить, что молоко, не являясь абсолютным аналогом пробиотической закваски, служит субстратом для развития культуры и содержит аналогичный набор большинства нутриентов что и закваска, но в нем не присутствуют сами микроорганизмы и продукты их метаболизма.
В наших опытах вводилось лишь 0.5 мл молока, которое в кислой среде желудка подвергалось створаживанию и частичному гидролизу под действием кислоты и ферментов желудка. Можно считать, что в полость кишки поступало весьма незначительное количество молочного сахара и содержащихся в молоке микроэлементов. Были сформированы две группы животных. Крысам контрольной группы (К) на протяжении 10 суток в интервале 18:00-19:00 через зонд вводилась вода в объёме 0.5 мл, а опытной группы (М) в аналогичных условиях 0.5 мл стерильного молока. в данной серии опытов тонкая кишка (без двенадцатиперстной) делилась на три участка, равные по длине. Для поеледующего анализа из нее брались два отрезка длиной по 5 см каждый: 1) между проксимальной и медиальной третями (Т1-Т2) и 2) из середины дистальной трети (ТЗ). Из середины толстой кишки также брался участок длиной 5
По количеству потребленного корма и воды, как и по изменению массы тела в течение 10 дней опыта, между животными обеих групп не было статистически значимых различий (Рис. 3.7). Также отсутствовали изменения массы слизистой оболочки в проксимальном и медиальном участках тонкой кишки. Вместе с тем достоверно снижалась масса слизистой оболочки в дистальной трети тонкой кишки (на 21%, Р 0.05) и в толстой кишке (на 35% Р 0.01)(Рис.3.8).
После 10-дневного введения молока активность щелочной ФосФатазы была ниже, чем после введения воды, в слизистой оболочке всех исследованных отделов кишечника, причем в отрезке, взятом между проксимальной и медиальной третями тонкой кишки (Т1-Т2) это снижение было статистически достоверным (на 45%, Р 0.05) (Рис.3.9, А). В химусе кишечника активность этого фермента существенно не различалась у обеих групп животных (К и М) (Рис. 3.9, Б).
Мальтазная активность в слизистой оболочке тонкой кишки в rovnne крыс, которым вводилось молоко (М), была выше, чем в группе с введением воды (К), лишь в дистальной трети тонкой кишки (на 45%, но статистически недостоверно) (Рис. 3.10, А). Можно отметить также несколько меньшую ферментативную активность в химусе всех отделов кишечника в группе М 205-195 185 175, 165
Обозначения: К - контрольная группа (введение воды); М - опытная rovnna живота (введение молока). РУ по сравнению с группой К (Рис. 3.10, Б). Наибольшие различия (статистически недостоверные) были в тощей кишке (Т1-Т2) и в толстой кишке (Тл) (на 28 и 22%, соответственно.
Активность аминопептиттачи М в слизистой оболочке и в химусе различных отделов кишечника также, основном, была сходной у крыс обеих экспериментальных групп. Только в слизистой оболочке толстой кишки она была меньше на 52% (Р 0.01) у крыс, которым вводили молоко, по сравнению с теми, которым вводилась вода (Рис. 3.11).
Не наблюдалось достоверных различий между животными групп К и М в отношении гщицил-Ь-лейттиндипептияязнпй активности в слизистой оболочке и в химусе различных отделов кишечника (Рис. 3.12). Вместе с тем можно отметить, что по сравнению с животными, которым в течении 10 дней вводилась вода (группа К), у крыс с введением молока (группа М) активность этого фермента была почти на 40% ниже в слизистой оболочке дистальной трети тонкой кишки, но на 26% выше в химусе этого же участка кишки
Таким образом, результаты предварительных экспериментов показывают, что стресс, обусловленный регулярным введением крысам в течение 7-14 дней через металлический зонд в пищеварительный тракт воды или молока, в целом не оказывает значительного влияния на исследованных ферментов в слизистой оболочке и в химусе различных отделов кишечника. Это свидетельствует об адекватности примененного нами способа принудительного введения крысам препаратов пробиотиков при проведении основных экспериментов.
Вместе с тем наличие в ряде случаев достоверных различий, особенно при относительно краткосрочных экспериментах, диктует необходимость в формировании контрольных групп животных с введением через зонд растворов сравнения.
Влияние введения молока на кишечные пищеварительные ферменты
Целью данного фрагмента работы являлось исследование реакции пищеварительных ферментов кишечника у крыс без экспериментального дисбиоза на введение живой пробиотической культуры E.faecium L3.
Были проведены две серии экспериментов продолжительностью 7 и 14 дней, в каждой из которых использовалось по две группы животных. В контрольных группах крысам через пищевод вводилось молоко в объеме 0.5 мл в течение семи и четырнадцати дней (группы К1 и К2 соответственно). Животным экспериментальных групп аналогичным образом вводилось 0.5 мл закваски Е. faecium L3 на молоке в количестве 10 КОЕ/мл в течение семи и 14 дней (группы А1 и А2 соответственно).
На рис. 4.1 представлена динамика изменения массы тела у крыс опытных групп (А1 и А2) через 7 и 14 дней после начала введения закваски Е. faecium L3, а также у крыс контрольных групп (К1 и К2) после введения молока. Как можно видеть, практически отсутствовали различия между животными опытных и контрольных групп по приросту массы тела в оба указанных срока. В частности, в группах К2 и А2 скорости прироста массы тела составляли в среднем 4.77±0.24 и 4.96±0.25 г в сутки соответственно.
Масса слизистой оболочки у крыс опытной группы А2 статистически достоверно отличалась от контроля (после введения молока) только в дистальной трети тонкой кишки, где она была больше на 19% (Р 0.02), а в толстой кишке меньше на 39% (Р 0.01) (рис. 4.2, А).
Масса химуса после 7-суточного введения пробиотика была несколько больше, чем у контрольных животных, в проксимальной (на 28%) и дистальной (на 20%) третях тонкой кишки, но достоверно меньше (на 31%) в слепой кишке (Р 0.02) (рис. 4.2, Б). После двухнедельного введения 270 2604
Влияние введения пробиотической закваски E.faecium L3 в пищеварительный тракт крыс на динамику изменения массы их тела.
По оси абсцисс: продолжительность опыта (дни); по оси ординат: масса тела животных (г) (М±щ, N = 6).
Обозначения: А1 и А2 - опытные группы животных, которым вводилась закваска E.faecium L3 на молоке в течение 7 и 14 дней, соответственно; К1 и К2 -контрольные группы (введение молока в те же ероки). К1 А1 К2 А2
Масса слизистой оболочки (А) и масса химуса (Б) в различных участках кишечника после 7-дневного (А1) или 14-дневного (А2) введения в пищевод закваски E.faecium L3 на молоке; К1 и К2 - соответствующие контроли (введение молока).
По вертикали: на А - масса слизистой оболочки (г); на Б - масса химуса (г) (М±т, N=6). Обозначения: Т1,Т2 и ТЗ - проксимальная, медиальная и дистальная трети тонкой кишки, соответственно, Сл - слепая кишка, Тл - толстая кишка. Р 0.05; Р 0.02; Р 0.01 по отношению к соответствующим контролям. пробиотика у крыс опытной группы (А2) масса химуса в тонкой кишке была ниже, чем в контроле (К2) в ее проксимальном (на 20%, Р 0.05) и дистальном (на 26%, Р 0.02) участках.
Пищеварительные ферменты Щелочная фосфатаза. Как можно видеть на рис. 4.3, активность этого фермента в слизистой оболочке тонкой кишки у крыс опытных и контрольных групп существенно не различалась при обоих сроках введения пробиотической закваски. Следует отметить, что в дистальной трети тонкой кишки у крыс в группе А1 как удельная, так и интегральная активности были почти в 2 раза меньше (Р 0.02 и Р 0.05 соответственно), чем в контрольной группе К1 (Рис. 4.3, А, Б). Однако вклад этого участка в суммарную ферментативную активность щелочной фосфатазы слизистой оболочки всех отделов кишечника составляет менее 5%.
На активность щелочной фосфатазы во фракции химуса в большей степени повлияло введение E.faecium L3 в течение 14 дней (Рис. 4.3, В), в результате чего она была достоверно ниже (Р 0.0027), чем в контрольной группе К2, в проксимальном (на 75%), медиальном (на 40%), и дистальном (на 47%) участках тонкой кишки. В толстой кишке она была ниже, чем в контроле на 59% (Р 0.01).
Мальтаза. На седьмой день введения закваски E.faecium L3 у крыс опытной группы (А1) удельная мальтазная активность в слизистой оболочке проксимальной трети тонкой кишки была меньше, чем в соответствующей контрольной группе (К1) на 14% (Р 0.02). Достоверно меньшее (на 62%, Р 0.02) по сравнению с контролем значение интегральной активности этого фермента наблюдали также в слизистой оболочке толстой кишки. Через 14 дней после начала введения пробиотика (группа А2) существенных отличий от контроля (группа К2) в отношении мальтазной активности в слизистой оболочке кишечника отмечено не было (Рис. 4.4, А и Б).
Структура кишечника и масса химуса
Аминопептидаза М. Активность этого фермента в слизистой оболочке всех отделов кишечника у крыс обеих опытных групп (А1 и А2) практически не отличалась от значений в соответствующих контрольных группах (К1 и К2) (Рис. 4.5, А и Б). В химусе кишечника ферментативная активность через 7 дней после начала введения пробиотика была на 44% выше, чем в контроле (Р 0.02), в проксимальной трети тонкой кишки, и в три раза больше (Р 0.02) в толстой кишке. В медиальной и дистальной третях тонкой кишки наблюдалось тенденция к увеличению активности (соответственно на 36% и на 22%) по сравнению с контролем, однако различия не были статистически достоверными (Рис. 4.5, В). После 14-дневного введения закваски Е. faecium L3 активность аминопептидазы М в химусе стала, напротив, несколько меньше (статистически не достоверно) ее значений в контроле во всех отделах кишечника.
Глицил-Ь-лейциндипептидаза. Как можно видеть на рис. 4.6, реакция этого фермента на введение пробиотической закваски Е. faecium L3 отличалась от реакции аминопептидазы М. В частности, после 7- и 14-дневного введения пробиотика удельная активность дипептидазы в слизистой оболочке проксимальной трети тонкой кишки крыс была ниже, а в ее медиальной и дистальной третях, напротив, выше, чем в контроле, причем, в медиальной трети у крыс в группе А2 - на 80% (РО.05) Аналогичная картина наблюдалась и в отношении интегральной активности этого фермента в слизистой оболочке (рис. 4.5, Б), причем в дистальной трети тонкой кишки в группе А2 активность была почти в два раза выше, чем в соответствующем контроле К2 (Р 0.05). КІ А1 К2 А2
Остальные обозначения такие же, как на рис.4.3, 4.4 и 4.5. Р 0.05; Р 0.01; Р 0.0027 по отношению к соответствующим контролям. Активность глицил-Ь-лейциндипептидазы в химусе проксимальной трети тонкой кишки была достоверно выше ее значений в контроле как при 7-дневном (Р 0.0027), так и при 14-дневном (Р 0.01) введении пробиотика: на 106% и 23%, соответственно. При этом отсутствовали существенные различия между опытными и контрольными животными в отношении активности этого фермента в химусе других отделов кишечника.
Для оценки влияния антибиотиков на пищеварительные ферменты, в качестве основной была выбрана разработанная Е.И. Ермоленко и соавторами (Ермоленко и др., 2009) модель дисбиоза кишечника у крыс, вызванного применением антибиотиков. Учитывая время обновления популяции энтероцитов кишечного эпителия (около 3 суток), для определения момента наибольшего проявления дисбиотических нарушений, было сформировано две экспериментальные группы животных (А1 и А2), которые исследовались через 3 и 5 суток после ежедневного введения в желудок через пищевод антимикробных препаратов (метронидазол, ампициллин), а также две контрольные группы (К1 и К2), в которых животным в те же дни аналогичным способом вводилась вода. Детальное описание этой экспериментальной модели приведено в главе 2.1.
Данные внешних наблюдений над контрольными и опытными животными показало наличие у последних после введения антимикробных препаратов ряда признаков дисбиоза: светлый жидкий стул, полифекалия, взъерошенная грязная шерсть, беспокойство.
Сопоставление массы некоторых внутренних органов и общей массы химуса (Табл. 5.1) у контрольных и опытных групп крыс показало наличие у последних после введения антимикробных препаратов признаков патологических процессов.
Масса тела животных. На рис. 5.1 представлена динамика изменения массы тела у контрольных и опытных крыс в различные сроки после начала эксперимента. Как можно видеть, в отношении прироста массы тела между опытом и контролем не было существенных различий при обоих сроках Таблица. 5.1.
Стрелкой показан первый день введения в желудок крыс антимикробных препаратов (опыт) или воды (контроль).
Обозначения: К1 и К2 - животные контрольных групп (N1= N2 = 4); А1 и А2-животные опытных групп (введение антимикробных препаратов) (N1= N2= 5). проведения эксперимента. Так, у крыс в группе А2 после введения антибиотиков в течение 5 суток он составил 6.60±0.31 г в сутки, а у крыс группы К2 в тот же период после введения воды - 5.53±1.87 г в сутки.
Состав кишечной микробиоты Ранее нами (Ермоленко и др., 2009) в близких экспериментальных условиях (отличие состояло в том, что антибиотики вводились животным не внутрижелудочно, а в ротовую полость) было обнаружено снижение (в 20-100 раз) количества лактобацилл, бифидобактерий, энтерококков и увеличение (в 10-100 раз) числа патогенных и условно патогенных бактерий (Klebsiella spp., Proteus spp.. Staphylococcus aureus, Clostridium spp. и грибов рода Candida sp.) в фекалиях крыс после трехсуточного применения ампициллина и метронидазола (по сравнению с исходными уровнями - до введения антибиотиков) (Рис. 5.2). Эти результаты служат прямым подтверждением развития дисбиоза кишечника в условиях используемой экспериментальной модели.
Структура кишечника и масса химуса Значения этих показателей в различных отделах кишечника через 3 и 5 суток после ежедневного внутрижелудочного введения ампициллина и метронидазола (опыт) или воды (контроль) приведены на рис. 5.3. Как можно видеть, через 3 суток (Рис. 5.3, А, I) после начала введения этих препаратов у крыс опытной группы по сравнению с животными соответствующей контрольной группы масса слизистой оболочки была ниже на 32% в проксимальной трети тонкой кишки (Р 0.0027) и на 24% - в толстой кишке (Р 0.05). Через 5 суток после начала введения антимикробных препаратов (Рис. 5.3, А, II) масса слизистой оболочки у крыс второй опытной группы практически не отличалась от таковой в соответствующем контроле во всех отделах кишечника.
