Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы.
1.1. Основные сведения о блокаде щитовидной железы при угрозе радиационного заражения. Физиологические механизмы влияния йодида калия на функциональную активность гипофизарно-тиреоидной системы. Сравнительный анализ йод-содержащих лекарственных препаратов. 21
1.2. Физиологические механизмы влияния йодида калия на функциональную активность гипофизарно-гонадной системы. Взаимодействие гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-гонадных систем 33
1.3. Натрий – йодный симпортер щитовидной железы и влияние йодида калия на его функцию..Натрий – йодный симпортер в экстратиреоидных тканях 37
1.4. Влияние йодида калия на апоптоз 40
1.5. Характеристика микроэлементов йода и селена и их функциональная взаимосвязь в животных организмах. Содержание йода и селена в тканях людей и крыс 44
1.6. Современные методы микроанализа йода и селена в биологических тканях. Теоретические основы ренгенфлюоресцентных методов (РФА и РМА). Виды рентгеновских спектрометров и их сравнение 54
1.7. Особенности пробоподготовки при аналитическом определении йода и селена .59
1.8. Применение ренгенфлюоресцентных методов для определения йода и селена в тканях человека и крыс .62
Глава 2 Материалы и методы исследования
2.1. Принципы группировки материала (дизайн исследования) 65
Методы исследования 70
2.2. Взвешивание образцов... 70
2.3. Термометрия у крыс 70
2.4. Цитологическое исследование вагинальных мазков самок – крыс 71
2.5. Иммуноферментный анализ гормонального статуса экспериментальных животных .71
2.6. Морфологические методы: морфологическое исследование тканевых образцов (световая микроскопия) и иммуногистохимическое исследование фрагментов органов 74
2.7. Количественный микроанализ: количественный рентген-флюоресцентный микроанализ и количественный рентгеноспектральный микроанализ (РМА) образцов тканей с помощью спектрометра волновой дисперсии 78
2.8. Статистические методы 82
Результаты собственных исследований и их обсуждение
Глава 3. Разработка метода дегидратации образцов биологических тканей с помощью комбинации вакуумного и термального подсушивания 84
Глава 4. Определение содержания йода и селена в эндокринных органах крыс с помощью количественного рентгеноспектрального микроанализа 89
Глава 5. Определение содержания йода в некоторых эндокринных тканях женщин и самок-крыс с помощью количественного рентгеноспектрального микроанализа .94
Экспериментальное исследование влияния йодида калия на гипофизарно-тиреоидную и гипофизарно-гонадную системы самок-крыс 99
Глава 6. Исследование воздействия йодида калия на гипофизарно –тиреоидную и гипофизарно – гонадную системы самок – крыс при однократном введении в дозировке 4 мкг /100 г массы животного 100
6.1. Исследование терморегуляции у самок крыс при однократном введении йодида калия в дозировке 4 мкг /100 г массы животного 102
6.2. Исследование функциональной активности тиреоидной и репродуктивной систем при однократном введении йодида калия в дозировке 4 мкг /100 г массы животного 102
6.3. Морфологическое исследование яичников самок-крыс при однократном введении йодида калия в дозировке 4 мкг /100 г массы животного 106
6.4. Определение маркеров апоптоза в щитовидных железах, гипофизах и яичниках самок-крыс при однократном введении йодида калия в дозировке 4 мкг /100 г массы животного 106
Глава 7. Исследование воздействия йодида калия на гипофизарно– тиреоидную и гипофизарно–гонадную системы самок–крыс при однократном введении в различных дозировках 114
7.1. Исследование терморегуляции у самок крыс при при однократном введении йодида калия в различных дозировках 115
7.2. Определение гормонов гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно - гонадной систем в сыворотке крови самок – крыс при однократном введении йодида калия в различных дозировках 113
7.3. Определение экспрессии тиреотропного, фолликуло-стимулирующего и лютеинизирующего гормонов в гипофизах самок–крыс при однократном введении йодида калия в различных дозировках 120
7.4. Определение экспрессии натрий-йодного симпортера в щитовидных железах, гипофизах и яичниках самок–крыс при однократном введении йодида калия в различных дозировках 124
7.5. Определение экспрессии каспазы 3 и каспазы 8 в щитовидных железах, гипофизах и яичниках самок–крыс при однократном введении йодида калия в различных дозировках .129
7.6. Количественный рентгенспектральный анализ содержания йода в щитовидных железах, гипофизах и яичниках самок–крыс при однократном введении йодида калия в различных дозировках 134
Глава 8. Исследование воздействия йод-индуцированной блокады щитовидной железы на гипофизарно–тиреоидную и гипофизарно–гонадную системы самок– крыс 145
8.1. Региональная точечная термометрия 146
8.2.Определение гормонов гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно -гонадной систем в сыворотке крови самок – крыс при йод-индуцированной блокаде щитовидной железы 151
8.3. Определение экспрессии тироидстимулирующего гормона в гипофизе при йод-индуцированной блокаде щитовидной железы 159
8.4. Определение экспрессии натрий-йодного симпортера в щитовидной железе, гипофизе и яичниках при йод-индуцированной блокаде щитовидной железы 159
8.5. Определение экспрессии каспазы 3 в щитовидной железе, гипофизе и яичниках при йод-индуцированной блокаде щитовидной железы 166
8.6. Количественный рентгеноспектральный микроанализ йода и селена в щитовидной железе и гипофизе самок-крыс при йод-индуцированной блокаде щитовидной железы 173
Заключение 184
Разработка метода дегидратации образцов биологических тканей с помощью комбинации вакуумного и термального подсушивания 184
Определение содержания йода и селена в эндокринных органах крыс с помощью количественного рентгенспектрального микроанализа .187
Количественный рентгенспектральный микроанализ содержания йода в щитовидных железах, гипофизах и яичниках женщин и самок – крыс 189
Физиологические механизмы влияния йод-индуцированной блокады щитовидной железы на гипофизарно-тиреоидную и гипофзарно-гонадную системы самок-крыс 191
Физиологические механизмы влияния йодида калия на гипофизарно– тиреоидную и гипофизарно–гонадную системы самок – крыс при однократном введении в дозировке 4 мкг /100 г массы животного .194
Физиологические механизмы влияния йодида калия на гипофизарно–тиреоидную и гипофизарно–гонадную системы самок – крыс при однократном введении в различных дозировках 196
Физиологические механизмы влияния йод-индуцированной блокады щитовидной железы на гипофизарно–тиреоидную и гипофизарно–гонадную системы самок – крыс 209 ВЫВОДЫ 226
Практическое использование полученных результатов 230
Список литературы
- Физиологические механизмы влияния йодида калия на функциональную активность гипофизарно-гонадной системы. Взаимодействие гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-гонадных систем
- Цитологическое исследование вагинальных мазков самок – крыс
- Исследование терморегуляции у самок крыс при однократном введении йодида калия в дозировке 4 мкг /100 г массы животного
- Определение гормонов гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно - гонадной систем в сыворотке крови самок – крыс при однократном введении йодида калия в различных дозировках
Введение к работе
Актуальность исследования. В связи с аварией на атомной станции в г. Фукусима (Япония) в 2011 году вновь возник интерес к изучению физиологических механизмов влияния на человека и животных основного средства блокировки щитовидной железы (БЩЖ) при угрозе радиационного заражения – калия йодида (КЙ) (, 2011). Основную опасность для биологических организмов при авариях на атомных электростанциях или после ядерных взрывов представляют радиоизотопы (в основном 131I). Даже минимальное количество радиоактивного йода при попадании в щитовидную железу может обеспечить дозу облучения, приводящую к малигнизации органа (, 1985).
Эффективность КЙ в качестве средства профилактики поражения щитовидной железы обусловлена эффектом Вольфа–Чайкова - физиологическим торможением функции щитовидной железы при воздействии высоких концентраций йодидов. По общепринятой версии, КЙ насыщает тиреоциты стабильным нерадиоактивным йодом, и радиоактивные изотопы не поглощаются щитовидной железой.(, 2006).
Исследования прошлых лет не выявили серьезных побочных эффектов КЙ. По заключениям многочисленных комитетов и организаций, исследующих данный вопрос, основное осложнение при назначении КЙ – гипертиреоз (йод – Базедов), который наблюдается у людей с гиперчувствительностью к йоду (International basic safety standards for protection against ionizing radiation and for the safety of radiation sources., 1996).
Но при появлении клинических и экспериментальных данных о роли избытка йода в возникновении и прогрессировании рака щитовидной железы (Kanno J, 1992), применение БЩЖ было ограничено (Recommendation of the German Commission on Radiological Protection (Use of Iodine Tablets for Thyroid Blocking in the Event of a Nuclear Accident), 2011).
Не теряет актуальности и изучение возможных побочных эффектов БЩЖ в экстратиреоидных органах. По заключению FDA (2001)(Управление по контролю за продуктами и лекарствами (США)) использование КЙ в Польше после аварии на Чернобыльской АЭС дало полезную информацию о его безопасности (Nauman J, 1993). Однако по мнению некоторых экспертов, возможные побочные эффекты КЙ до сих пор систематически не исследованы (, 2011), а оценка неблагоприятных последствий БЩЖ опирается на косвенные данные из смежных областей (, 2002, , 1985 ).
Например, общепризнано, что гипотиреоз связан с нарушениями менструального цикла (Poppe K. 2007). Однако результаты исследования влияния антитиреоидных препаратов на репродуктивную функцию разноречивы – имеются данные как о наличии негативного воздействия (Hapon MB.2010), так и о безопасности антитиреоидной терапии (Armada-Dias L. 2001). Аналогичные вопросы вызывает и влияние йод-индуцированной БЩЖ (ЙИ БЩЖ) на репродуктивную функцию.
Все вышеизложенные проблемы применения КЙ тесно связаны с нерешенными до сих пор вопросами физиологических механизмов влияния ЙИ БЩЖ.
Wolff J. в 1969 году, в обзорной статье, посвященной двадцатилетию исследований эффекта Вольфа-Чайкова, отмечал, что достоверность гипотезам о физиологических механизмах влияния йода на щитовидную железу может дать только непосредственное определение йода в щитовидной железе. При йод – индуцированной БЩЖ активно исследовались изменения содержания йода в щитовидной железе (, 2011), однако эти данные опирались, в основном, на косвенные показатели – исследования проводились чаще всего с помощью радиоизотопных методов, с ориентировкой на скорость накопления элемента. Трудности при аналитическом определении йода были связаны с его малой концентрацией в биологических объектах.
В связи с тем, что йод не органифицируется в экстратиреоидных органах, не уделялось особого внимания изменениям содержания йода в экстратиреоидных органах при БЩЖ. Хотя в литературе имелись сведения о накоплении йода в гипофизе и половых железах при йодной нагрузке (Trunnell J.B., 1950 ).
Взаимосвязь йода и селена определяется ролью селена в синтезе, метаболизме и активации тиреоидных гормонов - как компонента дейодиназ и глутатионпероксидаз (Ko.hrle J.,2005). Однако сложности в определении содержания селена, как и йода, обусловлены их малыми концентрациями в биологических тканях.
Количественный рентгеноспектральный микроанализ (РМА) является одним из наиболее чувствительных современных методов микроанализа, однако требует дегидратации образцов. Традиционно для дегидратации использовалась длительное термальное подсушивание, несмотря на возможные потери йода при пробоподготовке (20 – 60 %) (Покровский А.А., 1981). Оптимизация пробоподготовки биологических препаратов для РМА могла бы позволить применить этот метод для исследования содержания йода и селена как в щитовидной железе, так и в экстратиреоидных органах.
Сопоставление функциональных изменений эндокринных органов при ЙИ БЩЖ с количественным микроанализом внутриорганного содержания йода и селена возможно, позволило бы уточнить некоторые физиологические механизмы влияния йодидов.
В литературе имеются данные о том, что йодиды стимулируют процессы апоптоза в щитовидной железе (Lenvann P., 2006). Однако физиологические механизмы действия йодидов на апоптоз в щитовидной железе остаются дискутабельными. Разнятся данные и по путям йодиндуцированного апоптоза (Mutaku J F, 2002).
Особую актуальность этому аспекту физиологического механизма действия йодидов дали исследования, посвященные влиянию йода на апоптоз в экстратиреоидных малигнизированных тканях, например, в тканях молочной железы (Shrivastava, A., 2006.) и легких (Zhang L., 2003). Однако внимание исследователей было посвящено исследованию культур раковых клеток. Данные о воздействии йодидов на апоптоз в физиологических тканях, особенно экстратиреоидной локализации и in vivo, очень скудны.
Указанные предпосылки послужили основанием для целенаправленного исследования физиологических механизмов влияния ЙИ БЩЖ на функциональные параметры гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-гонадной систем с изучением внутриорганных йода, селена и маркеров апоптоза.
Целью исследования явилось изучение в эксперименте функционального состояния гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-гонадной систем при влиянии йод-индуцированной БЩЖ с определением интраорганного содержания йода, селена и маркеров апоптоза.
Задачи исследования:
-
Разработать методику пробоподготовки биологических тканей, позволяющую применить для исследования микроэлементов рентгенспектральный микроанализ.
-
Определить с помощью РМА содержание йода и селена в эндокринных органах у крыс (щитовидная железа, гипофиз, яичники, семенники, гипоталамус, поджелудочная железа).
-
Определить с помощью РМА содержание йода в щитовидной железе, гипофизе и яичниках у женщин и сравнить их с показателями у самок – крыс.
-
Выявить особенности функционального состояния гипофизарно–тиреоидной (ТТГ, Т3 и Т4 в крови) и гипофизарно–репродуктивной систем (ФСГ, ЛГ, эстрадиол, прогестерон в крови) и экспрессию тканевого натрий – йодного симпортера (НИС) в щитовидной железе, гипофизе и яичниках самок – крыс при влиянии однократного применения КЙ в дозировке 4 мкг/100г веса животного.
-
Исследовать возможность воздействия КЙ в дозировке 4 мкг/100 г веса животного на проапоптические факторы (каспаза 3, 8 и Bcl) в щитовидной железе, гипофизе и яичниках у самок – крыс.
-
Изучить особенности влияния однократного применения КЙ при различных дозировках (1, 4, 8 и 25 мкг/100г веса животного) на изучаемые функциональные параметры гипофизарно – тиреоидной и гипофизарно – репродуктивной систем самок – крыс (с исследованием экспрессии ТТГ, ФСГ и ЛГ в гипофизе), уровни экспрессии каспаз и НИС в щитовидной железе, гипофизе и яичниках.
-
Определить с помощью РМА уровень интраорганного йода в щитовидной железе, гипофизе и яичниках; выяснить значимость дозозависимости для физиологических механизмов действия однократных доз КЙ .
-
Изучить динамические особенности влияния ЙИ БЩЖ при дозе КЙ 8 мкг/100г веса животного на функциональные параметры гипофизарно – тиреоидной и гипофизарно – репродуктивной систем самок – крыс (с исследованием изменений экспрессии ТТГ в гипофизе), уровни экспрессии каспазы 3 и НИС в щитовидной железе, гипофизе и яичниках.
-
Определить с помощью РМА уровень интраорганного йода и селена (щитовидная железа, гипофиз); выяснить роль интраорганного йода и селена в физиологических механизмах ЙИ БЩЖ.
Научная новизна исследования.
Впервые разработана методика пробоподготовки биологических субстратов для РМА (комбинация вакуумной и термальной сушки) позволяющая минимизировать потерю микроэлементов в исследуемых тканях (патент № 2366952, 2009).
Впервые проведено с помощью РМА определение уровня йода и селена в щитовидной железе и большинстве эндокринных органов крыс; в щитовидной железе, гипофизах и яичниках женщин. Сформулировано понятие «базисного уровня» йода - уровня йода в йод-позитивных точках (ЙПТ) большинства экстратиреоидных эндокринных органов крыс. Выявлено, что видовое различие в содержании йода характерно не только для щитовидных желез, но и для гипофизов и яичников.
Впервые проведена дифференциация влияния «малых фармакологических доз» йодидов в зависимости от соотношения их с «базисным уровнем» йода в щитовидной железе: при дозе, соответствующей «базисному уровню» щитовидная железа накапливает йод, при превышении – теряет.
Впервые выявлено, что в физиологических механизмах влияния КЙ активно участвует гипофиз: выявлено, что при дозах КЙ, превышающих уровень йода в щитовидной железе, происходит накопление йода в ЙПТ гипофиза. Этот процесс сопровождается изменением функциональной активности гипофиза как в отношении тиреоидной, так и гонадной систем: снижается уровень ТТГ (как в крови, так и экспрессии в гипофизе) и повышается уровень ФСГ и ЛГ (как в крови, так и экспрессии в гипофизе).
Впервые выявлено, что гипофиз играет значимую роль в физиологических механизмах воздействия ЙИ БЩЖ: на фоне нормальных показателей тиреоидных гормонов происходит рост уровня йода в ЙПТ гипофиза, экспрессии НИС, экспрессии каспазы 3 и снижение экспрессии ТТГ. Эти изменения наблюдаются на день раньше уменьшения уровня йода, роста экспрессии НИС и экспрессии каспаз в щитовидной железе.
Впервые установлено, что «критический уровень снижения йода» в щитовидной железе, при достижении которого начинается ребаунд-эффект, соответствует «базисному уровню йода». Скачкообразный рост экспрессии ТТГ в гипофизе за день до ребаунд-эффекта синхронен с падением йода в щитовидной железе до «базисного уровня».
Впервые выявлена взаимосвязь уровня интраорганного йода и экспрессии каспаз, установлена органозависимость направления этой взаимосвязи – в щитовидной железе - обратная, в гипофизе - прямая. Впервые выявлена обратная взаимосвязь уровней селена и экспрессии каспаз в гипофизе.
Впервые выявлено, что ЙИ БЩЖ оказывает тормозящее влияние на гипофизарно - гонадную системы самок – крыс; с участием активации каспазозависимого апоптоза в яичниках.
Теоретическая и практическая значимость
В теоретическом аспекте нами была подтверждена гипотеза, что при БЩЖ интратиреоидальный йод снижается до критического уровня. Было установлено, что «критический уровень снижения интратиреоидального йода» соответствует «базисному уровню» йода в ЙПТ экстратиреоидных эндокринных органов самок-крыс.
По результатам исследования была выдвинута гипотеза о дозозависимости влияния малых фармакологических доз йодидов: накопление щитовидной железой йода происходит при дозировках, не превышающих «базисный уровень». При увеличении дозировок щитовидная железа йод не накапливает, однако йод аккумулируется в ЙПТ гипофиза: этот процесс сопровождается активацией местного каспазозависимого апоптоза и снижением функциональной активности гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно – гонадной системам самок-крыс.
Были выявлены изменения содержания селена в гипофизе при ЙИ БЩЖ: было установлено, что снижению уровня селена в селен-позитивных точках (СеПТ) гипофиза за пределы чувствительности РМА соответствуют максимальные подъемы экспрессии гипофизарных каспаз самок-крыс.
Было установлено, что у женщин по сравнению с самками - крысами уровень йода выше как в щитовидной железе, так и в яичниках и гипофизах, видозависимо и соотношение уровней йода в вышеназванных органах. Полученные результаты необходимо учитывать при экстраполяции «крыса – человек» в исследованиях, посвященных воздействию йода на гипофизаро - тиреоидную и гипофизарно-гонадную системы.
В практическом аспекте полученные знания физиологических механизмов ЙИ БЩЖ обосновывают новые возможности оптимизации доз КЙ, применяемых при угрозе радиационного заражения и оценки возможных осложнений со стороны репродуктивной системы при проведении вышеназванных мер профилактики.
Предложенный нами метод пробоподготовки биосубстратов для РМА дает новые возможности исследования микроэлементов с минимальными потерями в процессе аналитических процедур и повышения точности определения микроэлементов.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Уровень йода в йод-позитивных точках (РМА) большинства экстратиреоидных эндокринных органов одинаков (« базисный уровень») и видоспецифичен. При блокаде щитовидной железы «критический уровень снижения йода» соответствует « базисному уровню»
2. Механизмы воздействия йодида калия на щитовидную железу, гипофиз и яичники органоспецифичны и дозозависимы.
При воздействии доз йодидов, аналогичных «базисному уровню», щитовидная железа накапливает йод, при увеличении дозы – теряет.
Гипофиз при повышении дозы свыше «базисного уровня» аккумулирует йод в ЙПТ. В яичниках накопления йода не выявлено.
3. Процесс аккумуляции йода в ЙПТ гипофиза сопровождается снижением функциональной активности как гипофизарно-тиреоидной, так и гипофизарно-гонадной систем.
4. Уровень интраорганного йода взаимосвязан с каспазо-зависимым апоптозом: в щитовидной железе эта зависимость обратная, в гипофизе – прямая. Максимальный рост каспаз в гипофизе сопровождается снижением уровня селена в СеПТ гипофиза.
Личный вклад соискателя
Постановка проблемы, цель и задачи исследований, разработка программы исследований и её методологии, экспериментальные работы, анализ и обобщение полученных результатов выполнены автором лично, в качестве соискателя Центра оперативной оценки состояния человека (руководитель центра, зав. кафедрой технологии спорта и системного анализа, профессор докт. биол. наук Исаев А.П.). Отдельные разделы диссертации выполнены в сотрудничестве (доля участия автора не менее 75%) с сотрудниками кафедры фармакологии (зав. кафедрой проф. докт. биол. наук Самородова И.М.), кафедры анатомии и гистологии (зав. кафедрой проф. докт. вет. наук Стрижиков В.К.) ФГБОУ ВПО «Уральская академия ветеринарной медицины МСХР РФ», лаборатории электронной микроскопии Южно-Уральского государственного университета (заведующий кафедрой – профессор докт. техн. наук Михайлов Г.Г.), научно-исследовательского центра «Нанотехнологии» Южно-Уральского государственного университета (заведующий докт. хим. наук Авдин В.В.), иммунологической лаборатории НУЗ «Дорожная клиническая больница ОАО «РЖД» на ст. Челябинск» (заведующая отделением Малахова Е.Г.), областном патологоанатомическом бюро МЗ Челябинской области (начальник – канд. мед. наук Г.В. Сычугов).
Внедрение результатов исследования
Методика пробоподготовки биологических субстратов для РМА (комбинация вакуумной и термальной сушки) позволяющая минимизировать потерю микроэлементов в исследуемых тканях внедрена в работу научно-исследовательского центра «Нанотехнологии» Южно-Уральского государственного университета (заведующий докт. хим. наук Авдин В.В.) и лаборатории электронной микроскопии Южно-Уральского государственного университета (заведующий кафедрой – профессор, докт. техн. наук Михайлов Г.Г.). Положительные результаты внедрения методов, соответственно, 63,1% и 95,0%.
Результаты диссертации используются в научной и педагогической практике: лекционном курсе и на практических занятиях кафедры анатомии и гистологии , кафедры физиологии и фармакологии животных и человека, кафедры акушерства, кафедры терапии и кафедры хирургии Уральской академии ветеринарной медицины МСХР РФ (Троицк).
Апробация работы
Основные положения диссертации представлены на:
XX Российской конференции по электронной микроскопии, г.Черноголовка, 2–3 июня 2008г.
Юбилейной научно-практической конференции к 50-летию факультета ветеринарной медицины АГАУ, 100-летию со дня рождения И.С. Ржанициной, г.Барнаул, 11 октября 2012.
Международной научно-практической интернет-конференции, посвященной 65-летию кафедры паразитологии Ставропольского ГАУ «Современные тенденции в ветеринарной медицине», Ставрополь, 21 ноября 2012 г.
5 интернациональном конгрессе федерации европейского общества микроэлементологов «Fifth International Congress of FESTEM», Авиньон, Франция, 22–24мая 2013 г.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 22 печатные работы: их них - 4 в зарубежных рецензируемых журналах («Endocrlne Regulation»,V.44, 2010; «Endocrlne Regulation», V. 45(1), 2011; «Endocrlne Regulation», V. 45(3), 2011; «Biological Ttrace Element Research», V. 154(2), 2013); 13 статей в ведущих рецензируемых журналах, определенных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций. Получено 2 патента Российской Федерации на метод исследования и способ лечения.
Структура и объем диссертации состоит из введения, 8 глав, заключения, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 260 страницах, содержат 13 таблиц, иллюстрированы 45 рисунками. Библиография включает 271 источников, из них 232 зарубежных.
Физиологические механизмы влияния йодида калия на функциональную активность гипофизарно-гонадной системы. Взаимодействие гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-гонадных систем
Авария на Чернобыльской АЭС показала, насколько серьезную угрозу для здоровья населения представляет подобная чрезвычайная ситуация. Одно из её тяжелых последствий – значительный рост больных раком щитовидной железы, особенно среди детей (Шилин Д.Е., 2000). По мнению экспертов, причиной явилось избирательное накопление изотопов радиоактивного йода в ткани щитовидной железы (Kazakov V.S. et al.,1992). Из-за высоких уровней загрязнения этими изотопами некоторых территорий специалисты МАГАТЭ характеризовали первую неделю после Чернобыльской аварии как «период йодного удара».
Особенностью радиационных аварий на АЭС или других предприятиях, имеющих ядерно-энергетические установки и использующих обогащенный уран-235, является наличие в выбросе, наряду с другими бета- и гамма-излучателями, радиоактивных изотопов йода (131I, 132I , 133I , 135I), составляющих 23% от общей активности продуктов атомного реактора. Эти изотопы представляют наибольшую опасность в течение первого месяца, хотя максимально долгоживущий из них 131 I имеет период полураспада около 8 суток (Verger P.,2001).
Радиоактивные изотопы йода могут поступать в организм через органы дыхания, пищеварения, раневые и ожоговые поверхности. В ранний период после аварии опасность представляет ингаляционный путь, при котором радиоизотопы быстрее, чем при пероральном, проникают в кровь и в течение первых суток максимально накапливаются в щитовидной железе. Избирательная и быстрая концентрация радиоизотопов йода в щитовидной железе обусловливает относительно высокие дозы облучения как самой железы, так и всего организма (Ron E. et al., 1995).
По мнению некоторых исследователей, большее влияние имеет так же поступление радиоактивного йода с молоком от животных, выпасаемых на загрязнённых пастбищах, и с загрязнёнными овощами и фруктами (Buglova E. et al.,1997).
В условиях дефицита йода щитовидная железа обладает повышенной способностью накапливать радиоактивный йод: в эксперименте при 50% дефиците йода в рационе животных (75 мкг/сут.) уровень накопления радиоизотопов возрастает в 2,7 раза. Следовательно, радиационные поражения щитовидной железы в таких условиях будут протекать более тяжело и проявляться в более ранние сроки. Этот вывод был подтвержден клиническими исследованиями (Шилин Д.Е., 1994).
Величина поглощённой дозы зависит также от функционального состояния щитовидной железы: нормально функционирующая щитовидная железа взрослого человека накапливает около 30%; при гиперфункции щитовидной железы накопление происходит быстрее и достигает 50%; при гипофункции – медленнее и в меньшем количестве (до 15 – 25% ) (Герасимов Г.А.. 2003).
Накопление радиоизотопов йода зависит от возраста: у детей вследствие малых размеров железы и её повышенной функциональной активности поглощённые дозы в несколько раз выше, чем у взрослых (Jacob P. Et al., 1998).
Поглощение радиоактивного йода щитовидной железой беременной женщины на 35-50 % выше, чем у женщины вне беременности. Радиоактивный йод с высокой скоростью переходит из организма матери к плоду через плацентарный барьер; накопление радиоактивного йода в щитовидной железе плода начинается с 12-13 недели беременности и достигает 50 – 60 % от количества, поступившего в организм беременной. Критический возраст для накопления радиоактивного йода в щитовидной железе плода - 5 – 7 месяцы беременности.
У новорождённых и детей первого года жизни на единицу поступившей активности поглощённые дозы в 25 раз выше, чем у взрослого человека, в связи с меньшей массой щитовидной железы. Особую опасность для новорожденных представляет ингаляционный путь поступления радиоактивного йода в связи с большей частотой дыхания. У кормящей женщины в течение 24 часов в молоко переходит 1/4 часть поступившего радионуклида йода, поэтому лактация является как одним из механизмов выведения радиоактивного йода из организма женщины, так и фактором дополнительной опасности для ребёнка (Morreale de Escobar G , 1990)
Таким образом, радиочувствительность щитовидной железы относительно невелика у взрослых людей, минимальна у пожилых и наиболее высока у детей младенческого возраста (от 0 до 3 лет) (Герасимов Г.А.. 2003).
Основными последствиями облучения щитовидной железы являются детерминированные эффекты (гипотиреоз и острый тиреоидит) и стохастические эффекты (рак щитовидной железы и доброкачественные узлы) (Kazakov V.S. et al.,1992). Проблема рака щитовидной железы остаётся актуальной и более чем через 20 лет после аварии, так как в период 20-25 лет после облучения возможен максимальный рост числа заболевших, после чего наступает спад.
По мнению специалистов, число заболевших раком щитовидной железы могло было быть уменьшено при проведении своевременной йодной профилактики - применения препаратов стабильного йода в достаточно больших дозах. Этот метод фармакологической защиты щитовидной железы заключается в торможении или временном прекращении её функции образования гормонов до начала поступления радиоактивного йода. Возникающая при этом блокада железы препятствует накоплению в ней радиоактивного йода и дальнейшего его участия в синтезе тиреоидных гормонов (Nauman J., Wolff J.,1993).
Цитологическое исследование вагинальных мазков самок – крыс
В 1983 г Бабичев В.Н. описал эффект стимуляции уровня ЛГ тироксином у тироидэктомированных самок крыс. В 1988 году были опубликованы данные о лечебном эффекте тиреоидина у эутиреоидных женщин, страдающих анавуляторным бесплодием (Алипов В.И., 1988).
Экспериментальные работы подтвердили наличие рецепторов к ТТГ и Т3 в яичниках, что определяло возможность прямого влияния дисфункции щитовидной железы на стероидогегез, овуляцию и функцию желтого тела (Oravec S., 2000). По мнению некоторых исследователей, возможности взаимовлияния гипофизарных гормонов – ТТГ, ФСГ и ЛГ вероятно обуславливает их структурное сходство: ТТГ, ФСГ, ЛГ и чХЧ (хориогонин) представляют собой сложные гликопротеины, состоящие из – и – субъединиц; Структура –субъединицы ТТГ, ФСГ , ЛГ и чХЧ идентична, а – субъединицы специфична для каждого гормона и определяет его лютеинизирующую, фолликулостимулирующую или тиреотропную функцию ( Yen S.S.,1999).
Еще более многочисленны работы о стимулирующем влиянии половых гормонов на щитовидную железу. Было выявлено, что при введении тестостерона ускоряетcя поглощение 131I щитовидной железой, причем это ускорение наблюдалось только при введении небольших доз препарата (1 – 10 мг/кг). При повышении дозы до 25 мг/кг интенсивность поглощения йода снижалась. Кастрация крыс-самцов снижала уровень ТТГ в крови и его реакцию ни тиреолиберин; заместительная терапия тестостероном восстанавливало эти показатели, введение эстрадиола было неэффективным. Был сделан вывод о том, что основной половой стероид, влияющий на реактивность ТТГ – тестостерон (Christianson D., 1981).
Однако имеются и данные о возможной стимуляции эстрогенами функции щитовидной железы за счет интенсификации синтеза тироксинсвязывающего глобулина в печени (Redmond G.P., 2004). Наиболее активно велись исследования по влиянии кастрации и заместительной терапии на активность щитовидной железы самок (Fortier C.,1970) и самцов (van Rees G.R.,1968). По мнению многочисленных авторов кастрация значительно снижает скорость секреции тироксина, а заместительная терапия стероидными гормонами нормализует этот показатель. Однако имеются исследования, авторы которых не обнаружили влияния овариэктомии на функцию щитовидной железы у людей (Дерябина Е.Г., 2008).
Несмотря на противоречия, большинство авторов считают, что кастрация снижает функциональную активность щитовидной железы: основная гипотеза (Алешин Б.В., 1965) заключается в том, что кастрация, по крайней мере у самок, устраняет постоянные стимулы (эстрогены), которые требуют повышения секреции ТТГ. Снижение гипофизарной активности после кастрации свидетельствует, по мнению автора, не о торможении, а об отсутствии стимуляторов.
Однако механизмы взаимодействия гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно- гонадной системы выяснены недостаточно как в эксперименте, так и в клинической практике. Так, не объясняется, почему теоретически обоснованные эффекты нарушения функции гипофизарно-гонадной системы не наблюдаются во всех случаях гипо- или гипертиреоза. Например, гипотиреоидная гиперпролактинемия (повышение уровня пролактина в крови больных гипотиреозом, связанная со способностью тиреотропин-релизинг гормона стимулировать гипофизарную секрецию не только ТТГ, но и пролактина) наблюдается только у 4-5% женщин с гипотиреозом (Айламазян Э.К.. 2006).
Таким образом, механизмы взаимодействия гипофизарно- тиреоидной и гипофизарно – гонадной системы, и в частности, влияние йодида калия на функциональную активность гипофизарно – гонадной системы, несмотря на длительные исследования, изучены недостаточно. Остается открытым вопрос, опосредованно ли (через изменение функциональной активности щитовидной железы) или напрямую влияют йодиды и тиреоидные гормоны на функциональную активность гипофизарно- гонадной системы.
Натрий – йодный симпортер щитовидной железы и влияние йодида калия на его функцию.
Натрий – йодный симпортер (НИС) – гликопротеин плазматической (базолатеральной, контактирующей с кровью) мембраны, осуществляющий активный транспорт йода в клетку.
В настоящее время общепризнано, что при воздействии йодида калия происходит снижение уровня НИС в тканях щитовидной железы, что обуславливает уменьшение уровня интратиреоидального йода. Этот механизм, по мнению Spitzweg C, (2002) и Eng P.H.K.(1999) позволяет возобновить органификацию йода при феномене « ускользания» щитовидной железы при эффекте Вольфа – Чайкова .
Причем этот эффект выражен и на уровне транскрипции, так как снижается и месседжер рибонуклеиновой кислоты НИС (мРНК НИС)(. Eng PHK, 1999).
Однако в последнее время появились работы, опровергающие это мнение. Так, Leoni S, 2011, отмечает, что уменьшение поглощения йода щитовидной железой начинается гораздо раньше, чем снижение мРНК НИС (Leoni S.G., 2011)
Повышение НИС в щитовидной железе, причем и на уровне мРНК наблюдается при гипертиреозе (болезни Грейвса) (Saito T, 1997) и в автономно функционирующих узлах щитовидной железы (Joba W, 1999).
Dohan О. и соавт.(2001) показал увеличение уровня экспрессии НИС в малигнизированной ткани щитовидной железы. Кроме того, НИС был локализован не только в плазматической мембране, но и в значительной степени во внутриклеточных структурах. Эти данные позволяют предположить, что злокачественная трансформация клеток щитовидной железы связана либо с миграцией НИС в плазму, либо с нарушением функции НИС в мембране, так как накопление йодида при малигнизации уменьшается, несмотря на повышение уровня экспрессии НИС ( Dohan O, 2001).
Натрий – йодный симпортер в экстратиреоидных тканях НИС также является посредником активного транспорта йода и в других тканях, в том числе слюнных железах (Jhiang SM, 1998), слизистой оболочки желудка, молочной железы (. Spitzweg C, 1998))., почках ( Spitzweg C, 2001), коже (Slominski A., 2002). Методом иммуногистохимии наличие НИС выявлено в надпочечниках, поджелудочной железе, передней доле гипофиза, в головном и спинном мозге (Mitsuma T., 1997).
Исследование терморегуляции у самок крыс при однократном введении йодида калия в дозировке 4 мкг /100 г массы животного
Постановка проблемы, цель и задачи исследований, разработка программы исследований и её методологии, экспериментальные работы, анализ и обобщение полученных результатов выполнены автором лично, в качестве соискателя Центра оперативной оценки состояния человека (руководитель центра, зав. кафедрой технологии спорта и системного анализа, профессор докт. биол. наук Исаев А.П.). Отдельные разделы диссертации выполнены в сотрудничестве (доля участия автора не менее 75%) с сотрудниками кафедры фармакологии (зав. кафедрой проф. докт. биол. наук Самородова И.М.), кафедры анатомии и гистологии (зав. кафедрой проф. докт. вет. наук Стрижиков В.К.) ФГБОУ ВПО «Уральская академия ветеринарной медицины МСХР РФ», лаборатории электронной микроскопии Южно-Уральского государственного университета (заведующий кафедрой – профессор докт. техн. наук Михайлов Г.Г.), научно исследовательского центра «Нанотехнологии» Южно-Уральского государственного университета (заведующий докт. хим. наук Авдин В.В.), иммунологической лаборатории НУЗ «Дорожная клиническая больница ОАО «РЖД» на ст. Челябинск» (заведующая отделением Малахова Е.Г.), областном патологоанатомическом бюро МЗ Челябинской области (начальник – канд. мед. наук Г.В. Сычугов).
В период с 2008 по 2012 было выполнено 4 серии опытов. I-я серия опытов состояла в разработке метода дегидратации образцов биологических тканей, позволяющего достигнуть постоянной массы образца при минимальной потере йода (комбинация вакуумного и термального подсушивания образцов). Использовались образцы человеческой щитовидной железы. Применялся метод рентгенфлюоресцентного анализа (в низком вакууме).
2-я серия экспериментов состояла в определении содержания йода и селена в эндокринных органах крыс (щитовидных железах, гипофизах, яичниках, семенниках, надпочечниках, гипоталамусах, поджелудочных железах). Применялся метод рентгеноспектрального микроанализа (в глубоком вакууме – «метод точек»).
3-я серия опытов состояла в определении содержания йода в тканях человека - в щитовидных железах, гипофизе и яичниках у женщин. Применялся метод рентгеноспектрального микроанализа в глубоком вакууме (метод точек).
4-я серия опытов проводилась в 3 этапа:
I-й этап – экспериментальное исследование воздействия однократного применения йодида калия в дозировке, соответствующей содержанию йода в щитовидной железе – 4 мкг/100 гр веса животного
II-й этап – экспериментальное исследование воздействия однократного применения йодида калия в различных дозировках (от 1 мкг до 25 мкг/100 гр веса животного) на гипофизарно – тиреоидную и гипофизарно – гонадную системы самок – крыс
III-й этап – экспериментальное исследование воздействия йод -индуцированной блокады щитовидной железы (8 мкг/100 гр веса животного в течение 5 дней) на гипофизарно – тиреоидную и гипофизарно – гонадную системы самок - крыс
В 2008 при разработке пробоподготовки биосубстратов, было использовано 6 человеческих щитовидных желез (3 мужчины и 3 женщины, средний возраст 57,6 лет). В 2011 году было проведено исследование тканей человека - щитовидных желез, гипофизов и яичников у 2–х женщин (средний возраст женщин составил 42,5 года). Фатальный исход во всех случаях не был связан с патологией щитовидной железы, гипофиза или яичников. Забор тканей производился при ранних патологоанатомических вскрытиях, выполненных в Челябинском областном патологоанатомическом бюро (начальник – канд. мед. наук Г.В. Сычугов) и патологоанатомическом отделении Дорожной клинической больницы на ст. Челябинск (заведующая отделением – Чубатова Н.А.). Все исследования проводились в строгом соответствии и с соблюдением биоэтических норм.
В период с 2008 по 2012 год в условиях вивариев ФГБОУ ВПО «Уральская академия ветеринарной медицины Минсельхоза России» (г. Троицк) и МУБК «Зоопарк» г.Челябинска – согласно договору о научно – практическом сотрудничестве с ФГБОУ ВПО «Уральская академия ветеринарной медицины МСХР РФ» (г. Троицк) (от 18,04.2007) было проведено 3 серии опытов на 311 беспородных крысах (308 самки 6-месячного возраста массой 250 + 30г и 3 самца 6-месячного возраста массой 320 + 40г). Животные содержались в виварии со стандартным световым режимом (12 ч света: 12 ч темноты (дневная фаза – с 7:00 до 19:00 летнего времени)) и температурой (24±1oC); получали стандартный корм и воду. Эксперимент проводился в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 года № 775) и Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.-European Community Directive 86/609/EC). Самки были взяты в опыт в фазы диэструса и метаэструса. Анализ цикличности функционирования гонад проводился на основании исследовании вагинальных мазков.
Определение гормонов гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно - гонадной систем в сыворотке крови самок – крыс при однократном введении йодида калия в различных дозировках
Количественный рентгеноспектральный микроанализ (РМА) образцов тканей с помощью спектрометра волновой дисперсии (electron probe microanalysis (EPMA) Wavelength dispersive spectrometry (WDs) quantitative analysis) был проведен в лаборатории электронной микроскопии ЮжноУральского государственного университета (заведующий кафедрой – профессор, докт. техн. наук Михайлов Г.Г.). Взвешивание образцов проводилось в научно-исследовательском центре «Нанотехнологии» ЮжноУральского государственного университета (заведующий докт. хим. наук Авдин В.В.).
Так как перед PMA на исследуемый образец проводится напыление платины в вакууме (3Pa), то во избежание двойного вакуумного подсушивания, было решено поменять этапность пробоподготовки: образцы сначала подвергались термальному подсушиванию, а затем – вакуумному.
Для определения нормативов содержания йода и селена в эндокринных органах крыс с помощью PMA (ВДС – метод точек) использовались 6 интактных беспородных крыс (3 самки и 3 самца) весом 250-300 грам. Самки были взяты в эксперимент в стадиях диэструса и метаэструса. Животные были подвержены эвтаназии под эфирным наркозом в период с 11 ч до 13 ч дневной фазы экспериментальных суток. Фрагменты 2 щитовидных желез, 2 гипофизов, 2 яичников, 3 семенников, 2 поджелудочных желез и 2 гипоталамусов были высушены при 100оС в течение 45 минут. Затем образцы были высушены при вакууме 3 Pa. На каждом этапе проводилось взвешивание образцов. Соотношение сухого и влажного веса определялось для каждого образца. Йод был определен в каждом образце (2 образца от различных органов), селен – в 2 щитовидных железах и 2 гипоталамусах, и в одном образце из остальных органов. Каждый образец был исследован в среднем 5.8 раз (для I) и 5.6 раз (для Se) (Рисунок 10).
Анализируемые точки, в которых определялся йод или селен, были определены как йод или селен положительные точки (ЙПТ или СеПТ). Так же было определено процентное соотношение йод - позитивных точек ко всем анализируемым по йоду точкам (%ЙПТ). Аналогично определялись %СеПТ.
Потери веса образцов органов крыс при различных этапах пробоподготовки приведены в таблице 4. Постоянная масса фрагментов органов весом в несколько микрограмм была достигнута уже при высушивании при 100оС в течение 45 минут. Вакуумное подсушивание не оказало влияние на соотношение сухого и влажного веса образцов. Все цитируемые в дальнейшем уровни микроэлементов относились к сухому весу образцов (с.в.). 137 точек были изучены рандомизировано (79 – I, и 58 – Se). Результаты PMA (анализ точек) для йода и селена в эндокринных органах крыс продемонстрированы в таблице 5. Было установлено, что в большинстве эндокринных органов крыс уровень йода в позитивных точках одинаков (исключая щитовидную железу и семенники) и может быть определен как «базисный уровень». Уровень селена в позитивных точках был одинаков во всех эндокринных органах.
Следует отметить, что в различных эндокринных органах изменялся и процент йод-позитивных точек (от 100% в щитовидной железе до 37% в поджелудочной железе). Процент селен-позитивных точек так же варьировал в разных органах (от 80% в поджелудочной железе до 50% в яичниках).
Таким образом, при исследовании содержания йода в различных эндокринных органах методом PMA (анализ точек) было выявлено, что в зависимости от вида органа изменялся как уровень йода в йод-позитивных точках, так и процент йод-позитивных точек. При аналогичном исследовании селена было установлено, что в различных органах изменялся только процент селен-позитивных точек. Интересно, что в органах с минимальным процентом йод-позитивных точек наблюдался максимальный процент селен-позитивных точек (семенники, поджелудочная железа).
Таким образом, в результате исследования был установлен «базисный уровень» йода в ЙПТ для большинства эндокринных экстратиреоидных органов. При проведении следующих этапов эксперимента этот показатель явился основанием для выбора доз йодида калия (по аналогии с экспериментами Wolff J, Chaikoff IL (1948), использовавшими дозировку йодида калия, 5 – кратно превышающую уровень йода в щитовидной железе крыс.
