Введение к работе
Актуальность исследования. В связи с аварией на атомной станции в г. Фукусима (Япония) в 2011 году вновь возник интерес к изучению физиологических механизмов влияния на человека и животных основного средства блокировки щитовидной железы (БЩЖ) при угрозе радиационного заражения - калия йодида (КИ) (Hanscheid Н, 2011). Основную опасность для биологических организмов при авариях на атомных электростанциях или после ядерных взрывов представляют радиоизотопы (в основном 1311). Даже минимальное количество радиоактивного йода при попадании в щитовидную железу может обеспечить дозу облучения, приводящую к малигнизации органа (Meek RA, 1985).
Эффективность КЙ в качестве средства профилактики поражения щитовидной железы обусловлена эффектом Вольфа-Чайкова - физиологическим торможением функции щитовидной железы при воздействии высоких концентраций йодидов. По общепринятой версии, КЙ насыщает тиреоциты стабильным нерадиоактивным йодом, и радиоактивные изотопы не поглощаются щитовидной железой.Шаует М, 2006).
Исследования прошлых лет не выявили серьезных побочных эффектов КЙ. По заключениям многочисленных комитетов и организаций, исследующих данный вопрос, основное осложнение при назначении КЙ - гипертиреоз (йод - Базедов), который наблюдается у людей с гиперчувствительностью к йоду (International basic safety standards for protection against ionizing radiation and for the safety of radiation sources., 1996).
Но при появлении клинических и экспериментальных данных о роли избытка йода в возникновении и прогрессировании рака щитовидной железы (Kanno J, 1992), применение БЩЖ было ограничено (Recommendation of the German Commission on Radiological Protection (Use of Iodine Tablets for Thyroid Blocking in the Event of a Nuclear Accident), 2011).
He теряет актуальности и изучение возможных побочных эффектов БЩЖ в экстратиреоидных органах. По заключению FDA (2001) (Управление по контролю за продуктами и лекарствами (США)) использование КЙ в Польше после аварии на Чернобыльской АЭС дало полезную информацию о его безопасности (Nauman J, 1993). Однако по мнению некоторых экспертов, возможные побочные эффекты КЙ до сих пор систематически не исследованы (L. Spallek, 2011), а оценка неблагоприятных последствий БЩЖ опирается на косвенные данные из смежных областей (Bacher К, 2002, Meek RA, 1985 ).
Например, общепризнано, что гипотиреоз связан с нарушениями менструального цикла (Рорре К. 2007). Однако результаты исследования влияния антитиреоидных препаратов на репродуктивную функцию разноречивы - имеются данные как о наличии негативного воздействия (Hapon MB.2010), так и о безопасности антитиреоидной терапии (Armada-Dias L. 2001). Аналогичные вопросы вызывает и влияние йод-индуцированной БЩЖ (ЙИ БЩЖ) на^епродуктивную функцию.
Все вышеизложенные проблемы применения КИ тесно связаны с нерешенными до сих пор вопросами физиологических механизмов влияния ЙИ БЩЖ.
Wolff J. в 1969 году, в обзорной статье, посвященной двадцатилетию исследований эффекта Вольфа-Чайкова, отмечал, что достоверность гипотезам о
физиологических механизмах влияния йода на щитовидную железу может дать только непосредственное определение йода в щитовидной железе. При йод -индуцированной БЩЖ активно исследовались изменения содержания йода в щитовидной железе (Hanscheid Н, 2011), однако эти данные опирались, в основном, на косвенные показатели — исследования проводились чаще всего с помощью радиоизотопных методов, с ориентировкой на скорость накопления элемента. Трудности при аналитическом определении йода были связаны с его малой концентрацией в биологических объектах.
В связи с тем, что йод не органифицируется в экстратиреоидных органах, не уделялось особого внимания изменениям содержания йода в экстратиреоидных органах при БЩЖ. Хотя в литературе имелись сведения о накоплении йода в гипофизе и половых железах при йодной нагрузке (Trunnell J.B., 1950 ).
Взаимосвязь йода и селена определяется ролью селена в синтезе, метаболизме и активации тиреоидных гормонов - как компонента дейодиназ и глутатионпероксидаз (Ko.hrle J.,2005). Однако сложности в определении содержания селена, как и йода, обусловлены их малыми концентрациями в биологических тканях.
Количественный рентгеноспектральный микроанализ (РМА) является одним из наиболее чувствительных современных методов микроанализа, однако требует дегидратации образцов. Традиционно для дегидратации использовалась длительное термальное подсушивание, несмотря на возможные потери йода при пробоподготовке (20-60%) (Покровский А.А., 1981). Оптимизация пробоподготовки биологических препаратов для РМА могла бы позволить применить этот метод для исследования содержания йода и селена как в щитовидной железе, так и в экстратиреоидных органах.
Сопоставление функциональных изменений эндокринных органов при ЙИ БЩЖ с количественным микроанализом внутриорганного содержания йода и селена возможно, позволило бы уточнить некоторые физиологические механизмы влияния йодидов. .
В литературе' имеются данные о том, что йодиды стимулируют процессы апоптоза в щитовидной железе (Lenvann Р., 2006). Однако физиологические механизмы действия йодидов на апоптоз в щитовидной железе остаются дискутабельными. Разнятся данные и по путям йодиндуцированного апоптоза (Mutaku J F, 2002).
Особую актуальность этому аспекту физиологического механизма действия йодидов дали исследования, посвященные влиянию йода на апоптоз в экстратиреоидных малигнизированных тканях, например, в тканях молочной железы (Shrivastava, А., 2006.) и легких (Zhang L., 2003). Однако внимание исследователей было посвящено исследованию культур раковых клеток. Данные о воздействии йодидов на апоптоз в физиологических тканях, особенно экстратиреоидной локализации и in vivo, очень скудны.
Указанные предпосылки послужили основанием для целенаправленного исследования физиологических механизмов влияния ЙИ БЩЖ на функциональные параметры гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-гонадной систем с изучением внутриорганных йода, селена и маркеров апоптоза.
Целью исследования явилось изучение в эксперименте функционального состояния гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-гонадной систем при влиянии йод-индуцированной БЩЖ с определением интраорганного содержания йода, селена и маркеров апоптоза.
Задачи исследования:
1. Разработать методику пробоподготовки биологических тканей, позволяющую
применить для исследования микроэлементов рентгенспектральный микроанализ.
-
Определить с помощью РМА содержание йода и селена в эндокринных органах у крыс (щитовидная железа, гипофиз, яичники, семенники, гипоталамус, поджелудочная железа).
-
Определить с помощью РМА содержание йода в щитовидной железе, гипофизе и яичниках у женщин и сравнить их с показателями у самок — крыс.
-
Выявить особенности функционального состояния гипофизарно-тиреоидной (ТТГ, Тз и Т4 в крови) и гипофизарно-репродуктивной систем (ФСГ, ЛГ, эстрадиол, прогестерон в крови) и экспрессию тканевого натрий - йодного симпортера (НИС) в щитовидной железе, гипофизе и яичниках самок - крыс при влиянии однократного применения КЙ в дозировке 4 мкг/100 г веса животного.
-
Исследовать возможность воздействия КЙ в дозировке 4 мкг/100 г веса животного на проапоптические факторы (каспаза 3, 8 и Всі) в щитовидной железе, гипофизе и яичниках у самок — крыс.
-
Изучить особенности влияния однократного применения КЙ при различных дозировках (1, 4, 8 и 25 мкг/100 г веса животного) на изучаемые функциональные параметры гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-репродуктивной систем самок - крыс (с исследованием экспрессии ТТГ, ФСГ и ЛГ в гипофизе), уровни экспрессии каспаз и НИС в щитовидной железе, гипофизе и яичниках.
-
Определить с помощью РМА уровень интраорганного йода в щитовидной железе, гипофизе и яичниках; выяснить значимость дозозависимости для физиологических механизмов действия однократных доз КЙ .
-
Изучить динамические особенности влияния ЙИ БЩЖ при дозе КЙ 8 мкг/100 г веса животного на функциональные параметры гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-репродуктивной систем самок-крыс (с исследованием изменений экспрессии ТТГ в гипофизе), уровни экспрессии каспазы 3 и НИС в щитовидной железе, гипофизе и яичниках.
-
Определить с помощью РМА уровень интраорганного йода и селена (щитовидная железа, гипофиз); выяснить роль интраорганного йода и селена в физиологических механизмах ЙИ БЩЖ.
Научная новизна исследования.
Впервые проведено с помощью РМА определение уровня йода и селена в щитовидной железе и большинстве эндокринных органов крыс; в щитовидной железе, гипофизах и яичниках женщин. Сформулировано понятие «базисного уровня» йода - уровня йода в йод-позитивных точках (ЙПТ) большинства экстратиреоидных эндокринных органов крыс. Выявлено, что видовое различие в содержании йода характерно не только для щитовидных желез, но и для гипофизов и яичников.
Впервые проведена дифференциация влияния «малых фармакологических доз» йодидов в зависимости от соотношения их с «базисным уровнем» йода в щитовидной железе: при дозе, соответствующей «базисному уровню» щитовидная железа накапливает йод, при превышении - теряет.
Впервые выявлено, что в физиологических механизмах влияния КЙ активно участвует гипофиз: выявлено, что при дозах КЙ, превышающих уровень йода в щитовидной железе, происходит накопление йода в ЙПТ гипофиза. Этот процесс сопровождается изменением функциональной активности гипофиза как в отношении тиреоидной, так и гонадной систем: снижается уровень ТТГ (как в крови, так и экспрессии в гипофизе) и повышается уровень ФСГ и ЛГ (как в крови, так и экспрессии в гипофизе).
Впервые выявлено, что гипофиз играет значимую роль в физиологических механизмах воздействия ИИ БЩЖ: на фоне нормальных показателей тиреоидных гормонов происходит рост уровня йода в ЙПТ гипофиза, экспрессии НИС, экспрессии каспазы 3 и снижение экспрессии ТТГ. Эти изменения наблюдаются на день раньше уменьшения уровня йода, роста экспрессии НИС и экспрессии каспаз в щитовидной железе.
Впервые установлено, что «критический уровень снижения йода» в щитовидной железе, при достижении которого начинается ребаунд-эффект, соответствует «базисному уровню йода». Скачкообразный рост экспрессии ТТГ в гипофизе за день до ребаунд-эффекта синхронен с падением йода в щитовидной железе до «базисного уровня».
Впервые выявлена взаимосвязь уровня интраорганного йода и экспрессии каспаз, установлена органозависимость направления этой взаимосвязи - в щитовидной железе - обратная, в гипофизе — прямая. Впервые выявлена обратная взаимосвязь уровней селена и экспрессии каспаз в гипофизе.
Впервые выявлено, что ЙИ БЩЖ оказывает тормозящее влияние на гипофизарно-гонадную системы самок-крыс с участием активации каспазозависимого апоптоза в яичниках.
Впервые разработана методика пробоподготовки биологических субстратов для РМА (комбинация вакуумной и термальной сушки) позволяющая минимизировать потерю микроэлементов в исследуемых тканях (патент № 2366952,2009).
Теоретическая и практическая значимость
В теоретическом аспекте нами была подтверждена гипотеза, что при БЩЖ интратиреоидальный йод снижается до критического уровня. Было установлено, что «критический уровень снижения интратиреоидального йода» соответствует «базисному уровню» йода в ЙПТ экстратиреоидных эндокринных органов самок-крыс.
По результатам исследования была выдвинута гипотеза о дозозависимости влияния малых фармакологических доз йодидов: накопление щитовидной железой йода происходит при дозировках, не превышающих «базисный уровень». При увеличении дозировок щитовидная железа йод не накапливает, однако йод аккумулируется в ЙПТ гипофиза: этот процесс сопровождается активацией местного каспазозависимого апоптоза и снижением функциональной активности гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-гонадной системам самок-крыс.
Были выявлены изменения содержания селена в гипофизе при ЙИ БЩЖ: было установлено, что снижению уровня селена в селен-позитивных точках (СеПТ) гипофиза за пределы чувствительности РМА соответствуют максимальные подъемы экспрессии гипофизарных каспаз самок-крыс.
Было установлено, что у женщин по сравнению с самками-крысами уровень йода выше как в щитовидной железе, так и в яичниках и гипофизах, видозависимо и соотношение уровней йода в вышеназванных органах. Полученные результаты необходимо учитывать при экстраполяции «крыса — человек» в исследованиях, посвященных воздействию йода на гипофизаро-тиреоидную и гипофизарно-гонадную системы.
В практическом аспекте полученные знания физиологических механизмов ЙИ БЩЖ обосновывают новые возможности оптимизации доз КЙ, применяемых при угрозе радиационного заражения и оценки возможных осложнений со стороны репродуктивной системы при проведении вышеназванных мер профилактики. Результаты исследований включены в национальный проект в сфере научной деятельности (РФФИ №1207-004430а) ИГК №2014-252. Работа выполнена при подцержке Министерства образования и науки РФ в рамках базовой части государственного задания (код проекта-1696).
Предложенный нами метод пробоподготовки биосубстратов для РМА дает новые возможности исследования микроэлементов с минимальными потерями в процессе аналитических процедур и повышения точности определения микроэлементов.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Уровень йода в йод-позитивных точках (РМА) большинства
экстратиреоидных эндокринных органов одинаков («базисный уровень») и
видоспецифичен. При блокаде щитовидной железы «критический уровень
снижения йода» соответствует «базисному уровню»
2. Механизмы воздействия йодида калия на щитовидную железу, гипофиз и
яичники органоспецифичны и дозозависимы.
При воздействии доз йодидов, аналогичных «базисному уровню», щитовидная железа накапливает йод, при увеличении дозы - теряет.
Гипофиз при повышении дозы свыше «базисного уровня» аккумулирует йод в ЙПТ. В яичниках накопления йода не выявлено.
-
Процесс аккумуляции йода в ЙПТ гипофиза сопровождается снижением функциональной активности как гипофизарно-тиреоидной, так и гипофизарно-гонадной систем.
-
Уровень интраорганного йода взаимосвязан с каспазо-зависимым апоптозом: в щитовидной железе эта зависимость обратная, в гипофизе — прямая. Максимальный рост каспаз в гипофизе сопровождается снижением уровня селена в СеПТ гипофиза.
Личный вклад соискателя
Постановка проблемы, цель и задачи исследований, разработка программы исследований и её методологии, экспериментальные работы, анализ и обобщение полученных результатов выполнены автором лично, в качестве соискателя Центра оперативной оценки состояния человека (руководитель центра, зав. кафедрой
технологии спорта и системного анализа, профессор докт. биол. наук Исаев А.П.). Отдельные разделы диссертации выполнены в сотрудничестве (доля участия автора не менее 75%) с сотрудниками кафедры фармакологии (зав. кафедрой проф. докт. биол. наук Самородова И.М.), кафедры анатомии и гистологии (зав. кафедрой проф. докт, вет. наук Стрижиков В.К.) ФГБОУ ВПО «Уральская академия ветеринарной медицины МСХР РФ», лаборатории электронной микроскопии Южно-Уральского государственного университета (заведующий кафедрой -профессор докт. техн. наук Михайлов Г.Г.), научно-исследовательского центра «Нанотехнологии» Южно-Уральского государственного университета (заведующий докт. хим. наук Авдин В.В.), иммунологической лаборатории НУЗ «Дорожная клиническая больница ОАО «РЖД» на ст. Челябинск» (заведующая отделением Малахова Е.Г.), областном патологоанатомическом бюро МЗ Челябинской области (начальник — канд. мед. наук Г.В. Сычугов).
Внедрение результатов исследования
Методика пробоподготовки биологических субстратов для РМА (комбинация вакуумной и термальной сушки) позволяющая минимизировать потерю микроэлементов в исследуемых тканях внедрена в работу научно-исследовательского центра «Нанотехнологии» Южно-Уральского государственного университета (заведующий докт. хим. наук Авдин В.В.) и лаборатории электронной микроскопии Южно-Уральского государственного университета (заведующий кафедрой -профессор, докт. техн. наук Михайлов Г.Г.). Положительные результаты внедрения методов, соответственно, 63,1% и 95,0%.
Результаты диссертации используются в научной и педагогической практике: лекционном курсе и на практических занятиях кафедры анатомии и гистологии, кафедры физиологии и фармакологии животных и человека, кафедры акушерства, кафедры терапии и кафедры хирургии Уральской академии ветеринарной медицины МСХР РФ (Троицк).
Апробация работы
Основные положения диссертации представлены на:
XXII Российской конференции по электронной микроскопии, г.Черноголовка, 2-3 июня 2008 г.
Юбилейной научно-практической конференции к 50-летию факультета ветеринарной медицины АГАУ, 100-летию со дня рождения И.С. Ржанициной, г.Барнаул, 11 октября 2012.
Международной научно-практической интернет-конференции, посвященной 65-летию кафедры паразитологии Ставропольского ГАУ «Современные тенденции в ветеринарной медицине», Ставрополь, 21 ноября 2012 г.
5 интернациональном конгрессе федерации европейского общества микроэлементологов «Fifth International Congress of FESTEM», Авиньон, Франция, 22-24 мая 2013 г.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 22 печатные работы: их них - 4 в зарубежных рецензируемых :журналах («Endocrine Regulation»,V.44, 2010; «Endocrine Regulation», V. 45(1), 2011; «Endocrine Regulation», V. 45(3), 2011; «Biological Ttrace Element Research», V. 154(2), 2013); 11 статей в ведущих
рецензируемых журналах, определенных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций. Получено 2 патента Российской Федерации на метод исследования и способ лечения.
Структура и объем диссертации состоит из введения, 8 глав, заключения, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 260 страницах, содержат 13 таблиц, иллюстрированы 45 рисунками. Библиография включает 271 источников, из них 232 зарубежных.
