Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Современные представления о циркадианной системе млекопитающих 11
1.2. Современные представления о механизме обеспечения репродуктивнойцик личности женского организма 16
1.3. Роль мелатонина в регуляции репродуктивной функции 32
1.4. Влияние пептидов эпифиза на репродуктивную функцию 36
1.5. Влияние нейротропных ксенобиотиков на репродуктивную функцию 37
1.6. Биохимическая характеристика аминоксидаз 40
1.7. Возможная связь глутатионпероксидаз с действием аминоксидаз и механизмами регуляции репродукции 48
1.8. Биохимическая характеристика глутатионпероксидаз 49
1.9. Методы определения моноаминоксидазной и глутатионпероксидазной 59 активностей
ГЛАВА 2. Материалы и методы. 68
2.1. Оптимизация способов определения активности ферментов для работы с микроструктурами головного мозга крыс 68
2.2. Изучение распределения активности моноаминоксидазы среди анатомических структур 74
2.3. Изучение суточной динамики активности моноаминоксидазы в медиальной преоптической области, срединном возвышении и обонятельных бугорках 76
2.4. Изучение возрастной динамики активности моноаминоксидазы в анатомических структурах 76
2.5. Изучение влияния мелатонина, эпиталамина, эпиталона и 1,2-диметилгидразина на активность моноаминоксидазы во фронтальной части медиальной преоптической области 78
2.6. Исследование отношений между активностями моноаминоксидазы и глутатионпероксидазы 79
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 80
3. 1. Характеристики разработанных методов определения активности ферментов 80
3.2. Распределение активности моноаминоксидазы среди структур мозга 94
3.3. Исследование суточной динамики моноаминоксидазной активности в медиальной преоптической области, срединном возвышении и обонятельных бугорках 99
3.4. Изучение возрастной динамики активности моноаминоксидазы в анатомических структурах 104
3.5. Влияние 1,2-диметилгидразина, мелатонина, эпитал амина и эпиталона на общую моноаминоксидазную активность в медиальной преоптической области 114
3.6. Исследования связи моноаминоксидазной и глутатионпероксидазной активностей , 120
ГЛАВА 4. Заключение 126
Выводы 128
Литература 129
- Современные представления о циркадианной системе млекопитающих
- Современные представления о механизме обеспечения репродуктивнойцик личности женского организма
- Изучение распределения активности моноаминоксидазы среди анатомических структур
- Характеристики разработанных методов определения активности ферментов
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.
Проблема регуляции репродуктивной функции женского организма является одной из сложнейших в функциональной биохимии. Особого внимания заслуживает функционирование сложно организованной гипоталамической системы, обеспечивающей синтез и секрецию ключевого регулятора половой цикличности - гонадолиберина (LHRH), рилизинг-гормона, стимулирующего выработку гонадотропинов гипофиза.
Установлено, что максимальный уровень LHRH в крови самок млекопитающих приурочен к определенному времени репродуктивного цикла, а именно, к периоду, предшествующему овуляции. У самок крыс пик секреции LHRH происходит в вечернее время на стадии проэструса. Одним из условий формирования данного пика является повышение в крови содержания половых стероидов. Другое условие, связанное с первым - ежедневно поступающий сигнал от внутреннего таймера, локализованного в супрахиазматических ядрах (SCN) гипоталамуса; при этом функция SCN также модулируется стероидами (Kennaway, 2005).
Перикарионы специализированных гонадолиберинергических нейронов в головном мозгу крыс локализованы преимущественно в медиальной преоптической области (МПО); большая часть терминалей данных нейронов проецируется в срединное возвышение (СВ) гипоталамуса, откуда происходит секреция LHRH в кровь (Rivest, Rivier, 1995). Процессы синтеза и секреции LHRH находятся под контролем многочисленных нейромедиаторных систем, среди которых основная роль отводится пептидергическим и моноаминергическим системам (Бабичев, 1995). В упрощенном виде представления о вкладе моноаминергических систем сводятся к следующему: норадреналин и дофамин считаются позитивными регуляторами синтеза LHRH в медиальной преоптической области (в особенности это относится к норадреналину); что же касается секреции LHRH, то дофамин, в противоположность норадреналину, рассматривается как негативный регулятор. В отношении серотонина известно ингибирующее влияние на продукцию LHRH. Для различных моноаминов показано наличие изменений в их содержании и секреции в МПО и медиальном базальном гипоталамусе на стадии проэструса, приуроченных к вечернему времени, что связывают с осуществлением их регуляторной роли в отношении формирования пика LHRH (Thyagarajan et al., 1995; Mohankumar et al., 1995). Также неоднократно продемонстрирован факт снижения содержания биогенных аминов в гипоталамических структурах (включая СВ) при старении, что рассматривают как одну из причин развития возрастной дисфункции гипоталамического контроля работы репродуктивной системы (Simpkins et al., 1977, Сапо et al., 2001).
Один из основных путей деградации данных нейромедиаторов - путь
окислительного дезаминирования, катализируемого моноаминоксидазами (МАО). Ряд сведений указывает на вовлеченность МАО преоптической области самок крыс в формирование преовуляторного пика секреции LHRH (Alleva et al., 1966, Lima et al., 2007, Yamamoto et al., 1974). В частности, использование паргилина (ингибитора МАО) вызывает отмену преовуляторного пика лютеинизирующего гормона у крыс наряду с повышением содержания серотонина, норадреналина и дофамина в МПО. При этом истощение содержания серотонина путем микроинъекций 5,7-дигидрокситриптамина в МПО ведет к усилению секреции лютеинизирующего гормона у овариэктомированных крыс, обработанных эстрадиолом и прогестероном (Lima et al., 2007).
Однако, неизвестно, присутствуют ли изменения активности МАО в МПО и СВ в преовуляторный период, обуславливающие формирование обнаруженных ранее ритмов содержания моноаминов в данных областях. В связи с этим актуальной является задача исследования динамики активности МАО в МПО и СВ во второй половине дневной фазы экспериментальных суток на различных стадиях эстрального цикла.
К настоящему времени известно, что во многих областях головного мозга крыс, в частности, в целом гипоталамусе, при старении наблюдается повышение активности МАО (Bhaskaran, Radha, 1983, Meites, 1992). Поскольку в отдельных областях гипоталамуса при старении наблюдается снижение содержания моноаминов, регулирующих репродуктивную функцию, актуальной является задача изучения возрастной динамики активности МАО в МПО и СВ, которая до настоящего момента остается неизвестной. Данные о возрастных изменениях активности МАО в МПО и СВ будут способствовать пониманию роли данного фермента в возрастном становлении и угасании репродуктивной функции.
Актуальным является поиск ответа на вопрос о вовлеченности МАО в механизмы воздействия соединений, обладающих гонадотропным эффектом. Экспериментальные исследования показали, что при воздействии антигонадотропного соединения 1,2-диметилгидразина и гормона эпифиза мелатонина, обладающего прогонадотропным эффектом у половозрелых животных, наблюдаются изменения содержания моноаминов в гипоталамических структурах (Анисимов и др., 1976, Керкешко и др., 2001). Однако, неизвестно, как влияют данные соединения на активность МАО в данных областях. Также получены сведения о том, что пептидный препарат эпифиза эпиталамин способен восстанавливать циклическую активность яичников и фертильность у стареющих самок крыс (Анисимов, 2003, Khavinson, 2000). В то же время, неизвестно, что происходит с активностью МАО в гипоталамических структурах, ответственных за продукцию LHRH, при воздействии эпиталамина, а также его
7
структурно-функционального аналога эпиталона.
Начиная с 1980-х годов появились сведения о том, что функционирование МАО тесно связано с активностью глутатионпероксидаз (ГПО) — основных ферментов, метаболизирующих пероксид водорода в головном мозгу, являющийся одним из продуктов моноаминоксидазной реакции (Maker et al., 1981, Cohen et al., 1997). Можно предположить наличие корреляционной связи между активностями МАО и ГПО. Экспериментальная проверка данного предположения является актуальной, поскольку в случае наличия высоко достоверной корреляционной связи в исследуемых областях активность ГПО будет являться дополнительным показателем потенциально возможной скорости окислительного метаболизма моноаминов, ответственных за регуляцию продукции LHRH.
Однако, к настоящему времени, отсутствуют адекватные методы определения МАО и ГПО в микроструктурах головного мозга (в связи с чем понятно отсутствие сведений по изложенным вопросам в литературе).
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью представляемого исследования являлось изучение в экспериментах на самках крыс роли моноаминоксидаз в регуляции репродуктивной функции женского организма на уровне гипоталамических структур, участвующих в продукции гонадолиберина.
В соответствии с целью были поставлены задачи: 1 Оптимизировать условия определения активности моноаминоксидазы и глутатионпероксидазы для работы с микроанатомическими структурами головного мозга;
2)исследовать суточную динамику моноаминоксидазной активности в медиальной преоптической области и срединном возвышении гипоталамуса самок крыс в преовуляторный период;
3)исследовать возрастную динамику активности моноаминоксидазы в медиальной преоптической области и срединном возвышении гипоталамуса самок крыс; 4)изучить.влияние 1,2-диметилгидразина, мелатонина, эпиталамина* и эпиталона на активность моноаминоксидазы в ответственных за регуляцию репродукции областях гипоталамуса: самок крыс;
5)оценить связь между активностями глутатионпероксидазы и моноаминоксидазы в ткани головного мозга, в том числе в областях, отвечающих за продукцию гонадолиберина.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ. 1.Оптимизированные способы определения моноаминоксидазной и глутатионпероксидазной активностей позволяют корректно исследовать активности данных ферментов в микроструктурах головного мозга и могут быть использованы для оценки потенциально
8
возможной скорости окислительного метаболизма моноаминов.
2.Становление и угасание репродуктивной функции сопряжено с изменениями активности
моноаминоксидазы в микроструктурах гипоталамуса, ответственных за продукцию
гонадолиберина.
З.Соединения, обладающие гонадотропным эффектом, влияют на моноаминоксидазную
активность в медиальной преоптической области: соединение с антигонадотропными
свойствами (1,2-диметилгидразин) снижает активность фермента; вещества с
прогонадотропным эффектом повышают (мелатонин) или оказывают протекторный эффект
(эпиталамин) на активность моноаминоксидазы.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Представлен новый способ определения моноаминоксидазной активности, основанный на реакции окисления кинурамина с детекцией увеличения концентрации продукта реакции 4-гидроксихинолина при 327 нм. Данный метод позволяет определять активность моноаминоксидазы в микроанатомических структурах головного мозга, в том числе ответственных за регуляцию репродуктивной функции. Описан новый подход для определения селензависимой глутатионпероксидазной активности, сочетающий использование пероксида водорода и 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислоты), и применен для изучения глутатионпероксидазной активности ткани головного мозга, в том числе в микроанатомических образованиях.
Впервые описано распределение моноаминоксидазной активности в ткани головного мозга крыс с применением разработанного и представленного в настоящей диссертации метода определения активности МАО.
Описана неизвестная ранее возрастная динамика моноаминоксидазной активности в структурах, отвечающих за синтез и высвобождение гонадолиберина.
Впервые изучено воздействие обладающего нейротоксическими свойствами энтеротропного канцерогена 1,2-диметилгидразина на уровень активности моноаминоксидазы в преоптической области гипоталамуса самок крыс. При этом* обнаружен ингибирующий эффект однократной внутрибрюшинной инъекции данного соединения на активность фермента.
Впервые обнаружено, что внутрибрюшинное введение мелатонина приводит к сильно выраженному повышению активности моноаминоксидазы в ткани преоптической области гипоталамуса.
Обнаружен неизвестный ранее протекторный эффект инъекций эпиталамина на активность моноаминоксидазы в медиальной преоптической области у крыс, направленный против ингибирующего действия 1,2-диметилгидразина.
Впервые выявлена высокодостоверная обратная зависимость между активностями
9
малоизученной немитохондриальной моноаминоксидазы и селеновой
митохондриальной глутатионпероксидазы в ткани головного мозга. Выявлена отрицательная
корреляционная связь между активностями глутатионпероксидазы и моноаминоксидазы
срединного возвышения.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Представленные микрометоды определения моноаминоксидазной и глутатионпероксидазной активностей расширяют возможности дальнейшего исследования данных ферментов. Методы характеризуются простотой воспроизведения и использованием недорогих реактивов, пригодны для работы с микроанатомическими стуктурами головного мозга, с отдельными субклеточными фракциями и позволяют решать многие исследовательские задачи. Всего этого зачастую нельзя сказать о многих альтернативных методах. Предложенный способ определения активности глутатионпероксидазы характеризуется более высокой селективностью в отношении селеновых изоформ фермента, чем широко используемые методы с применением органических перекисей, что позволяет более корректно судить о селензависимой глутатионпероксидазной активности.
Проведеные исследования способствуют большей детализации представлений о
центральной регуляции репродуктивной функции женского организма и дают основание для
суждений о значимости моноаминоксидазного компонента в системе гипотапамического звена
регуляции данной функции. Полученные данные об эффекте воздействия ксенобиотика 1,2-
диметилгидразина могут быть учтены при оценке влияния антропогенных экологических
факторов, включающих наличие в окружающей среде соединений сходной химической
природы. Результаты изучения эффекта воздействия инъекций мелатонина указывают на
необходимость глубокого изучения влияния потребления данного соединения на
гипоталамические механизмы контроля функции репродукции. Обнаруженный в данном
исследовании эффект, выражающийся в существенном повышении активности
моноаминоксидазы в преоптической области должен быть учтен при разработке клинических
подходов применения^ гормона эпифиза. Выявленное протекторное действие эпиталамина на*
активность моноаминоксидазы подтверждает уже известный нормализующий эффект данного
препарата в отношении репродуктивной функции, что может указывать на адекватность
применения эпиталамина в клинической практике для коррекции нарушений в
гипоталамической регуляции работы репродуктивной системы. Обнаруженная
высокодостоверная зависимость между активностями немитохондриальной моноаминоксидазы и митохондриальной глутатионпероксидазы позволяет далее рассмотреть последнюю как дополнительный параметр, отражающий потенциально возможную скорость окислительной деградации моноаминов в ткани головного мозга.
10 СВЯЗЬ ИССЛЕДОВАНИЙ С ПЛАНОМ НАУЧНЫХ РАБОТ ИНСТИТУТА.
Диссертационное исследование проведено в соответствии с планом научно-исследовательских
работ Института акушерства и гинекологии им Д.О. Отта РАМН по теме: "Экспериментальное
моделирование комплексного воздействия неблагоприятных факторов внешней среды малой
интенсивности на репродуктивную систему".
СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
1.Разыграев А.В. Метод определения глутатионпероксидазной активности с использованием
пероксида водорода и 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) // Клинико-лабораторный
консилиум. —2004. — № 4. — С. 19-22.
2.Разыграев А.В., Арутюнян А.В. Спектрофотометрический метод определения
моноаминоксидазной активности в микроструктурах головного мозга крыс, основанный на
реакции окисления кинурамина // Вестник СПбТУ. — 2006. — Сер. 3, вып. 3. — С. 114-118.
Разыграев А.В., Арутюнян А.В. Активность моноаминоксидазы в структурах головного мозга крыс // Нейрохимия. — 2007. — Т. 24, № 3. — С. 206-210.
Razygraev A.V., Arutjunyan A.V. Monoamine oxidase activity in several structures of rat brain II Neurochemical Journal. — 2007. — V. 1, № 3. — P. 204-207.
Отдельные результаты были использованы для написания статьи:
5. Разыграев А.В., Арутюнян А.В. Определение глутатионпероксидазной активности в сыворотке
крови человека с использованием пероксида водорода и 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислоты)
// Клиническая лабораторная диагностика. — 2006. —№ 6. — С. 13-16.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов собственных исследований (в том числе обсуждение полученных результатов), заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы, иллюстрирована 32 рисунками. Библиографический указатель включает 200 наименований, в числе которых 39 отечественных и 161 иностранных источников.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертации- доложены и обсуждены на заседаниях лаборатории перинатальной биохимии ГУ НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН (2006, 2007 гг.). Результаты исследования внедрены в практику работы лаборатории. Апробация диссертации состоялась на научном заседании кафедры Физиологии человека и животных биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского Государственного Университета.
Современные представления о циркадианной системе млекопитающих
Млекопитающие, как и большинство организмов, будь то животные, растения, бактерии и грибы, имеют внутренний измеритель времени, благодаря чему наличие циркадианных ритмов различных биохимических и физологических показателей является одной из их основных характеристик. К настоящему времени известно, что во многих организмах ядро циркадианного ритмоводителя составляют процессы транскрипции определенных генов и трансляции, продукты которой регулируют собственную экспрессию. Осцилляции на уровне генов приводят к возникновнению ритмов на клеточном, тканевом и системном уровнях.
Следует отметить, что не всякие суточные изменения показателей являются в строгом смысле циркадианными, т. е. подчиненными работе циркадианного осциллятора. Некоторые ритмы могут быть навязаны циклическими изменениями условий окружающей среды без вовлечения внутреннего ритмоводителя.
Тем не менее, внешние условия определенным образом сказываются на работе циркадианного осциллятора: внутренний таймер способен перенастраиваться в зависимости от смещения фазы ритма освещенности, потребления пищи и т. п. Зависимая от внешних условий работа осциллятора позволяет организму прогнозировать изменения в среде и обеспечивать готовность к меняющимся условиям.
Вполне закономерен вопрос о локализации циркадианного ритмоводителя всего организма в конкретной анатомической структуре. Для большинства организмов световой режим является фактором, подчиняющим локомоторную активность и другие циклически меняющиеся параметры на уровне целого организма. Поэтому является вполне понятным тот факт, что у млекопитающих циркадианный осциллятор локализован в ткани нервной системы, в супрахиазматических ядрах (SCN) гипоталамуса, тесно связанных со зрительными путями. Однако, помимо нейронов SCN, клетки в составе многих других тканей млекопитающих также имеют выраженные молекулярные циклы транскрипции-трансляции тех же генов внутренних часов, характеризующиеся отличиями по отношению к ритмам в SCN. Полагают, что, например, в клетках печени определяющим фактором, настраивающим работу их внутренних часов, является скорее время приема пищи, нежели световой режим. Тем не менее, одна из наиболее системных, поведенческая цикличность, у млекопитающих находится в тесной зависимости от работы осциллятора в центральной нервной системе (т.е. от SCN). То же справедливо в отношении работы репродуктивной системы млекопитающих (Young, Kay, 2001, Okamura, 2003, Kennaway, 2005).
Нейроны SCN получают информацию об уровне освещенности от сетчатки глаза через ретиногипоталамический тракт, представленный коллатералями глутаматергических ганглиозных клеток сетчатки, которые на уровне зрительного перекреста отходят от зрительного тракта и направляются к SCN. Поскольку эндогенные ритмы в SCN протекают с периодом, отличающимся от 24 ч, происходит ежедневная подстройка внутреннего таймера в соответствии с внешним фотоциклом (Reuss, 1996).
Суть молекулярной организации циркадианного осциллятора млекопитающих сводится к следующему. Существуют два гена (главных осциллятора) - mPerl и mPer2. Транскрипционными факторами по отношению к mPerl и mPer2 являются гетеродимеры, сформированные белками CLOCK и BMAL1, имеющими в своем составе структурный мотив helix-loop-helix (HLH). Гетеродимеры CLOCK/BMAL1 связываются с определенной нуклеотидной последовательностью (Е-box) промоторов генов mPerl и mPer2, что инициирует транскрипцию этих mPer-генов. В результате формируются соответствующие мРНК, которые в цитоплазме транслируются в белки mPERl и mPER2. Данные белки транслоцируются в ядро и образуют стабильные комплексы (включающие в себя также белки mCRYl и mCRY2), подавляющие транскрипцию генов mPerl и mPer2 посредством связывания с позитивными факторами CLOCK/BMAL1. В результате формируется чередование подъемов и снижений содержания мРНК, а затем и самих белков mPERl и mPER2 с фазой, равной приблизительно 24 ч. Содержание мРНК mPer2 минимально при переходе от ночной фазы к дневной, максимум приходится на время перехода к ночной фазе.
Существует несколько дополнительных молекулярных циклов, регулирующих циклическую экспрессию генов mPerl и mPer2. Один из этих циклов включает в себя циклическую продукцию позитивного фактора BMAL1, которая находится в противофазе с ритмом экспрессии генов mPerl/2. Другой тип регуляции - антагонистическая регуляция со стороны PAR-белков (HLF, TEF, DBP) и белка Е4ВР4. В гене mPerl имеется специфическая последовательность ATTACGTAAC, с которой эти белки способны связываться. DBP и Е4ВР4 непосредственно связываются с upstream-участком во втором сайте инициации транскрипции
(IB-сайт) гена mPerl; DBP усиливает, a E4BP4 снижает CL0CK/BMAL1 индуцируемую транскрипцию mPerl. В случае гена dbp CLOCK/BMALl-гетеродимер связывается уже с его Е-боксом во втором интроне и инициирует транскрипцию dbp. Поэтому PAR-белки, такие как DBP, экспрессируются в большом количестве в начале дневной фазы и содействуют повышению уровня транскрипции mPerl. Е4ВР4 в обилии продуцируется в начале ночи и содействует супрессии транскрипции mPerl (Okamura, 2003).
Уровень белков PER, сформировавшихся в результате экспрессии генов mPer, также регулируется несколькими факторами, обеспечивающими его стабильность и, по всей видимости, способность проникать в ядро. Фосфорилирование PER казеинкиназой-Іє обеспечивает цитоплазматическую деградацию PER, не связанного с CRY. Также, белок PER менее стабилен в отсутствие CRY и может легко деградировать посредством убиквитинирования и по протеасомному пути. Возможно, именно белок CRY опосредует подстройку биологических часов под внешний ритм освещенности, являясь ингибитором транскрипции mPer и регулируя уровень mPER (Young, Kay, 2001, Okamura, 2003).
Очевидно, что осцилляции, генерируемые на уровне генов и их белковых продуктов, амплифицируются и распространяются за пределы циркадианного осциллятора в SCN. Предполагается наличие двух путей передачи осцилляции от клеток с работающим ритмоводителем и их трансформации. Первый подразумевает прямой контроль посредством CLOCK/BMALl-гетеродимера, который, будучи регулируемым PER/CRY-комплексами, контролирует экспресию вазопрессина, одного из медиаторов нейронов SCN, ген которого имеет промотор, содержащий Е-бокс. Второй путь, непрямой, состоит в регуляции посредством PAR-белков и Е4ВР4. В регуляцию уровня альбумина, холестерол-7а-гидроксилазы и цитохрома Р450 вовлечен данный механизм, в котором PAR-белки действуют на гены-мишени как позитивные, а Е4ВР4 - как негативный регуляторы (Okamura, 2003).
Многочисленные эфферентные проекции связывают SCN с различными структурами мозга, такими как субпаравентрикулярная зона, паравентрикулярные ядра, аркуатные ядра, ядро латерального коленчатого тела, ядра шва, зоны продолговатого мозга. (Saeb-Parsy et al., 2000). Через данные нейрональные связи ритм осциллятора передается другим мозговым структурам, отвечающим за регуляцию различных функций организма. Среди клеточных элементов, с которыми связаны проекции нейронов SCN, - также тела и терминали клеток нейроэндокринной системы, вовлеченных в гуморальный контроль репродуктивной функции (van der Beek et al., 1996, 1997).
Современные представления о механизме обеспечения репродуктивнойцик личности женского организма
Репродуктивная цикличность является характерной чертой физиологии женского организма. Под цикличностью процессов, связанных с репродукцией в женском организме, подразумевается периодичность событий, обеспечивающих функцию размножения, важнейшим из которых является продукция ооцитов, сопряженная с рядом гормональных изменений. Продолжительность полового цикла сильно различается у человека и разных видов животных. У женщин менструальный цикл имеет продолжительность 28±2 дня, у крупного рогатого скота, овец, свиней эстральный цикл длится 21±2 дня, наиболее короткий эстральный цикл имеет место у грызунов и составляет у крыс и мышей 4-5 дней.
Отдельные фазы астрального цикла могут быть хорошо идентифицированы по клеточному составу вагинального содержимого, анализ которого позволяет судить о функциональном состоянии репродуктивной системы женского организма. Цитологические характеристики вагинального секрета зависят от уровня гормонов половых желез. У крыс хорошо различимы следующие фазы полового цикла (Marcondes et al., 2002, Агаджанян и др., 1998): ЬПроэструс - период созревания фолликулов; во влагалищном содержимом преобладают ядросодержащие округлые эпителиальные клетки; 2.Эструс - период овуляции, плодотворного спаривания, который сопровождается повышением половой активности; влагалищный секрет содержит преимущественно ороговевшие эпителиальные клетки, в которых уже отсутствуют ядра; З.Метаэструс (диэструс-1) - период, для которого характерно приблизительно равное содержание клеток трех типов (т.е. ядросодержащих, безъядерных эпителиальных клеток и лейкоцитов) в вагинальном секрете; 4.Диэструс (диэструс-2) - период покоя; в вагинальном содержимом обнаруживаются преимущественно лейкоциты. Установлено, что продолжительность различных фаз эстрального цикла у крыс составляет: проэструс- 12-14 часов, эструс — 25-27 часов, метаэструс (диэструс-1) — 6-8 часов и диэструс-2 - 55-57 часов (Бабичев, 1995).
Незадолго до овуляции в организме происходят выраженные изменения в продукции гонадотропных гормонов гипофиза - фолликулостимулирующего (FSH) и лютеинизирующего (LH) гормонов, которые стимулируют рост ооцитов и их выход из яичников. В течение почти всего эстрального цикла в крови крыс наблюдаются закономерно меняющиеся, но относительно низкие уровни данных гормонов, однако в вечернее время на стадии проэструса наблюдается отчетливый пик их секреции. Содержание LH в сыворотке крови крыс в утреннее время на стадии проэструса равно 96 нг/мл, тогда как вечером концентрация данного гонадотропина достигает порядка 3760 нг/мл. Для FSH характерны менее выраженные преовуляторные изменения (Вундер, 1980).
Другими гормонами, формирующими репродуктивный цикл, являются половые стероиды, уровни которых в крови претерпевают характерные для каждого из них изменения. Уровень эстрадиола, секретируемого яичниками, начинает расти на стадии диэструса-1 от фонового значения (у крыс), равного 7 пг/мл до приблизительно 15-20 пг/мл. Далее уровень эстрадиола сохраняется до вечернего времени на стадии диэструса-2, когда начинает происходить еще более выраженный подъем в концентрации, достигающий максимума (40-50 пг/мл) в утренние часы в проэструсе. Затем уровень эстрадиола снижается, в то время как происходит пик секреции гонадотропинов гипофиза, и возвращается к своему фоновому значению в эструсе. Уровень прогестерона, секретируемого желтым телом, образовавшимся в результате овуляции, возрастает в вечернее время на стадии диэструса-1 и достигает максимального значения (25-30 нг/мл) рано утром в диэструсе-2. В это время происходит резкое падение уровня прогестерона в крови, возвращающегося к фоновым значениям (5-10 нг/мл), обозначающее регрессию желтого тела. Далее уровень прогестерона остается низким до вечернего времени на стадии проэструса, когда его уровнь повышается в связи с преовуляторным выбросом LH (Smith et al., 1975).
Описанная динамика содержания половых стероидов в крови обусловлена регуляторным воздействием LH и FSH гипофиза. Под влиянием секреции гипофизарных гонадотропинов происходит созревание фоликулов, образование в них полости, появление фолликулярной жидкости, формирование оболочек фолликула, превращение их в граафовы пузырьки. Происходит взаимодействие клеток гранулезы и теки, что способствует выработке эстрадиола, секреция которого усиливается по мере роста фолликула. Под влиянием вырабатываемого эстрогена и FSH в фолликуле увеличивается количество рецепторов к LH, повышается реактивность фолликула к действию LH. Последующее выраженное повышение содержания LH в крови приводит к овуляции (Вундер, 1980).
Продукция ооцитов яичниками находится в прямой зависимости от синтеза и секреции в кровь пептидного рилизинг-фактора - гонадолиберина (LHRH). LHRH высвобождается пульсирующим образом и запускает продукцию FSH и LH. Максимальный уровень LHRH наблюдается непосредственно перед преовуляторным выбросом гонадотропинов и критически необходим для формирования последнего. Факт регуляции секреции гонадотропинов посредством LHRH хорошо продемонстрирован в экспериментах, в которых действие этого декапептида было блокировано иммунонейтрализацией или обработкой антагонистами рецепторов, что вело к редукции секреции гонадотропинов, нарушению функции гонад и инфертильности. Стерильность мутантных, непродуцирующих LHRH мышей и бесплодие у человека, связанное с недостаточностью LHRH, также ясно демонстрирует необходимость работы механизма продукции LHRH для реализации функции размножения. В случае крыс применение антагонистов LHRH на стадии проэструса приводит к быстрому и полному ингибированию овуляции.
Особое внимание следует уделить анатомической и функциональной организации LHRH-продуцирующей системы. В ходе эмбрионального развития LHRH-эргические нейроны мигрируют от медиальной ольфакторной плакоды (впячивания) развивающегося обонятельного аппарата через носовую перегородку в передний мозг, проникая в септально-преоптическую область и гипоталамус. К настоящему времени исследования подтверждают гипотезу о том, что все LHRH-содержащие клетки в центральной нервной системе происходят от дискретной группы клеток-предшественников в ольфакторной плакоде и что субпопуляция этих клеток мигрирует в области переднего мозга, где впоследствии приобретает окончательное распределение. Наличие данного пути миграции LHRH-экспрессирующих нейронов объясняет дефицит гонадотропинов при синдроме Калльмана (гипогонадотропиновый гипогонадизм с аносмией). Клинические исследования действительно показывают, что дисплазиятонад со слабо выраженными вторичными половыми характеристиками и дефицит гонадотропинов могут быть связаны с нарушениями в формировании обонятельного аппарата. Окончательное топографическое распределение мигрирующих LHRH-нейронов имеет видовые различия. Так, у опоссума (Monodelphis domestica) нейроны, ответственные за контроль репродуктивной функции, не входят в преоптическую область или гипоталамус, тогда как у мышей и крыс LHRH-перикарионы мигрируют далее до медиальной преоптической области переднего гипоталамуса, в вентральную зону, лежащую непосредственно над оптической хиазмой. У других млекопитающих, таких как морская свинка, овца, обезьяна и человек, эти нейроны обнаруживаются каудальнее, на уровне аркуатных ядер, срединного возвышения и премаммилярного ядра.
Изучение распределения активности моноаминоксидазы среди анатомических структур
Эксперимент выполнен на половозрелых самках (вес 273,1 ± 26,7 г (М ± SD), n = 32). Декапитация крыс проводилась в период с 5 ч от начала экспериментальной дневной фазы до ее окончания. Головной мозг и гипофиз извлекали и подвергали замораживанию при - 65 С.
Выделение и предварительная обработка анатомических структур. Из головного мозга выделяли следующие области (рис.2.2.1): ряд гипоталамических образований (срединное возвышение с окружающей тканью, медиальная преоптическая область и маммилярное тело), корковый участок обонятельных бугорков, миндалины, дорсальное ядро шва и locus coeruleus с окружающей тканью. МПО выделяли в виде участка тетраэдрической формы, вентральная поверхность которого примыкает к дорсальной стороне оптической хиазмы. СВ с окружающей тканью выделяли в виде участка ткани четырехугольно-пирамидальной формы, основание которого содержало собственно срединное возвышение. Ткань гомогенизировали в 0,25 М растворе сахарозы в 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,8. Для проведения моноаминоксидазной реакции использовали супернатант, полученный в результате центрифугирования гомогенатов при 1000 g в течение 10 мин. Рис. 2.2.1. Топография областей головного мозга, использовавшихся для изучения активности МАО (схема, вид с вентральной стороны).
А - миндалины, С - locus coeruleus с окружающей тканью, Е - срединное возвышение с окружающей тканью, М - маммилярное тело, Р - медиальная преоптическая область, R -дорсальное ядро шва, Т - обонятельный бугорок. Статистическую обработку данных выполняли с использованием /-критерия Стьюдента. При сравнении малочисленных групп (п 10) использовали непараметрические Т-критерий Уайта и Х-критерий Ван-дер-Вардена. В качестве критерия достоверности принимали р 0,05.
Изучение суточной динамики активности МАО в МПО, СВ и обонятельных бугорках.
В условиях циклического освещения (12 ч света: 12 ч темноты) декапитацию животных производили в периоды времени, соответствующие 5 - 5,5; 9,5 - 11,5 часам от момента включения света. Далее в работе для указанных периодов используются обозначения 5СТ и 10,5СТ, соответственно.
Для экспериментов использовали животных, находящихся в определенных стадиях эстрального цикла. Сравнивались стадии диэструс-2 и проэструс как следующие друг за другом фазы цикла, в последней из которых происходит пик секреции LHRH. Стадии цикла определяли по соотношению клеток 3 типов, присутствующих в вагинальных мазках (Marcondes, 2002). Правильность определения стадий эстрального цикла контролировалась посредством определения уровней эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови с использованием радиоиммунного анализа (Jurjens et al., 1975, Smith et al., 1975). Также визуально оценивалась степень обводненности матки для подтверждения правильности определения стадий цикла.
При исследовании использовались участки гипоталамуса, соответствующие МПО, СВ с окружающей тканью и ольфакторные бугорки (ОБ) (серое вещество). МПО выбрана в качестве участка, содержащего наибольшую концентрацию тел гонадолиберинергических нейронов, СВ -область преимущественного сосредоточения их терминален (нейрогемальный орган), ольфакторные бугорки - область относительно большого содержания тел LHRH-нейронов (Merchenthaler et al., 1984).
В остальном обработка, материала - согласно описанию в разделе 2.2.г Эксперимент выполнен на 32 крысах.
Для эксперимента использовались крысы трех возрастных групп. Первую группу составили самки в возрасте 1,5-2 месяцев (массой 84,0 ±22,1 г (М ± SD)). Данный возраст представляет перипубертатный период онтогенеза самок крыс. Указанный период охватывает время открытия влагалища и формирования эстральных циклов (Бабичев, 1981). Вторая группа - 4 - 5-месячные половозрелые крысы (средний возраст, характеризующийся оптимальным функционированием репродуктивной системы) (масса 241,8 ± 12,5 г (М ± SD)). В третью группу входили животные в возрасте более 12 месяцев (стареющие крысы) (масса 311,5 ± 18,3 г (М ± SD)). Старение у крыс начинается с 7 по 10 месяцы жизни и в возрасте более 12 месяцев охватывает механизмы гипоталамо-гипофизарного контроля репродуктивной функции, выражаясь в изменении продукции гонадолиберина, снижении уровня стероид-индуцированного выброса лютеинизирующего гормона и других явлениях, сопровождающих переход в состояние ацикличности (Войтенко, 2002, Gore et al., 2000).
Все животные (п = 31) были декапитированы в один день в период с 5 ч до 11 ч дневной фазы экспериментальных суток с чередованием крыс из разных возрастных групп. Головной мозг извлекали, охлаждали до 0С, после чего подвергали замораживанию при -65С.
Выделение МПО и СВ с окружающей тканью - согласно описанию в разделе 2.2. Все анатомические структуры одного и того же вида (МПО или СВ с окружающей тканью) подвергались каждому из отдельных этапов обработки в один и тот же день.
Исследование ферментативной активности в пробах одного вида проводилось в одной серии определений. То же относится к определению концентрации белка в реакционной смеси.
Статистичекую обработку данных выполняли с использованием t-критерия Стьюдента. При сравнении групп с п 10 использовали непараметрический Т-критерий Уайта. Различия считались достоверными при р 0.05. Для исследования корреляционных связей между активностями МАО в МПО и СВ применяли коэффициент корреляции Спирмена (rs).
Характеристики разработанных методов определения активности ферментов
В результате периодических измерений прироста оптической плотности (AOD) при I 327 нм была обнаружена линейная зависимость величины AOD от времени инкубации (рис. 3.1.1). Линейный характер зависимости сохранялся в течение более чем 1,5 ч инкубации при 37 С (установлено для ткани маммилярного тела гипоталамуса при концентрации белка 132мкг/мл реакционной смеси). Также выявлена линейная зависимость AOD в единицу времени от содержания белка в реакционной смеси, сохраняющаяся вплоть до значения концентрации белка, равного 264 мкг / мл в случае ткани маммилярного тела (см. рис. 3.1.2).
Исходя из полученных данных, длительность инкубации 90 мин при 37 С следует считать оптимальной. Оптимальное содержание биологического материала для разных анатомических структур может различаться. Линейная зависимость скорости реакции сохраняется при достаточно высоких концентрациях белка, однако, высокая плотность смеси при этом может сильно затруднять регистрацию хода реакции. Результаты определения активности МАО при использовании данного подхода с оценкой прироста концентрации продукта можно выражать как убыль субстрата, т. е. кинурамина, за единицу времени, отнесенную к содержанию белка. Для этого следует применять соотношение между приростом оптической плотности при 327 нм и одновременной убылью при 360 нм (AOD327/AOD36o) происходящими вследствие увеличения концентрации продукта и сопряженного с ним снижения концентрации субстрата. Данное соотношение ДОБз27/АООзбо составило 1,88. Также, исходя из обнаруженного соотношения и стехиометрии реакции, , следует, что прирост оптической плотности при 327 нм происходит более выраженно, чем ее снижение при 360 нм, что указывает на преимущество использования настоящего подхода как более чувствительного, чем разработанный ранее метод, описанный в работе (Weissbach et al., 1960)(рис. 3.1.3). Чувствительность настоящего метода при инкубации в течение 90 минут її составляет 25 пмоль/мин/мл реакционной смеси (25 нМ/мин). \ Показатель точности определений Р при п=3 в случае инкубации в течение 90 минут , равен 0,63 - 1,95%, т.е. менее 2%, из чего следует, что определения характеризуются высокой точностью.
Полученные результаты позволяют сделать вывод о пригодности предлагаемых значений ; параметров метода для оценки моноаминоксидазной активности в микрообразцах ткани ! головного мозга крыс. Для изучения ферментативной активности в других тканях целесообразна предварительная аналогичная проверка пригодности предлагаемых значений параметров.
К преимуществам данного подхода также следует отнести явную простоту воспроизведения, возможность непрерывной регистрации хода реакции, что в каждом случае позволяет убедиться в постоянстве скорости процесса, и пригодность для работы с микроанатомическими структурами. Среди преимуществ следует также отметить возможность определения содержания белка в той же реакционной среде по методу из работы (Vera, 1988) и, соответственно, уменьшения расхода биологического материала для определения удельной ферментативной активности.
Также для дифференциального определения активности изоферментов МАО с использованием кинурамина был осуществлен подбор подходящей концентрации R-депренила для специфического ингибирования МАО В (рис. 3.1.4). Полученные результаты указывают на отсутствие значительного снижения активности МАО в диапазоне концентраций R-депренила от 2 до 4 мкМ. Вследствие этого, конечная концентрация 2 мкМ была выбрана для ингибирования МАО В в дальнейших экспериментах. Идентичная концентрация также используется другими исследователями для специфического блокирования активности МАО В (Cohen etal., 1997).
Исходя из имеющихся на сегодняшний день сведений об изоферментном составе аминоксидаз головного мозга, следует считать, что представленный метод с использованием кинурамина и регистрацией образования 4-гидроксихинолина пригоден для определения истинной флавинзависимой моноаминоксидазной активности ткани мозга крыс. Кинурамин является общим субстратом для флавиновых аминоксидаз (МАО А и МАО В) и для медьсодержащих САО. Однако, в головном мозге, как считается, САО присутствуют лишь в микрососудах, что позволяет предполагать незначительный вклад данных форм в общую кинураминоксидазную активность (Ucar, 2004). Путем использования І специфических ингибиторов флавиновых изоферментов, таких как R-депренил, можно осуществить дифференцированное определение МАО А и МАО В с использованием кинурамина в качестве субстрата.
Посредством представленного в настоящем исследовании метода выявляются уровни активности МАО, сходные с литературными данными как для активности МАО митохондриальной фракции, выявляемой с использованием серотонина и бензиламина и регистрацией высвобождаемого аммиака (Войтенко и соавт., 1999, Войтенко, 2002), так и для активности МАО в грубых экстрактах мозга (объект - крысы и мыши). Например, по данным из монографии Горкина (1981), активность МАО в гипоталамусе крыс составляет 2 нмоль тирамина / мин / мг белка, что сходно с нашими результатами полученными при использовании кинурамина (см. раздел 3.2). Однако, подобные сравнения в случаях использования разных субстратов следует проводить, помня о возможных различиях в максимальных скоростях катализа, свойственных одному ферменту в отношении различных аминов.
