Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор данных литературы 14
1.1 Эпилепсия 14
1.2 Склероз гиппокампа 19
1.3 Моделирование судорожной активности и эпилепсии на животных21
1.4 Феномен киндлинга 22
1.5 Пентилентетразоловый киндлинг 23
1.6 Структурно-функциональные перестройки в гиппокампе при моделировании эпилепсии на грызунах 28
1.7 Гипотеза «эксайтотоксического повреждения» при судорожной активности 31
1.8 Окислительный стресс при судорожной активности 33
1.9 Пути гибели клетки в норме и патологии 37
1.10 Пути гибели нейронов при судорожной активности 40
1.11 Обоснование комплексного исследования модели пентилентетразолового киндлинга 44
ГЛАВА 2. Материалы и методы 48
2.1 Работа с животными 48
2.2 Моделирование пентилентетразолового киндлинга на крысах 48
2.3 Исследование способности крыс к обучению 49
2.3.1 Условная реакция пассивного избегания 49
2.3.2 Условная реакция активного избегания 50
2.4 Биохимические методы исследования 51
2.4.1 Приготовление гомогенатов ткани мозга 51
2.4.2 Определение содержания продуктов реагирующих с тиобарбитуровой кислотой51
2.4.3 Определение содержания SH-групп 52
2.4.4 Определение содержания белка 53
2.5 Морфологические и иммуно гистохимические методы исследования 53
2.5.1 Подготовка ткани мозга к патоморфологическому исследованию 53
2.5.2 Подсчет нейронов в отделах гиппокамда 54
2.5.3 Выявление фрагментированной ДНК в нейронах гиппокампа 54
2.5.4 Исследование экспрессии циклинов в нейронах гиппокампа 54
2.6 Электроэнцефалографическое исследование 55
2.6.1 Подготовка животных к исследованию 55
2.6.2 Регистрация электроэнцефалограммы 56
2.7 Статистическая обработка результатов 57
ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение 58
3.1 Исследование способности к обучению у животных после пентилентетразолового киндлинга 58
3.1.1 Развитие пентилентетразолового киндлинга 58
3.1.2 Влияние пентилентетразолового киндлинга на условную реакцию активного и пассивного избегания у крыс 60
3.2 Нейропатологические изменения в результате пентилентетразолового киндлинга и их возможные механизмы 64
3.2.1 Нейродсгенерация в гиппокампе животных в результате пентилентетразолового киндлинга 64
3.2.2 Участие окислительного стресса в гибели нейронов 69
3.2.3 Принимает ли участие апоптоз в нейродегенеративных изменениях в результате пентилентетразолового киндлинга? 74
3.2.4 Активация клеточного цикла при гибели нейронов в результате пентилентетразолового киндлинга 75
3.3 Взаимосвязь между конвульсивной активностью, судорожной активностью в мозге, а также неиродегенерациеи в гиппокампе крыс после пентилентетразолового киндлинга 77
3.3.1 Нейродегенерация и окислительный стресс в гиппокампе чувствительных и толерантных к пентилентстразоловому киндлингу животных 77
3.3.2 Исследование электроэнцефалограммы чувствительных и толерантных к пеитплептетразоловому киндлипгу животных 85
Заключение 96
Выводы 100
Литература 102
- Гипотеза «эксайтотоксического повреждения» при судорожной активности
- Пути гибели нейронов при судорожной активности
- Влияние пентилентетразолового киндлинга на условную реакцию активного и пассивного избегания у крыс
- Активация клеточного цикла при гибели нейронов в результате пентилентетразолового киндлинга
Введение к работе
Эпилепсия является одним из наиболее распространенных заболеваний нервной системы, а её лечение является актуальной медико-социальной задачей. Заболеваемость эпилепсией составляет 50-70/100000 человек, распространенность 5-10/1000 человек. Это заболевание сопровождается значительными социальными трудностями, моральными и физическими страданиями больного и членов его семьи. Эпилепсия является одним из приоритетов Всемирной Организации Здравоохранения, проводящей глобальную кампанию "Эпилепсия - из тени". Проявления эпилепсии разнообразны: от кратковременного нарушения сознания до тяжелых конвульсий. Она характеризуется повторными приступами, являющимися симптомами дисфункции мозга. Не менее одного припадка в течение жизни переносят 5 % населения, у 20-30 % больных эпилепсия является пожизненной. Многие больные эпилепсией испытывают серьезные социальные проблемы, которые часто обусловлены нарушением когнитивной функции при этом состоянии. Можно полагать, что нарушение функционирования мозга при эпилепсии обусловлено не только дисфункцией отдельных групп нейронов, но и их гибелью.
Несмотря на то, что эпилепсия не относится к собственно нейродегенеративным заболеваниям, нейродегенерация при многих ее формах считается доказанной (Duncan, 2002). Поэтому чрезвычайно актуальной задачей является исследование механизмов нейродегенерации при эпилепсии. Решение этой задачи необходимо для поиска путей предотвращения гибели нейронов и возможной коррекции дисфункции мозга у больных эпилепсией.
Одним из наиболее удобных экспериментальных приёмов для исследования механизмов изменений, связанных с эпилепсией, является пентилентетразоловый киндлинг (PTZK), поскольку при этом наблюдаются нарушения, в определенной степени аналогичные таковым при эпилепсии височной доли у человека (McNamara, 1985). У экспериментальных животных развиваются судороги, нарушается поведение, повреждаются нейроны. Однако экспериментальных подтверждений гибели нейронов при PTZK немного. Pohle et al. (1997) и Franks and Kittner (2001) показали, что PTZK может вызывать умеренную дегенерацию нейронов в гиппокампе. Механизм гибели нейронов при этом неясен. Однако при амигдалярном электрическом киндлинге удалось установить, что гибель некоторых нейронов в гиппокампе может происходить по апоптотическому пути (Zhang et al., 1997). В последние годы появляются данные о том, что в нейронах может происходить активация аберрантного клеточного цикла, приводящая в конечном итоге к нейродегенерации. Так, например, при эпилепсии височной доли у человека была обнаружена экспрессия нейронального циклина В1 в гиппокампе (Nagy and Esiri, 1998). Поскольку PTZK является общепринятой моделью этой формы эпилепсии, представлялось вероятным, что гибель нейронов при PTZK также происходит с вовлечением активации клеточного цикла.
Неоднократно предпринимались попытки установить количественную связь между силой клонико-тонических судорог, вызванных различными воздействиями, и гибелью нервных клеток в гиппокампе. В некоторых случаях, например, при использовании повторяющегося электрошока, такая связь была обнаружена (Зарубенко и соавт., 2004). В то же время при введении каината такой связи выявлено не было (Bcrger et al, 1989), несмотря на наличие корреляции между силой судорог и рядом показателей окислительного стресса и апоптоза в гиппокампе (Stepanichev et al., 2000). Важно отметить, что до сих пор многие исследователи считают эпилепсию с конвульсивными проявлениями значительно более эффективной в отношении повреждений в селективно чувствительных отделах мозга (в частности, амигдале и гиппокампе), чем эпилепсию без конвульсий, например типа абсанс (Wong, 2003).
Цель работы и основные задачи исследования
Основной целью работы было комплексное исследование влияния пентилентетразолового киндлинга на процессы обучения и памяти, развитие нейродегеперации, а также исследование механизмов гибели нейронов в гиппокампе. Кроме того, целью работы было выявление соотношения вызванной пентилентетразолом конвульсивной активности с одной стороны и процессами возбуждения в гиппокампе и гибелью нейронов с другой стороны. Для этого были поставлены следующие задачи:
Изучить влияние пентилентетразолового киндлинга на способность к обучению условным реакциям пассивного и активного избегания у крыс.
Провести патоморфологическое исследование гиппокампа при пентилентетразоловом киндлинге.
Исследовать возможное участие окислительного стресса в гибели нейронов.
Исследовать возможное участие апоптоза в гибели нейронов.
Исследовать возможное участие аберрантного клеточного цикла в гибели нейронов.
Изучить соотношение между выраженностью конвульсий после пентилентетразолового киндлинга и степенью нейродегенеративных изменений.
Изучить соотношение между выраженностью конвульсий после пентилентетразолового киндлинга и эпилептической активностью мозга.
Научная новизна
В работе впервые проведено комплексное исследование влияния PTZK на процессы обучения и памяти, развитие нейродегенерации, а также механизмов гибели нейронов в гиппокампе. Кроме того, впервые исследовано соотношение между степенью выраженности конвульсивной активности при PTZK и паттернами электроэнцефолограммы в гиппокампе, а также гибелью нейронов.
Впервые выявлено, что PTZK сопровождается накоплением продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, и снижением уровня восстановленных тиолов в гиппокампе крыс.
Впервые продемонстрировано участие аберрантного клеточного цикла как возможного механизма гибели нейронов в гиппокампе крыс после PTZK. Кроме того, показано отсутствие апоптотических ядер в гиппокампе крыс после PTZK.
Впервые было проведено сравнительное исследование крыс Вистар, разделенных на «чувствительных» и «толерантных» к конвульсиям, вызванным PTZK, и установлено, что гибель нейронов и окислительный стресс в гппокампе этих животных не зависят от выраженности конвульсий (нейродегенерацию и окислительный стресс наблюдали и у «толерантных» животных).
Впервые продемонстрирована судорожная активность на ЭЭГ у «толерантных» к конвульсиям крыс. На основе исследований механизма развития PTZK у этих животных предложена новая модель для исследования эпилепсии неконвульсивного типа.
Теоретическая ценность и практическая значимость
В работе систематически исследованы патологические процессы в гиппокампс при экспериментальном моделировании на крысах эпилепсии височной доли.
Выявлены ключевые молекулярные механизмы, сопровождающие не Йро дегенерацию в данной модели эпилепсии. Морфологически показаны зоны гиппокампа, наиболее чувствительные к повреждению при данной модели эпилепсии. Показано, что неиродегенеративные изменения в гиппокампе сопровождаются окислительным стрессом, при этом гибель нейронов не является апоптотической. Более того, нейродегснерация тесно связана с экспрессией циклина В1 - маркера G2 фазы клеточного цикла. Полученные нами свидетельства вовлечения белков клеточного цикла в гибель нейронов при эпилепсии позволили предположить новый механизм связанных с эпилепсией нейродегеиеративных изменений в ЦНС. Выявлены основные механизмы гибели нейронов при PTZK, которые позволяют предполагать общность путей гибели нейронов при нейродегеиеративных заболеваниях и эпилепсии.
Показано, что и у «толерантных» к конвульсиям животных также происходят нейродегенерация и окислительный стресс в гиппокампе, и поэтому наиболее вероятной причиной этих изменений является именно судорожная активность в мозге животных. Чрезвычайно важен для понимания соотношения конвульсий и нейр оде генерации тот факт, что гибель нейронов не зависит от выраженности конвульсий.
Понимание механизмов нейродегенерации при эпилепсии позволит более эффективно искать пути патогенетически обоснованного предотвращения гибели нейронов и возможной коррекции дисфункции мозга у больных. Популяцию крыс, подвергнутых PTZK, можно использовать и как модель конвульсивных судорог («чувствительные»), и как модель неконвульсивной эпилепсии («толерантные»). Использование такой модели может дать существенные преимущества в сравнительном изучении различных нарушений и их механизмов при конвульсивной и неконвульсивной эпилепсии.
Положения, выносимые на защиту
Пентилентетразоловый киндлинг сопровождается изменением способности к обучению условной реакции активного избегания, окислительным стрессом и нейродегенерацией в гиппокампе.
Гибель нейронов не зависит от выраженности конвульсий, не является апоптотической и сопровождается экспрессией циклина В1, маркера фазы G2 клеточного цикла.
Животные без выраженных конвульсий после пентилентетразолового киндлинга демонстрируют генерализованную эпилептическую активность в ЭЭГ, отличную по основным характеристикам от таковой у конвульсивных животных.
Апробация работы
Основные результаты работы были доложены (и опубликованы тезисы) на научных конференциях молодых ученых Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии (Москва, 2002, 2003, 2004, 2005), III съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), I международном симпозиуме «Стресс и экстремальные состояния» (Феодосия, 2002), международном симпозиуме «4th International Symposium on Experimental and Clinical Neurobiology» (Верхние Татры, Словакия, 2003), научной конференции «Опыт интеграции научных исследований НИИ-ВУЗ-Клиника» (Москва, 2002, 2004), XVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004), 8-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Москва, 2004), XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), 20-м съезде Международного нейрохимического общества совместно с Европейским нейрохимическим обществом (Иннсбрук, Австрия, 2005), 35-м ежегодном съезде Общества Нейронаук США (Вашингтон, 2005) и апробированы на совместном семинаре Лаборатории функциональной биохимии нервной системы и Лаборатории нейрохимических механизмов условного рефлекса ИВНДиНФ РАН (Москва, 2005).
Гипотеза «эксайтотоксического повреждения» при судорожной активности
Гипотетически, при моделировании судорожной активности различными агентами, к гибели нейронов могут привести не сами судороги, вызванные этими агентом, а прямое токсическое действие этого агента. Однако при моделировании эпилептических судорог широким спектром эпилепто генных факторов паттерн гибели нейронов в гиппокампе животных сходен с таковым при эпилепсии у человека (Mello et al, 1993, Sutula et al, 1988). Прямые эффекты этих факторов на нейроны различны, но все они вызывают судорожную активность, как при эпилепсии у человека. Скорее всего, именно судорожная активность, вызывает такие повреждения.
Что именно выступает повреждающим фактором при судорожной активности? В конце 1970-х годов, Olney et al. показали, что основные области повреждения нейронов в гиппокампе после судорожной активности точно соответствуют расположению возбуждающих синапсов. Ученые предложили, что вызванные судорогами повреждения происходят в результате избыточной активации, так называемой "эксайтотоксичности" {Olney et al., 1979). Основные результаты в этой области были получены Sloviter et al. в начале 1980-х годов, которые описали патологические эффекты длительной стимуляции перфорантного пути (1111) у крыс (Sloviter and Damiano, 1981; Sloviter, 1983). Исследования показали, что длительное возбуждение ПП вызвало селлективное повреждение интернейронов поля СА4 и пирамидальных нейронов поля САЗ. Sloviter (1991) отметил набухание дендритов нейронов гранулярного слоя в дистальных двух третях молекулярного слоя зубчатой фасции (ЗФ) (место расположения окончаний аксонов ПП), а также набухание дендритов пирамидальных нейронов полей СА1 и САЗ и мшистых клеток поля СА4 (на дентритах нейронов этих полей окончиваются возбуждающие синапсы). Набухание дендритов, как полагали авторы, представляют собой ранние фазы гибели нейронов. Позже было показано, что гибель клеток, которую наблюдают при длительной стимуляции 1111, могут предотвратить антагонисты глутаматных рецепторов (Rothman et al., 1987), а именно глутамат является возбуждающим нейромедиатором в аксонах 1111 и мшистых волокнах нейронов гранулярного слоя.
Дальнейшее подтверждение теории нейротоксического повреждения при судорогах, было получено на модели каинатных судорог (КК — аналог глутамата). Каинатные судороги также вызывали гибель нейронов в селлективно чувствительных отделах гиппокампа (Schwob и другие., 1980). Иссечение входных волокон возбуждающих путей, таких как ПП (Ben АгІ et al., 1980), или волокон мшистого пути (Nadler and Cuthbertson, 1980) приводит к уменьшению повреждений, которые обычно вызывают каинатные судороги.
Наконец, чрезвычайно важное указание на то, что повреждение гиппокампа у человека при эпилепсии височной доли происходит с участием эксайтотоксичности, было получено из печального известного отравления в Квебеке домоатом (аналог глутамата из моллюска). По крайней мере у тридцати человек наблюдали неврологические осложнения, а в течение острой фазы интоксикации у большинства появлялась судорожная активность. У всех четырех погибших пациентов выявили повреждение гиппокампа, именно в слоях пирамидальных нейронов полей СА1, САЗ и СА4 без повреждения поля СА2 (Lowenstein, 2001).
Последовательность событий при эксайтотоксическом процессе повреждения можно представить следующим образом. Связывание глутатмата NMDA-рецепторами приводит к усилению входа Са в клетку.
Концентрация цитозольного свободного Са2+ обычно поддерживается на очень низком уровне за счет работы АТФ-зависимого кальциевого насоса. Основное количество Са21- внутри клетки находится в митохондриях и эндо плазматическом ретикулуме. Если вход Са2+ в клетку быстро не остановить, увеличенный цитозольный Са активизирует различные фосфолипазы (вызывают образование свободных радикалов, перекисное окисление липидов и мембранное повреждение), протеазы (катаболизиругот структурные и мембранные белки), АТФ-азы (истощают пул АТФ) и эндонуклеазы (фрагментирующие ядерный материал). Поэтому избыточный вход Са2+ в клетку часто ведет к клеточной гибели (Mitchell and Cotran, 1997).
Пути гибели нейронов при судорожной активности
До сих пор нет единого мнения о типе клеточной гибели при судорожной активности. До недавнего времени, многие исследователи считали, что нейроны при судорогах гибнут по пути некроза, поскольку в чувствительных к судорогам отделах гиппокампа находили нейроны с признаками некротической гибели (Soderfeldt et al., 1983).
Кроме того, в дендритах пирамидальных нейронов СА1 и САЗ полей гиппокампа, спустя 60-120 минут после судорожной активности, вне зависимости от типа агента вызвавшего судорожную активность, наблюдают накопление кальция в митохондриях, что ведет к их набуханию и, в конечном счете, к их разрушению (Griffiths ct al., 1983; Evans et al., 1984; Evans et al., 1983). Набухание митохондрий - непременное условие клеточного повреждения, и если такое состояние длится долго -нарушается гомеостаз кальция и клетка может погибнуть (Mitchell and Cotran, 1997). Митохондрия переполняется кальцием после 30 минут судорожной активности, и обычно такое изменение обратимо, если судороги прекращаются в пределах 60 мин.
Из многочисленных экспериментов Meldrum сделал заключение, что судорожная активность, которая длится более 30 минут, вызывает острую некротическую гибель нейронов в чувствительных структурах мозга. Такая гибель является следствием избытка кальция в митохондриях и последующего энергетического истощения, а также свободнорадикального повреждения (Meldrum, 1983; Meldrum, 2002).
Позже исследователи обратили внимание на возможность участия апоптоза в гибели нейронов, вызванной судорожной активностью. Так, после status epilepticus, вызванного введением ЮС, некоторые пирамидные нейроны поля САЗ имели признаки апоптоза, такие как конденсация и фрагментация ядерного хроматина и характерный феномен -нуклеосомнуго лестницу (Pollard et al., 1994). Дальнейшие исследования с использованием различных моделей судорожной активности на животных выявили и другие признаки апототической гибели клеток, включая: 1) позитивное окрашивание методом TUNEL (Roux ct al., 1999; Sankar et al., 1998; Zhang et al., 1998; Bengzon et al., 2002) и 2) экспрессия белков, которые принимают непосредственное участие в апоптотических каскадах, такие как каспазы и семейство белков bcl-2 (Liu et al., 1999; Sakhi et al., 1996; Roux et al., 1999; Henshall ct al., 2002; Henshall et al., 2000).
С помощью электронномикроскопического ультраструктурного анализа, Sloviter и коллеги (1996) выявили, что в ответ на длительное возбуждение ПП, в нейронах поля СА4 гиппокампа появляются признаки некроза, с ранней эндоплазматической вакуолизацией. С другой стороны, в нейронах гранулярного слоя зубчатой фасции (которые, как предполагали ранее, являются устойчивыми к повреждениям, вызванным судорожной активностью) выявили признаки апоптоза (Sloviter et al., 1996). Сходные результаты были получены на других моделях, таких как status epilepticus, после введения пилокарпина (Covolan et al., 2000). Интересно, что апоптоз в нейронах был выявлен и после однократного непродолжительного приступа судорожной активности (Bengzon et al., 1997).
При PTZK экспериментальных подтверждений гибели нейронов совсем немного (Pohle et al., 1997; Becker et al., 1999; Franke and Kittner, 2001), при этом механизм гибели нейронов не ясен.
Как уже упоминалось выше, некоторые исследователи предполагают участие третьего альтернативного пути гибели нейронов, путём активации аберантного клеточного цикла. Следует отметить, что Nagy и Esiri (1998) обнаружили экспрессию нейронального циклина в гиппокампе человека с ЭВД и предположили, что в гибнущих нейронах активируется аберрантный клеточный цикл. В работе Timsit, также была показана экспрессия мРНК циклипа D1 после судорог вызванных КК в селективно чувствительных к судорогам областях гиппокампа — СА1 и САЗ. Экспрессия достигала максимума перед конденсацией хроматина и фрагментацией ДНК (Timsit et al., 1999).
Учитывая вышесказанное, можно предложить, что при продолжительной высокоинтенсивной судорожной активности нейроны могут гибнуть как по пути некроза, так и по пути аиоптоза. Тогда как, при непродолжительной низкоинтенсивной судорожной активности, гибель нейронов скорее всего происходит по пути апоптоза. Кроме того, при судорожной активности нейроны могут гибнуть и путём активации аберрантного клеточного цикла, хотя экспериментальных подтверждений этому пока мало.
Как уже было упомянуто выше, продолжительные судороги, такие как при status epilepticus, сильно повреждают гиппокамп, и самые уязвимые отделы-это поле СА4, САЗ и СА1. Однако, данные о гибели клеток после непродолжительных низкоинтенсивных судорог: в моделях киндлинга, электрического или химического, ЭСШ, фибрильных судорог, очень противоречивы. Одни исследования свидетельствуют о значительной гибели нейронов в гиппокампе, в то время как другие свидетельствуют об отсутствие таковой. Так, на модели фибрильных судорог Sarkisian и коллеги показали отсутствие повреждений в гиппокампе (Sarkisian et al., 1999). Однако в другом исследовании, на той же модели фибрильных судорог, показана обширная нейродегенерация в полях САЗ и СА1 и признаки апоптотической гибели (разрывы ДНК). Апоптотирующие нейроны обнаруживали спустя 24 часа после судорог, и такие изменения сохранялись в течение двух недель (Toth et al., 1998).
Влияние пентилентетразолового киндлинга на условную реакцию активного и пассивного избегания у крыс
Животные были разделены на 2 группы (с использованием рандомизированного выбора): Контрольная (п= 12) — хроническое виутрибрюшинное введение изотонического р-ра NaCl с последующим обучением в тестах УРПИ и УРАИ; PTZK (п-12) - хроническое виутрибрюшинное введение PTZ с последующим обучением в тестах УРПИ и УРАИ. Контрольным и киндлированным животным в течение 5 недель вводили NaCl (1 мл/кг) и PTZ (40 мг/кг) соответственно (всего 13 инъекций, каждые 48 ч с перерывом на выходные). Спустя сутки после последней инъекции животных подвергали тесту УРПИ и через 7 суток — тесту УРАИ по протоколам, описанным в главе «Материалы и методы». Через сутки после последней сессии обучения в тесте УРАИ животным однократно вводили NaCl или подпороговую дозу PTZ (challenge) и декапитировали в течение часа после инъекции. Мозг фиксировали для дальнейших патоморфологических исследований.
Выработка киндлинга проявляется как усиление конвульсивной двигательной активности в результате регулярного хронического действия подпороговой дозы конвульсанта. Введение первой подпороговой дозы PTZ (40 мг/кг) либо не вызывало существенных изменений поведения крыс, за исключением кратковременных периодов замирания, либо приводило к появлению внешних признаков судорожной активности, которые выражались в лицевых автоматизмах, кивках головы, треморе вибрисс. Такое проявление судорожной активности обычно оценивается как стадия 1 по шкале Racine (Racine, 1972). Увеличение числа инъекций PTZ приводило к постепенному нарастанию конвульсивной активности, проявлявшемуся в появлении миоклонизмов, увеличении их числа, миоклонических судорогах передних конечностей, совмещенных с подъемом на задние лапы. На рис. 4 представлена кривая развития PTZK, начиная с 3-й инъекции стадия судорог была достоверно выше таковой после 1-й инъекции (р=0,03, Wilcoxon Matched Pairs Test), к концу киндлинга происходило достоверное увеличение силы судорог (Хі2,13 = 71.3, р 0.00001, ANOVA Фридмана) и животные демонстрировали преимущественно стадию судорог 3, согласно шкале Racine. Животные стабильно демонстрировали эту стадию судорог на протяжении 7 последних инъекций PTZK, и такая судорожная активность сохранялась, по крайней мере, в течение 10 дней после последней инъекции PTZ (стадии судорог после 13-й и 14-й инъекции PTZ, сделанной через 10 дней после 13-й, не различались: р=0.25, Wilcoxon Matched Pairs Test).
Системное введение PTZ вызывает физиологические и поведенческие изменения у крыс, которые имитируют эпилепсию человека (Ben-Ari, 1985). Такие изменения проявляются, в частности, в возникновении эпилептических приступов, амнезией (снижением когнитивных способностей) (Becker et al., 1992,1994; Hamm ct al., 1995; Rauca, 2000; Genkova-Papazova et al, 1995; 2000) и другими характерными проявлениями. Предполагается, что нарушение когнитивных способностей опосредовано гибелью нейронов в специфических областях мозга.
В данной работе тест УРПИ не выявил значительных нарушений в выработке навыков пассивного избегания после PTZK. На рис. 5 представлен латентный период входа в темную камеру у контрольных животных и после PTZK: Т(0) — исходный латентный период и Т(24) — латентный период через 24 ч после процесса «обучения» - безусловного подкрепления током. Из рис. 5 видно, что животные обеих групп демонстрировали достоверное увеличение латентного периода входа в темную камеру через 24 ч после обучения (контрольные: р=0.005 и животные после PTZK: р=0.033, Wilcoxon Matched Pairs Test). Таким образом, PTZK не влияет на выработку УРПИ.
Результаты представленные здесь свидетельствуют о незначительных изменениях у животных способности к обучению после PTZK. В ряде работ было показано значительное ухудшение способности к обучению в тесте активного избегания у животных после PTZK (Becker et. al., 1992, 1997; Rauca, 2000). Однако использованные в этих работах животные по окончанию PTZK демонстрировали преимущественно стадию 4-5 по шкале Racine (Racine, 1972), в отличие от преимущественно стадии 3 судорог у животных после PTZK в нашей работе (при одинаковой дозе PTZ). Такая разница в чувствительности животных к PTZK, скорее всего, связана с влиянием ряда внешних и внутренних факторов, таких как возраст, линия крыс (Klioueva et. al., 2000), сезонные и климатические изменения (Loscher ct. al., 1990) и пр. Известны также работы, в которых стадия судорог у животных после хронического введения подпороговых доз PTZ не очень высокая, однако киндлинг развивается (Bazyan et. al., 2001). Вероятно, незначительные изменения поведения у крыс после PTZK в нашей работе, связаны с небольшой стадией судорог у крыс по окончанию PTZK.
Существуют данные о том, что киндлинг может вызывать гибель нейронов (McEachern and Shaw, 1999), однако экспериментальные подтверждения гибели клеток при PTZK весьма немногочисленны. Лишь в нескольких работах (Pohle et al., 1997; Becker ct al., 1999; Rauca С et al, 2000 и Franke and Kittner, 2001) была показана умеренная дегенерация нейронов в различных областях гиппокампа.
Для патоморфологического исследования нами были взяты животные с хроническим введением NaCl (Контроль) и PTZ (PTZK) и последующим обучением в тестах УРПИ и УРАИ. Для того, чтобы оценить влияние только PTZK на гибель нейронов в гиппокампе и отсечь возможный вклад электрического раздражения в неиродегенеративные изменения нами был поставлен дополнительный эксперимент с включением следующих групп: ПК (п=6) - пассивный контроль и АК (п=12) - активный контроль. Животных группы АК подвергали беспорядочному сочетанию УС (вспышки света) и БС (электрический ток) в камере для тестирования УРАИ в течение 3 дней (сессий). Число УС и БС для каждого животного устанавливали своё, исходя из числа сочетаний, полученных каждым животным из группы Контроль на протяжении трёх сессий обучения.65
Животных декапитировали через сутки после окончания 3-й сессии процедуры обучения. Животных группы ПК сажали в камеру для тестирования УРАИ в течение 3 сессий, без предъявления каких либо сигналов, и через сутки после 3-Й сессии животных декапитировали. Мозг фиксировали для дальнейших патоморфологических исследований.
Основными критериями для оценки состояния нейронов гиппокампа после PTZK служили форма и интенсивность окраски ядер на срезах мозга, окрашенных по Нисслю. Клетки со светлоокрашенными, прозрачными округлыми ядрами считали нормальными, тогда как нейроны сжатые, уродливой или треугольной формы с гиперхромно окрашенным ядром и перинуклеарной вакуолизацией рассматривали как поврежденные и/или дегенерирующие. Нейроны с измененной морфологией и признаками дегенерации присутствовали в гиппокампе во всех областях у животных, подвергнутых PTZK (рис. 9 А-3).
Активация клеточного цикла при гибели нейронов в результате пентилентетразолового киндлинга
В последнее время показано, что при некоторых нейропатологических состояниях в терминально дифференцированных нейронах перед их гибелью может происходить активация клеточного цикла. Маркеры митоза обнаруживают в нейронах, находящихся под угрозой гибели в результате действия различных повреждающих факторов. Поскольку в результате PTZK происходит гибель нейронов в гиппокампе, мы предположили, что этот процесс может быть опосредован аберрантным клеточным циклом.
Для того, чтобы выявить нейроны, которые могут находиться в различных фазах клеточного цикла, мы провели иммуногистохимическую реакцию с использованием специфических антител на циклины: Dl, В1, PCNA, а также циклин-зависимые киназы: cdk2 и cdk4 в гиппокампе животных после PTZK и контрольных животных. Для того чтобы оценить, насколько обратимы изменения в поврежденных нейронах (выявленных при окрашивании по Ыисслю) мы использовали окраску ванадиевокислым фукс и ном-толу иди новым синим. В результате иммуногистохимической окраски нами выявлено позитивное окрашивание на циклин В1 (рис. 15 А, Б - представлены микрофотографии поля СА1 гиппокампа, так как для всех остальных областей гиппокампа картина была сходной) в нейронах, характеризуемых как поврежденные (см. главу 3.2.1, рис. 9 Б). Циклин В1-позитивные клетки составляли 88% от всех поврежденных нейронов в поле САЗ, 78% - в поле СА4, 40% - в ЗФ гиппокампа, а в поле СА1 практически все повреждённые нейроны были циклин В1-иммунопозитивными. Как показала окраска ванадиевокислым фуксином, такие повреждённые нейроны были изменены необратимо, поскольку ядро и цитоплазма выкрашивались в красный цвет (рис. 15 В, Г). Нам не удалось выявить позитивное окрашивание для других белков - регуляторов клеточного цикла, таких как Dl, PCNA, cdk2 и cdk4 (данные не представлены).
Таким образом, гибель нейронов при PTZK сопровождается экспрессией циклина В1, но не других маркеров клеточного цикла. Наши результаты совпадают с данными, полученными Nagy and Esiri (1998) на мозге (операционный материал) пациентов с эпилепсией височной доли.
Наблюдения за развитием клонико-тонических судорог у животных показали, что в популяции существует значительная разница в индивидуальной устойчивости особей к проконвульсивным воздействиям. В связи с этим неоднократно предпринимались попытки установить количественную связь между силой клонико-тонических судорог, вызванных различными воздействиями, и гибелью нервных клеток в гиппокампе. В некоторых случаях, например, при использовании повторяющегося электрошока, такая связь была обнаружена (Зарубенко и др, 2004), в то же время, при введении КК нет (Berger et al, 1989). Киндлинг (электрический, химический) приводит к развитию выраженных клонико-тонических судорог. Следствием развития киндлинга является гибель нейронов в гиппокампе (Franke & Kittner, 2001; Pohle et al, 1997) с последующим нарушением процессов обучения и памяти (Grecksch, 1997). Franke и Kittner (Franke & Kittner, 2001) указывают на наличие корреляции между числом судорог стадии 4 у крыс и числом поврежденных клеток в поле СА4 гиппокампа, в то время как другим авторам не удалось обнаружить четкой связи между гибелью нейронов и выраженностью клонико-тонических судорог (Pohle et al, 1997).
Среди животных, подвергнутых PTZK, как было сказано выше, выделяется группа, не демонстрирующая выраженной клонико-тонической стадии судорог на протяжении всего периода киндлинга. Максимальное проявление судорожной активности у этих крыс выглядит как кратковременное замирание, сопровождающееся лицевыми автоматизмами. Обычно эту группу исключают из эксперимента, однако, известно, что даже однократное введение PTZ в подпороговой дозе приводит к появлению спайк-волновых комплексов в электроэнцефалограмме (Marescaux et al., 1984; Wong et al., 2003). Поскольку число устойчивых к киндлингу животных в популяции существенно, нами была поставлена задача выяснить, происходят ли в гиппокампе крыс, устойчивых к киндлингу, структурно-функциональные изменения, аналогичные изменениям в гиппокампе крыс с «нормально» развивающимся киндлингом, т.е сопровождающимся развитием клонико-тонических судорог. Одним из повреждающих факторов, действующих на мозг животного при судорогах, является окислительный стресс (Rauca et al, 1999). Как уже было показано выше (см. главу 3.2.2), в гиппокампе у животных с нормально развивающимся PTZK обнаружен окислительный стресс, поэтому мы решили исследовать содержание глутатиона, как одного из показателей окислительного стресса (HalHwell and Gutteridgc, 1989) в гиппокампе животных с разной чувствительностью к PTZK.
Выработку киндлинга проводили путем внутрибрюшинного введения PTZ в су б конвульсивной дозе (40 мг/кг) каждые 48 ч. Контрольным крысам вводили по 1 мл/кг изотонического раствора NaCl в том же режиме. После каждого введения наблюдали поведение животных и конвульсивные проявления судорожной активности оценивали по шкале Racine. Животных разделяли на чувствительных (чувствительные крысы, ЧК) и толерантных к киндлингу (толерантные крысы, ТК) с помощью кластерного анализа.
