Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Действие ноотропных препаратов на память 8
1.2. Влияние физиологически активных веществ с ноотропными свойствами
На процессы обучения и памяти 11
1.3. Влияние физиологически активных фармакологических препаратов природного происхождения на память 1.5
1.4. Структурно-функциональная организация неокортекса 19
1.5. Классификации нейронов неокортекса, отражающих их структурно-функциональное состояние 27
1.6. Роль неокортекса в обучении и памяти 31
Глава 2. Материалы и методы 39
2.1. Схема экспериментов 39
2.2. Поведенческие эксперименты .4.1
2.2.1. Выработка условного рефлекса пассивного избегания 41
2.2.2. Тест «открытое поле» 42
2.3. Светооптическое исследование. 43
2.3.1. Изготовление и обработка криостатных срезов 43
2.3.2. Изготовление и обработка полутонких срезов 46
2.4. Электронно-микроскопическое исследование. 47
2.4.1. Изготовление и обработка ультратонких срезов 47
Глава 3. Результаты поведенческих экспериментов 49
3.1. Поведение крыс в тесте «открытое поле» . 49
3.2. Обучение крыс условному рефлексу пассивного избегания (урпи) 53
Глава 4. Результаты морфологических исследований 55
4.1. Структурно-функциональное состояние нейронов неокортекса на фоне применения полидана и пирацетама у необученных крыс .55
4.1.1. Перераспределение различных типов нейронов.
4.1.2. Исследование количества ядрышек в выделенных типах нейронов 66
4.1.3. Ультраструктурный анализ рибосомального аппарата и митохондрий в нейронах неокортекса 72
4.2. Структурно-функциональное состояние нейронов неокортекса на фоне применения полидана и пирацетама у крыс после выработки урпи 84
4.2.1 перераспределение различных типов нейронов 84
4.2.2 исследование количества ядрышек
В выделенных типах нейронов 93
Глава 5. Обсуждение результатов 96
Выводы 104
Список литературы 106
- Действие ноотропных препаратов на память
- Схема экспериментов
- Поведение крыс в тесте «открытое поле» .
- Структурно-функциональное состояние нейронов неокортекса на фоне применения полидана и пирацетама у необученных крыс
Введение к работе
Исследование механизмов обучения и памяти является одной из актуальных проблем современной нейробиологии (Ашмарин, 1975; Виноградова, 1975; Кругликов, 1981; Бородкин, Зайцева, 1982; Markowitsch, 1997; Berman, Dudai, 2001; Lynch, 2004; Nakagima, Tang, 2005; Izquierdo, 2006; Marshuetz, Smith, 2006). Неврологические расстройства разной этиологии часто сопровождаются ухудшением памяти. Поэтому коррекция памяти с помощью различных фармакологических препаратов является важнейшей задачей при лечении этих патологий (Азарашвили, 1981; Arciniegas, Silver, 2006; Glannon, 2006).
Многолетние биохимические и ультраструктурные исследования свидетельствуют, что в основе механизмов памяти лежат структурно-метаболические изменения, связанные с усилением синтетических процессов в центральной нервной системе (ЦНС) (Куликова и др., 1992; Анохин, 2001; Hyden, 1973,1978; Davis, Squire, 1984; Kim et al., 2004). Введение препаратов, активизирующих эти процессы, может улучшать сохранение памятного следа (Тушмалова, 1994; Vernon, Sorkin, 1991). На основании этих исследований была выдвинута гипотеза об оптимизации памяти биологически активными препаратами - активаторами метаболических процессов (Тушмалова, 1994). Опираясь на эту гипотезу, становится возможным с высокой степенью вероятности прогнозировать мнемотропное действие различных биологически активных фармакологических препаратов, являющихся активаторами метаболических процессов в разных системах организма. Так, было спрогнозировано, а затем в поведенческих экспериментах доказано мнемотропное действие таких препаратов, как деринат, пантогематоген, пиявит и др. (Прагина, Тушмалова, 1999, 2000; Прагина и др., 1999; Тушмалова и др., 2001).
К одним из таких препаратов относится и полидан, активным компонентом которого является вытяжка из молок осетровых рыб. Этот
4 препарат используется в онкологии как стимулятор гемопоэза и представляет собой смесь натриевых солей ДНК и РНК (Бычков и др., 1997). Исследование влияния полидана на выработку различных типов условных рефлексов у крыс показало, что под действием этого препарата улучшается сохранение памятного следа (Прагина и др., 1998; Тушмалова и др., 1999; Прагина и др., 2003), что доказывает его мнемотропный эффект. Каковы структурные корреляты в мозге мнемотропного действия полидана не исследовано. Это актуально не только для общего понимания механизмов улучшения памяти под действием полидана и подобных ему препаратов, но и для оценки их влияния на мозг, что важно для практической медицины.
Следует отметить, что аналогичным эффектом обладает и классический ноотропный препарат пирацетам, являющийся синтетическим циклическим аналогом гамма-аминомаслянной кислоты (Ковалев, 1990; Прагина и др., 1990). Чтобы понять, на каком структурно-функциональном фоне происходит улучшение памяти под действием полидана и пирацетама, и сравнить механизм их действия, необходимо провести сравнительное морфологическое исследование влияния этих препаратов на мозг обученных и необученных животных. Новая кора, в частности ее соматосенсорная область, играет ключевую роль в процессах обучения и памяти (Павлов, 1928; Ашмарин, 1975, 1987; Кругликов, 1981; Fuster, 2000; Ivanco et al., 2000; Leisman et al., 2000; Berman, Dudai, 2001; Hoffman, McNaughton, 2002; Morgado, 2005; Chen, Desmond, 2005). Поэтому сравнительное исследование структурно-метаболических коррелятов мнемотропного эффекта полидана и пирацетама в соматосенсорной области неокортекса актуально. Такое исследование позволит приблизиться к пониманию клеточных метаболических механизмов, опосредующих позитивное влияние мнемотропных препаратов на основные когнитивные функции новой коры.
5 Цели и задачи исследования
Цель настоящей работы состояла в исследовании структурно-функциональных коррелятов улучшения памяти под влиянием мнемотропных препаратов полидана и пирацетама. При этом были поставлены следующие задачи:
Исследовать влияние полидана и пирацетама на обучение крыс условному рефлексу пассивного избегания (УРПИ);
Исследовать влияние полидана и пирацетама на поведение крыс в тесте «Открытое поле»;
Провести ультраструктурный анализ митохондрий и рибосомального аппарата пирамидных нейронов V слоя соматосенсорной области неокортекса у необученных животных на фоне введения полидана и пирацетама;
Провести гистологический анализ распределения различных типов пирамидных нейронов, отличающихся по интенсивности окрашивания, и оценить в них количество ядрышек в V слое соматосенсорной области неокортекса у необученных и обученных УРПИ крыс на фоне введения полидана и пирацетама.
Положения, выносимые на защиту
Полидан и пирацетам оказывают сходное мнемотропное действие на условнорефлекторную память крыс.
Полидан и пирацетам оказывают на метаболизм нейронов новой коры у необученных крыс активирующие воздействие.
Активация нейронов неокортекса у необученных животных на фоне введения полидана и пирацетама сходна с таковой при обучении УРПИ без введения препаратов.
Наибольшая активация нейронов неокортекса происходит при выработке УРПИ на фоне полидана и пирацетама.
Научная новизна и практическая значимость работы
Работа посвящена исследованию структурно-функциональных основ памяти и ее улучшения на фоне мнемотропных препаратов. Впервые был проведен сравнительный анализ поведения крыс при обучении УРПИ и в тесте «Открытое поле» на фоне введения препаратов полидана и пирацетама, и показано их сходное мнемотропное действие.
Впервые с использованием методов гистологии и электронной микроскопии было показано, что полидан активирует нейроны соматосенсорной области неокортекса у необученных крыс. Это активирующие воздействие на светооптическом уровне проявляется в изменении распределения типов нейронов, находящихся в различных структурно-функциональных состояниях, и в увеличении количества ядрышек в этих типах клеток в разных слоях коры. На электронно-микроскопическом уровне показаны изменения в рибосомальном аппарате и митохондриях пирамидных нейронов V слоя неокортекса на фоне применения полидана у необученных крыс, так же свидетельствующие об активации синтетических процессов. Показано что, степень активации различна при разных схемах введения препарата. Степень активации в нейронах неокортекса при однократном введении полидана была такой же, как и при пятикратном введении классического ноотропного препарата пирацетама. Пятикратное введение полидана оказывало чрезмерное активирующие воздействие на нейроны неокортекса, что может указывать на негативное влияние на мозг этой схемы введения препарата. Полученные результаты свидетельствуют о том, что активация синтетических процессов в неокортексе под воздействием полидана и пирацетама, по-видимому, являться тем структурно-функциональным фоном, на котором происходит улучшение запоминания.
Впервые на светооптическом уровне в неокортексе были обнаружены структурные корреляты сохранения памятного следа после выработки УРПИ. Картина изменений в нейронах неокортекса на фоне введения полидана и
7 пирацетама у необученных животных была аналогична таковой после обучения УРПИ у животных, не получавших мнемотропные препараты. Обучение УРПИ на фоне мнемотропных препаратов вызывало наибольшую степень активации синтетических процессов в нейронах неокортекса. Таким образом, впервые было показано с использованием поведенческих, гистологических и электронно-микроскопических методов исследования, что вещества различной природы (полидан и пирацетам) оказывают сходное активирующие воздействие на нейроны неокортекса, которое обуславливает их сходный мнемотропный эффект на сохранение памятного следа.
Разработаны методические приемы исследования популяции нейронов в неокортексе, которые могут применяться для оценки влияния различных экспериментальных воздействий на неокортекс. Полученные в настоящей работе новые данные о структурно-функциональных коррелятах обучения и памяти, как под действием мнемотропных препаратов, так и без них, являются важными для фундаментальных исследований о механизмах когнитивных функций ЦНС. Они демонстрируют ранее неизвестное активирующие влияние полидана на мозг и могут быть учтены в клинике.
Действие ноотропных препаратов на память
Когнитивные процессы в ЦНС, в частности, обучение и память, необходимы для существования человека и животных в постоянно меняющихся условиях окружающей среды. Большинство неврологических расстройств часто сопровождается нарушением памяти, поэтому поиск фармакологических препаратов, оказывающих мнемотропное действие, остается одной из актуальных проблем современной нейробиологии. Традиционно, для коррекции памяти используют различные психотропные препараты. Среди них особое место занимают ноотропные препараты (Воронина, 1989; Каркищенко, 1993; Воронина, Середенин, 1998; Арушанян, 2003, 2004; Vemon, Sorkin, 1991; Winnicka, 2005). Ноотропами называют вещества, которые оказывают специфическое влияние на высшие интегративные функции мозга, стимулируя обучение и память, улучшающие умственную деятельность, повышая устойчивость мозга к повреждающим факторам (Ковалев, 1990). В группу ноотропных препаратов входят производные пирролидона или рацетамы (пирацетам, оксирацетам, анирацетам, нефирацетам). К группе ноотропных препаратов относят также препараты синаптотропного действия, включающие в себя холиномиметические средства (физостигмин, такрин, цитокинин), ГАМК-ергические вещества (гаммалон, пантогам, фенибут), глутаматергические препараты (глутаминовая кислота, глицин, мемантин) и дофаминомиметики (селегинин, мидантан). К ноотропам так же относят нейропротекторы (циннаризин, мексидол), церебральные вазодилататоры (винпоцетин, ницерголин), нейропептиды и некоторые гормоны (Арушанян, 2004).
Одним из наиболее изученных препаратов из этой группы является пирацетам (Трофимов и др., 1996; Stancheva et al, 1991; Nicholson, 1990; Vianna et al., 1992; Bhattacharya et al., 1993; Song et al., 1997; Moran et al., 2002). Этот препарат наиболее полно соответствует фармакологической характеристике идеального ноотропного средства и рассматривается как «эталонный» ноотроп, представляющий собой циклическую производную ГАМК (2-оксо-1-пирролидина ацетамид) (Ковалев, 1990). Пирацетам улучшает процессы обучения и памяти у животных, как в норме, так и при патологических нарушениях, повышает устойчивость головного мозга к повреждающим факторам, в частности при гипоксии (Mondadori et al., 1989; Heiss et al., 1991; Vemon, Sorkin, 1991; Winnicka et al., 2005). Основной механизм действия пирацетама, как и многих других ноотропов, связан с изменением метаболических, биоэнергетических процессов в нервной клетке, повышением скорости оборота информационных макромолекул и активацией синтеза белка. Пирацетам ускоряет нейрональный метаболизм за счет активации АТФ, активируя аденилатциклазу в мозге (Gabryel et al., 1999), повышает утилизацию глюкозы (Benzi et al., 1984; Grau et al., 1987), увеличивает скорость синтеза РНК, ДНК и протеинов, повышает скорость обмена дофамина в мозговой ткани (Nicholson, 1990), улучшает синаптическую передачу (Воронина, 2003). В опытах с включением метки Р32 показано, что под влиянием пирацетама активизируется биосинтез РНК, белков, липидов (Ковалев, 1990). В аналогичных экспериментах была установлена эффективность препарата пиридитола, причем белковый синтез активизировался под его влиянием, как у молодых, так и у старых животных (Арушанян, 2003). Пиридитол, так же как и пирацетам, влияет на метаболизм глюкозы (Ковалев, 1990). Введение пирацетама вызывает улучшение сохранения памятного следа при обучении животных условному рефлексу пассивного избегания (Прагина и др., 1990; Song et al., 1997). Причем, механизм положительного модулирующего действия пирацетама в этой модели условнорефлекторной памяти связан с активацией двух типов кортикостеройдных рецепторов (глюкокортикойдных и минералкортикойдных) (Loscertales et al., 1998).
Показано, что пирацетам снижает высокопороговые К+-и Са2+-токи (Солнцева и др., 1996)..Этот эффект пирацетама рассматривается как один из возможных механизмов его антиамнестического действия (Солнцева и др., 1996). Новый ноотропный препарат ГВС-111 (1Ч-фенил-ацетил-Ь-пролил-глицин) так же оказывал влияние на К -и Са -токи, сравнимое с действием пирацетама. В поведенческих экспериментах было показано, что ГВС-111 существенно превосходил пирацетам по способности улучшать обучение, нарушенное различными повреждающими воздействиями (Солнцева и др., 1996). Пирацетам и препарат ГВС-111 оказывали сходное влияние на частотные спектры ЭЭГ (Ковалев и др., 1999).
К ноотропным препаратам относят и кавинтон, являющейся производной аповинкамовой кислоты. Кавинтон оказывает непосредственное воздействие на мозговой метаболизм, угнетая фосфодиэстеразу и тормозя, тем самым, темпы расщепления ц-АМФ. В результате повышения уровня ц-АМФ происходит активация 6-фосфофруктокиназы и усиление поступления продуктов расщепления глюкозы в цепи трикарбоновых кислот, что приводит к увеличению выработки АТФ (Ковалев, 1990).
Наряду с известными, хорошо изученными препаратами ведется поиск новых ноотропных препаратов. К подобным относят препарат нооглютил (К-(5-оксиникотиноил)-Ь-глутаминовая кислота), обладающий выраженной антиамнестической и противогипоксической активностью. Механизм действия этого препарата связан со взаимодействием с глутаматергическои системой на уровне позитивной модуляции АМРА-рецепторов (Воронина и др., 2002).
У старых животных, страдающих нарушениями памяти, введение вимпоцетина, относящегося к ряду церебральных вазодилататоров, вызывает улучшение сохранения памятного следа в различных поведенческих задачах. Этот эффект достигается за счет активации общего кровотока в мозговых сосудах, что приводит к усилению общего метаболизма (McDaniel et al., 2003).
Схема экспериментов
Работа выполнена на 77 крысах-самцах линии «Вистар» массой 180-200 грамм, выращенных в питомнике «Столбовая». Крыс содержали в виварии в стандартных условиях при температуре помещения 22-24 С, относительной влажности 60% и циклом свет/темнота 10/14 часов. Вентиляция воздуха в помещении производилась с объемной скоростью 10-15 м3/час. Крыс содержали в клетках размером 20x32x55 см. Все эксперименты проводили согласно «Правилам работы с использованием экспериментальных животных» (приказ Минвуза от 13.11.84 г. №724).
Всех животных разделили на 11 групп по 7 крыс (п=7) в каждой. Шесть групп необученных крыс использовали для исследования влияния полидана и пирацетама на структурно-функциональные изменения в нейронах неокортекса: 1) группа «Полі» (п=7) - введение полидана однократно (75 мг/кг); 2) группа «Пол5» (п=7) - введение полидана один раз в сутки (75 мг/кг) в течение пяти дней; 3) группа «Пир 5» (п=7) - введение пирацетама один раз в сутки (300 мг/кг) в течение пяти дней; 4) группа «К1» (п=7) - введение 1 мл физиологического раствора однократно; 5) группа «К5» (п=7) - введение 1 мл физиологического раствора один раз в сутки в течение пяти дней; 6) группа «Норма» (п=7) - интактные контрольные животные. Через 2 часа после последнего введения препаратов у животных извлекали головной мозг для последующей гистологической обработки и морфометрического исследования.
Следующие пять групп животных использовали для исследования влияния обучения животных УРПИ на структурно-функциональные состояния нейронов неокортекса на фоне применения полидана и пирацетама: 7) группа «ПолІ+УРПИ» (п=7) - введение полидана однократно (75 мг/кг) с последующим обучением животных УРПИ; 8) группа «Пол5+УРПИ» (п=7) - введение полидана один раз в сутки (75 мг/кг) в течение пяти дней с последующим обучением животных УРПИ; 9) группа «К1+УРПИ» (п=7) - введение 1 мл физиологического раствора однократно с последующим обучением животных УРПИ; 10) группа «К5+УРПИ» (п=7) - введение 1 мл физиологического раствора один раз в сутки в течение пяти дней с последующим обучением животных УРПИ; 11) группа «Норма+УРПИ» - интактные контрольные животные, у которых вырабатывали УРПИ.
Через два часа после последнего введения препаратов животных этих групп обучали УРПИ. Через сутки после обучения проводили тестирование. Затем у животных извлекали головной мозг для гистологической обработки и морфометрического исследования.
Все препараты вводились внутрибрюшинно в одинаковом объеме (1 мл). Использовали следующие препараты: 1) полидан - ООО "Научно-производственное фармацевтическое предприятие «Полидан», регистрационный номер: №95/292/8; 2) пирацетам - ООО «Хант-Холдинг», регистрационный номер 79/463/7; 3) физиологический раствор (0,9 % раствор NaCl) - ОАО «Биохимик», регистрационный номер: №002134/01-2003.
Всех животных проверяли в тесте «Открытое поле» за неделю до первого введения препаратов. Повторное тестирование в открытом поле проводили через один час после однократного введения (ПолІ+УРПИ, К1+УРПИ) и через один час после последнего пятого введения препаратов (группы ПолІ+УРПИ, Пир5+УРПИ, К5+УРПИ).
Крыс умерщвляли методом декапитации под глубоким эфирным наркозом. Мозг быстро извлекали из черепа и разрезали по средней линии на две половины. Левое полушарие фиксировали в 10% растворе формальдегида на фосфатном буфере (рН=7,2-7,4). Этот материал использовали для изготовления замороженных срезов толщиной 16 мкм, которые исследовали светооптически. Из правого полушария вырезали блоки соматосенсорной области неокортекса, которые обрабатывали (фиксировали, разрезали и заливали в эпоксидную смолу) по стандартной методике для электронной микроскопии (Саркисов, Боголепов, 1967). Залитый материал использовали для изготовления полутонких срезов толщиной 1,5 мкм (для светооптического исследования) и ультратонких срезов толщиной 500А (для электронно-микроскопического исследования).
Поведение крыс в тесте «открытое поле» .
Тестирование животных из групп К1+УРПИ, ПолІ+УРПИ, К5+УРПИ, Пир5+УРПИ в открытом поле проводилось дважды: за одну неделю до начала введения физиологического раствора, полидана или пирацетама и через час после последней инъекции препаратов (до обучения УРПИ). Так же исследовалось поведение в открытом поле интактных животных (группа Норма+УРПИ). Анализировали двигательную активность (число пересеченных квадратов), вертикальную исследовательскую активность (количество и время стоек), число и время замираний, горизонтальную исследовательскую активность (число и время норковых реакций), количество и продолжительность актов груминга.
При сравнении опытных групп животных (ПолІ+УРПИ, Пир5+УРПИ) с соответствующими контролями (К1+УРПИ, К5+УРПИ), как в первом тестировании (за неделю до введения препаратов), так и во втором (через час после последней инъекции препаратов), не было обнаружено статистически значимых отличий по всем исследуемым показателям (табл. 1).
При анализе динамики исследуемых показателей в открытом поле внутри групп было показано, что при втором тестировании по сравнению с первым наблюдалось уменьшение уровня двигательной активности (число пересеченных квадратов) во всех группах животных (табл. 1, рис. 2). Уменьшалось время норковых реакций в группах (К1+УРПИ и К5+УРПИ -р 0,05, а в группе ПолІ+УРПИ - р 0,1) (табл. 1). Снижалось количество норковых реакций в группе К1+УРПИ (р 0,05) и в группах ПолІ+УРПИ, К5+УРП (р 0,1) (табл. 1). Так же уменьшалось время стоек в группе ПолІ+УРПИ и Норма+УРПИ (р 0,05) и в группе Пир5+УРПИ (р 0,1) (табл. 1). Во всех группах, за исключением К1+УРПИ, наблюдалось уменьшение числа стоек (р 0,05). При анализе показателей времени и количества актов груминга во всех группах крыс не было выявлено статистически значимых отличий между двумя сеансами в открытом поле (табл. 1). Общее время замираний увеличивалось в группах Пол1+УРПИ, К5+УРПИ, Пир5+УРПИ (р 0,05), и в группе К1+УРПИ в виде тенденции (р 0,1). Наблюдалось также увеличение числа актов замираний в группах ПолІ+УРПИ, Пир5+УРПИ (р 0,05) (табл. 1).
Таким образом, было показано, что все контрольные и опытные группы животных не отличались между собой по поведению в открытом поле, как до начала введения препаратов, так и через два часа после их последней инъекции. При этом ко второму тестированию у всех групп животных наблюдалось снижение двигательной и исследовательской активности и увеличение времени и числа актов замирания, что свидетельствовало о привыкании крыс к обстановке в открытом поле. Из этого следует, что и полидан, и пирацетам не оказали значимого влияния на исследуемые показатели поведения крыс в тесте «Открытое поле».
Обучение животных из групп К1+УРПИ, ПолІ+УРПИ, К5+УРПИ, Пир5+УРПИ и Норма+УРПИ условному рефлексу пассивного избегания (УРПИ) проводили через два часа после последней инъекции препаратов. При обучении группы контрольных и опытных крыс не отличались по времени латентного периода нахождения в светлой части камеры (табл. 2, рис. 3, А).
Проверку состояния рефлекса проводили через 24 часа после обучения УРПИ и, критерием мнемотропного эффекта вводимых препаратов служила продолжительность латентного периода нахождения крыс в светлом отсеке. Было показано, что на фоне внутрибрюшинного однократного введения полидана и пятикратного введения пирацетама статистически значимо увеличивается время сохранения памятного следа по сравнению, как с соответствующими контролями (группы К1+УРПИ и К5+УРПИ), так и с интактными животными (группа Норма+УРПИ) (табл. 2, рис. 3, Б). Сравнение опытных (ПолІ+УРПИ и Пир5+УРПИ), а также контрольных групп (К1+УРПИ, К5+УРПИ и Норма+УРПИ) между собой не выявило статистически достоверных отличий по времени латентного периода (табл. 2).
Таким образом, однократное внутрибрюшинное введение полидана оказывает мнемотропное действие на крыс, сравнимое с мнемотропным действием пятикратного введения классического ноотропного препарата пирацетама. Эти данные согласуются с ранее проводимыми исследованиями влияния полидана и пирацетама на память (Тушмалова и др., 1995; Прагина и др., 1990; Тушмалова и др., 1999).
Дальнейшая проверка сохранности выработанного навыка у животных не проводилась, так как эти группы крыс сразу после тестирования умерщвляли и использовали для морфологического исследования.
Структурно-функциональное состояние нейронов неокортекса на фоне применения полидана и пирацетама у необученных крыс
Обучение животных из групп К1+УРПИ, ПолІ+УРПИ, К5+УРПИ, Пир5+УРПИ и Норма+УРПИ условному рефлексу пассивного избегания (УРПИ) проводили через два часа после последней инъекции препаратов. При обучении группы контрольных и опытных крыс не отличались по времени латентного периода нахождения в светлой части камеры (табл. 2, рис. 3, А).
Проверку состояния рефлекса проводили через 24 часа после обучения УРПИ и, критерием мнемотропного эффекта вводимых препаратов служила продолжительность латентного периода нахождения крыс в светлом отсеке. Было показано, что на фоне внутрибрюшинного однократного введения полидана и пятикратного введения пирацетама статистически значимо увеличивается время сохранения памятного следа по сравнению, как с соответствующими контролями (группы К1+УРПИ и К5+УРПИ), так и с интактными животными (группа Норма+УРПИ) (табл. 2, рис. 3, Б). Сравнение опытных (ПолІ+УРПИ и Пир5+УРПИ), а также контрольных групп (К1+УРПИ, К5+УРПИ и Норма+УРПИ) между собой не выявило статистически достоверных отличий по времени латентного периода (табл. 2).
Таким образом, однократное внутрибрюшинное введение полидана оказывает мнемотропное действие на крыс, сравнимое с мнемотропным действием пятикратного введения классического ноотропного препарата пирацетама. Эти данные согласуются с ранее проводимыми исследованиями влияния полидана и пирацетама на память (Тушмалова и др., 1995; Прагина и др., 1990; Тушмалова и др., 1999).
Дальнейшая проверка сохранности выработанного навыка у животных не проводилась, так как эти группы крыс сразу после тестирования умерщвляли и использовали для морфологического исследования.
Среди однородных популяций пирамидных нейронов V и III слоев, а так же среди звездчатых нейронов II слоя соматосенсорной области неокортекса было выделено 4 типа нейронов, различающихся по интенсивности окрашивания по методу Ниссля. Это - нейроны с темно-синими ядром и цитоплазмой (1-й тип), с синими ядром и цитоплазмой (2-й тип), со светлым ядром и синей цитоплазмой (3-й тип), со светлыми ядром и цитоплазмой (4-й тип). Примеры таких нейронов в V и II слоях неокортекса на полутонких срезах представлены на рис.4. Согласно литературным данным, выделенные типы нейронов являются клетками с различной функциональной активностью (обзор литературы, пункт 1.5.).
Все выделенные типы нормальных пирамидных нейронов в однородной их популяции отличались и по размерам. Так, при сравнении размеров разных типов нейронов в V слое соматосенсорной области неокортекса было показано, что нейроны 2-го типа имеют меньший размер по сравнению с нейронами 3-го и 4-го типов. Это закономерность была выявлена для всех контрольных и экспериментальных групп без обучения. При этом разницы между группами по этим показателям обнаружено не было (табл. 3).
В настоящей работе мы детально проанализировали количественное соотношение (распределение) типов пирамидных нейронов в V слое соматосенсорной области неокортекса на криостатных срезах, окрашенных методом Ниссля во всех группах необученных и обученных УРПИ животных на фоне введения исследуемых препаратов. Важно подчеркнуть, что все выделенные типы нейронов встречались в V слое неокортекса животных из всех групп. Различия между группами по этому параметру были обнаружены при количественном анализе. Все изменения, представленные в тексте, статистически достоверны, уровни значимости р приведены в таблицах.
В данной части работы исследовались распределение разных типов нейронов в группах необученных животных (Полі, Пол5, Пир5 и группы К1, К5, Норма) (рис. 5, А, Б; 6, А, Б, В). Было показано, что количество пирамидных нейронов с темно-синими ядром и цитоплазмой (1-й тип) на фоне пятикратного введения пирацетама и полидана, а также однократного ведения полидана не изменяется по сравнению с соответствующими контролями. Однако, сравнение опытных групп между собой показало увеличение числа нейронов 1-го типа в группе Пол5 (пятикратное ведение полидана) по сравнению с группами Полі (однократное введение полидана) и Пир5 (пятикратное введение пирацетама). При сравнении между собой групп Полі и Пир5 по числу нейронов 1-го типа не было найдено статистически достоверных отличий. Контрольные группы (К1 и К5) также не отличались по этому показателю между собой и по сравнению с группой Норма (табл. 4, рис. 7, 8).
При этом пятикратное введение полидана и пирацетама, а также однократное введение полидана вызывало уменьшение нейронов с синими ядром и цитоплазмой (2-й тип) по сравнению с соответствующими контролями. Контрольные группы (К1 и К5) не отличались по этому показателю между собой и по сравнению с группой Норма (табл. 4, рис. 7, 8). Количество нейронов с синим ядром и светлой цитоплазмой (3-й тип) увеличивалось на фоне однократного введения полидана и пятикратного введения пирацетама по сравнению с соответствующими контролями. Однако пятикратное введение полидана не вызывало изменений количества нейронов 3-го типа по сравнению с соответствующим контролем (табл. 4, рис. 7, 8). При сравнение опытных групп между собой было показано, что в группах Пир5 и Полі количество нейронов 3-го типа статистически значимо больше чем в группе Пол5. Кроме этого, группы крыс, которым однократно вводили полидан (группа Полі) и пятикратно пирацетам (группа Пир5), также статистически значимо отличались между собой по числу нейронов 3-го типа. Их количество было больше в группе Полі по сравнению с группой Пир5. Контрольные группы (К1 и К5) не отличались между собой и с группой Норма по числу нейронов 3-го типа (рис. 7, 8).
Число нейронов со светлыми ядром и цитоплазмой (4-й тип) увеличивалось в группах Полі, Пол 5 и Пир5 по сравнению с соответствующими контролями. Однако сравнение опытных групп между собой показало, что степень этого увеличения неодинакова в различных группах опытных крыс. Так, наибольшее (двукратное) увеличение нейронов 4-го типа наблюдалось при пятикратном введении полидана (группа Пол5). Наименьшее увеличение наблюдалось при пятикратном введении пирацетама (группа Пир5). Контрольные группы (К1 и К5) не отличались между собой и с группой норма по количеству нейронов 4-го типа (табл. 4, рис. 7, 8).
При оценке суммарного количества нейронов 1-го, 2-го, 3-го и 4-го типов в среднем на одно поле зрения не было обнаружено статистически значимых отличий, как в опытных группах по сравнению с соответствующими контролями, так и при сравнении опытных и контрольных групп между собой. Суммарное количество дегенерирующих нейронов (сморщенных и отечных) также не менялось в опытных группах по сравнению с соответствующими контрольными. По общему количеству нейронов на единицу площади среза контрольные (К1 и К5) и опытные (Полі, Пол5 и Пир5) группы не отличались друг от друга, между собой и от группы норма (табл. 4, рис. 9).
