Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1 Глутаматергическая передача 10
1.2 Субъединичный состав и фармакологические свойства глутаматных рецепторов 13
1.3 Строение и функциональные свойства ионотропных глутаматных рецепторов
1.3.1 Доменная организация глутаматных рецепторов 18
1.3.2 Активация и десенситизация глутаматных рецепторов 19
1.3.3 Строение канала глутаматных рецепторов 28
1.3.4 Механизмы блокады НМДА и АМПА рецепторов 33
1.3.5 Потенциалозависимость блокады ионных каналов 38
Заключение 43
2. Методы исследования 45
3 Результаты
3.1 Выявление детерминант селективности и механизма действия каналоблокаторов глутаматных рецепторов
3.1.1 Общий подход 50
3.1.2 Сравнение анти-НМДА и анти-АМПА активности моно-и дикатионных соединений 50
3.1.3 Изучение механизмов блокады НМДА рецепторов 61
3.2 Применение избирательных каналоблокаторов 79
3.2.1 Фармакологический анализ субъединичного состава АМПА рецепторов основных и неосновных нейронов гиппокампа 80
3.2.2 Влияние ионов кальция на активность АМПА рецепторов 82
3.2.3 Характеристика протон-управляемых ионных каналов в нейронах различных структур мозга крысы 88
3.2.4 Использование избирательных каналоблокаторов как противосудорожных агентов 100
Обсуждение результатов103
Общее заключение 109
Выводы 112
Список литературы 113
- Субъединичный состав и фармакологические свойства глутаматных рецепторов
- Активация и десенситизация глутаматных рецепторов
- Сравнение анти-НМДА и анти-АМПА активности моно-и дикатионных соединений
- Влияние ионов кальция на активность АМПА рецепторов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Глутамат является основным возбуждающим медиатором в синапсах центральной нервной системы позвоночных (Collingridge & Singer, 1990; Nakanishi, 1992). Он опосредует свое прямое и быстрое действие, связываясь с рецепторами, представляющими управляемые им ионные каналы, и построенные из набора субъединиц (Dingledine et al., 1999). Деление семейства ионотропных глутаматных рецепторов на подтипы основано на их избирательной чувствительности к агонистам: АМПА, НМДА и каинату. Субъединичный состав рецепторов определяет фармакологические и физиологические свойства ионных каналов (Bochet et al., 1994;Yamakura et al., 1999).
Важнейшей характеристикой ионотропных глутаматных рецепторов, зависящей от субъединичного состава, является ионная избирательность. Например, НМДА рецепторы и рецепторы АМПА типа, не имеющие в своем составе субъединицу ГлуР2, формируют каналы, проницаемые для ионов кальция (Burnashev et al., 1995). Вход ионов кальция через эти каналы осуществляет запуск целого каскада метаболических процессов в клетке, который может приводить к изменению эффективности передачи в синапсе. Примерами ихменения эффективности передачи в синапсе являются долговременная потенциация и депрессия, рассматриваемые рядом авторов как элементарный коррелят обучения на молекулярном уровне (Holscher 1999; Muller et al., 2002). В то же время, чрезмерный вход кальция в клетку может приводить к ее гибели, что происходит при ишемии, гипоксии, нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера, Паркинсона (Mitchell et al.,1994; Pollard et al., 1994; Pellegrini-Giampietro et al., 1997; Yu et al., 1999).
Глутаматные рецепторы различаются также по чувствительности к действию модулирующих агентов. Так особенностью глутаматных рецепторов НМДА типа является их высокая чувствительность к блокирующему действию ионов Mg +. Показано, что блокирующий эффект ионов магния сильно зависит от потенциала, возрастая при гиперполяризации мембраны. Как следствие, в физиологических условиях функционирование НМДА рецепторов невозможно без предварительного снятия магниевого блока с помощью деполяризации (Nowak et al., 1984; Mayer etal., 1984). Это делает НМДА рецепторы вероятным кандидатом
'замыкателя' временной связи, когда для срабатывания рецептора требуется одновременная суммация разномодальных стимулов. Показано также модулирующее действие ионов Zn2+ (Mayer et al., 1989; Christine & Choi, 1990) и протонов (Tang et al., 1990; Viklicky et al., 1990; Gottfried & Chesler, 1994) на НМДА рецепторы. Таким образом, на активность НМДА рецепторов существенное влияние оказывает ионное окружение. Непотенциалозависимое угнетение активности АМПА рецепторов вызывают ионы Са2+ (Gu & Huang, 1991) и протоны (Christensen & Hida, 1990; Ihle & Patneau, 2000). Влияние на амплитуду ответов АМПА рецепторов было обнаружено также для ионов Zn2+ и Li+ (Rassendren et al., 1990; Karkanias & Papke, 1999а,б). Однако, механизмы модулирующего действия ионов на АМПА рецепторы изучены недостаточно.
Глутаматные рецепторы разных типов по-разному распространены в ЦНС и синапсах функционально отличных клеток одной структуры. Это может определять функциональные различия, например, основных и неосновных нейронов (McBain & Dingledine, 1993; Isa et al., 1996). В работах последних лет обнаружено, что даже один нейрон, получающий афферентные входы из разных источников, может иметь в этих синапсах глутаматные рецепторы с различным набором субъединиц (Toth & McBain, 1998). Таким образом нейрон способен дифференцировать синаптические входы от разных афферентных структур.
Различия функциональных свойств подтипов глутаматных рецепторов, а также гетерогенность их распространения в значительной степени обусловливают многообразие синаптических явлений при передаче быстрых возбуждающих сигналов. Это обосновывает необходимость поиска фармакологических агентов, способных избирательно модулировать глутаматные рецепторы разных типов и подтипов. Более того, поскольку целый ряд заболеваний сопровождается повышенным выбросом глутамата в тканевую жидкость, вещества, способные блокировать действие глутамата, являются нейропротективными агентами. Примером подобных веществ являются каналоблокаторы. Некоторые вещества этого типа уже находят свое применение в клинике при лечении целого ряда заболеваний, связанных с гиперактивацией глутаматных рецепторов (Parsons et al., 1999). Поиск новых, более избирательных и эффективных антагонистов является весьма актуальным. Непременным условием синтеза соединений с заданными свойствами является углубление знания, как о строении и функции самих
рецепторов, так и о молекулярных механизмах взаимодействия антагонистов с рецепторами. Одним из путей решения этой проблемы может служить анализ связи между строением и блокирующим действием веществ, способных блокировать открытые ионные каналы глутаматных рецепторов АМПА и НМДА типов.
Целью исследования было выявление особенностей строения каналоблокаторов глутаматных рецепторов, позволяющих им избирательно взаимодействовать с каналами рецепторов АМПА и НМДА типов, и использование блокаторов в качестве инструментов для выявления и характеристики глутаматных рецепторов разных подтипов в нейронах мозга крысы.
Конкретные задачи исследования. Настоящая работа была направлена на решение нескольких связанных между собой задач.
1. Сопоставление активности, строения и механизма действия гомологических
рядов блокаторов глутаматных рецепторов разных типов и разного
субъединичного состава. Это позволит выявить как структурные детерминанты
блокаторов, определяющих их избирательность, так и особенности молекулярной
организации ионных каналов глутаматных рецепторов, определяющих их
взаимодействие с каналоблокаторами.
2. Применить каналоблокаторы как фармакологические инструменты для
различения нейронов, изучения их функциональной значимости в нейронных
сетях. Появление наряду с известными морфологическими критериями
идентификации нейронов еще и фармакологических может помочь при
исследовании модулирующих влияний на глутаматные рецепторы,
экспрессированные в разных нейронах, а также для исследования других
функциональных особенностей конкретных нейронов.
3. Разработать рекомендации для направленного синтеза каналоблокаторов с
заданной селективностью и механизмом действия. Новые соединения,
эффективно и избирательно блокирующие ионные каналы глутаматных
рецепторов, могут найти применение при лечении ряда патологических состояний
ЦНС. Детальная характеристика механизмов блокады поможет пролить свет на
причины побочного действия каналоблокаторов и тем самым способствовать
синтезу соединений, у которых побочное действие отсутствует или сведено к минимуму.
Научная новизна. При использовании гомологических рядов каналоблокаторов ионотропных глутаматных рецепторов, были выявлены особенности строения блокаторов, определяющие их избирательность и механизм действия. Показано, что монокатионные производные самого разного строения активны лишь как блокаторы НМДА каналов. Напротив, дикатионные соединения активны как в отношении НМДА, так и в отношении АМПА рецепторов.
На основании полученных данных построены топографические модели строения сайтов связывания блокаторов в каналах АМПА и НМДА рецепторов. Для блокады ионных каналов глутаматных рецепторов необходимым является взаимодействие с гидрофобным и нуклеофильным участками канала, которые у АМПА рецепторов пространственно разнесены, а у НМДА рецепторов прилегают друг к другу. Обнаруженные нами детерминанты «ловушки» блокаторов НМДА каналов позволили сделать вывод о 2 сайтах связывания молекулы блокатора. Построенная модель взаимодействия каналоблокаторов с НМДА рецепторами, позволила объяснить механизм «ловушки» блокаторов и разрешить имеющиеся в литературе противоречия. Соотношение афинностей к двум сайтам определяет механизм действия блокатора и возможность его взаимодействия с воротным механизмом НМДА рецепторов. Увеличение афинности к поверхностному сайту, сопровождается уменьшением степени «ловушки» блокатора.
Полученные данные позволили выработать рекомендации для направленного синтеза блокаторов ионотропных глутаматных рецепторов с изначально заданной избирательностью. Показано, что данные вещества являются полезными инструментами для изучения свойств глутаматных рецепторов, характеристики нейронов разных типов, а также в качестве нейропротективных агентов в моделях агонист-вызванных судорог у животных.
Теоретическое и практическое значение работы. Знание особенностей строения каналоблокаторов рецепторов АМПА и НМДА типов, определяющих их избирательность и механизм действия, позволило выработать рекомендации для синтеза соединений с изначально заданными свойствами. Эти вещества были
применены для дальнейшего анализа свойств и специфики экспрессии АМПА рецепторов разного субъединичного состава. Показано также, что каналоблокаторы АМПА и НМДА рецепторов способны предотвращать судороги, вызванные введением агонистов глутаматных рецепторов. Таким образом, избирательные каналоблокаторы глутаматных рецепторов могут существенно дополнить арсенал лекарственных препаратов, используемых для предотвращения последствий нарушений глутаматергической передачи. Полученные данные имеют и общетеоретическое значение, поскольку позволяют объяснить особенности строения и функционирования каналов глутаматных рецепторов разных типов, построить топографические и молекулярные модели строения участков связывания каналоблокаторов.
Субъединичный состав и фармакологические свойства глутаматных рецепторов
Гипотеза о медиаторной роли дикарбоновых аминокислот была предложена в начале 60 годов Куртисом и Ваткинсом (Cheah & Watkins, 1965). Они изучали влияние на электрическую активность нейронов изолированного спинного мозга различных веществ. Наиболее сильный эффект в их экспериментах оказывали L-аспарагиновая, L-глутаминовая и L-цистеиновая аминокислоты.
В результате дальнейших экспериментов было установлено, что основным возбуждающим медиатором в синапсах центральной нервной системы позвоночных животных является глутамат, и для него выполняются все основные требования, необходимые для признания вещества медиатором. Определяющим феноменологическим признаком медиаторной роли глутамата послужило открытие для него специфических рецепторов.
В дальнейшем была показана различная региональная чувствительность нейронов мозга млекопитающих к деполяризующему действию кислых аминокислот (McLennan & Lodge, 1979). В частности, L-глутаминовая кислота значительно превосходила по возбуждающему эффекту L-аспарагиновую при подведении к интернейронам задних рогов спинного мозга, в то время как при тестировании этих аминокислот на клетках Реншоу передних рогов наблюдались противоположные результаты. Эти исследования позволили предположить существование двух типов рецепторов возбуждающих аминокислот - "аспартат-чувствительных" и "глутамат-чувствительных", что и послужило отправной точкой для поиска специфических агонистов и антагонистов этих рецепторов.
Решающую роль в этих поисках сыграло открытие антагонистического действия диэтилового эфира глутаминовой кислоты (ДЭЭГ) и D-2-аминоадиппиновой кислоты, блокирующих действие разных возбуждающих аминокислот с разной эффективностью, что и позволило разделить их рецепторы на два типа: НМДА и не-НМДА (Haldemann & McLennan, 1972). В результате дальнейших исследований с использованием радиолигандного связывания, методов электрофизиологии, молекулярной биологии было установлено существование 4 типов глутаматных рецепторов. Современная их классификация основана на различной чувствительности рецепторов к агонистам и соответственно названиям агонистов получили названия и глутаматные рецепторы. Среди 4 типов глутаматных рецепторов, 3 типа являются ионотропными и 1 - метаботропными. В первом случае, рецепторы являются управляемыми лигандом ионными каналами. В случае позвоночных - это катионный канал. У беспозвоночных глутаматные рецепторы могут формировать катионный или анионный канал и возможна регистрация как де-, так и гиперполяризующего действия при аппликации агонистов (Shinozaki, 1988). Метаботропные глутаматные рецепторы принадлежат к суперсемейству рецепторов, связанных с G-белком. По чувствительности к агонистам метаботропные глутаматные рецепторы делятся на три группы (Nakanishi, 1994). Первая группа обладает максимальным сродством к квисквалату и активирует через соответствующий G-белок фосфолипазу С. Вторая и третья группы наиболее чувствительны к t-ACPD и L-AP4 соответственно и уменьшают форсколинзависимое образование циклического АМФ (Wheal & Thomson, 1995). Соответственно и влияние этих рецепторов на ионную проводимость косвенное.
Ионотропные рецепторы глутамата очень разнообразны, как по составу входящих в них субъединиц, так и по свойствам формируемых ими ионных каналов. Так количество клонированных на настоящий момент субъединиц - 17. Для большинства субъединиц возможен альтернативный сплайсинг, редактирование, приводящее к изменению аминокислотной последовательности. Этим обусловливается разнообразие свойств формируемых ионных каналов.
Огромное разнообразие глутаматных рецепторов лежит в основе опосредования и тонкой настройки множества функций, осуществляемых с помощью глутаматергической передачи. На первый взгляд хаотичная комбинаторика субъединиц глутаматных рецепторов является четко управляемой системой. Так, например, благодаря особенностям заякоривания, взаимодействия субъединиц глутаматных рецепторов с белками, прилегающими к внутренней стороне мембраны (для обзора см. Malinov & Malenka, 2002), становятся возможными регуляция свойств формируемых каналов, их положение на мембране, синаптическое или экстрасинаптическое (Steigerwald et al., 2000). Показано, что при высокочастотной стимуляции афферентных входов в интернейрон, происходит смена функциональных свойств глутаматных рецепторов, опосредующих передачу в этих синапсах и вместо кальцийпроницаемых они становятся непроницаемыми для ионов кальция (Liu & Cull-Candy, 2000; Liu & Cull-Candy, 2002). На молекулярном уровне это объясняется началом экспрессии субъединицы ГлуР2, что меняет свойства рецептора.
Десенситизация, возникающая после срабатывания рецептора, также является объектом регуляции. Так ионы кальция, входящие через НМДА рецепторы или через АМПА рецепторы, в состав которых не входит субъединица ГлуР2, приводят к десенситизации соответственно АМПА или НМДА рецепторов. В дальнейшем было показано, что источником входящих ионов кальция могут быть и другие проницаемые для кальция каналы, потенциалозависимые или аденозиновые Р2Х типа (Pankratov et al., 2002). В последнем примере, аденозиновые рецепторы регулируют вовлеченность НМДА рецепторов в синаптическую передачу и вероятность возникновения долговременной потенциации в данном синапсе.
Чрезмерная активация глутаматных рецепторов может иметь катастрофические последствия. Огромное количество заболеваний является следствием цитотоксичности, опосредуемой через глутаматные рецепторы. Сюда относятся болезни Паркинсона, Альцгеймера, судорожный синдром, включая эпилепсию, гипоксии различного происхождения (Lee et al., 1999).
В заключение следует отметить, что рецепция глутамата возникла еще до дивергенции растений и животных (Lam et al., 1998; Chiu et al., 1999) и используется живыми организмами для межклеточных коммуникаций. Рецепторы глутамата описаны и показана их роль при остеогенезе (Dobson & Skerry, 2000; Taylor et al., 2000), развитии мегакариоцитов (Franconi, 2000) и кератиноцитов (Genever et al., 1999), во множестве других тканей (см. обзор Skerry & Genever, 2001). Агонисты АМПА рецепторов приводят к усилению секреции инсулина бета-клетками пожделудочной железы (Bertrand et al., 1992; Weather et al., 1996). Недавно управляемый глутаматом калиевый канал был обнаружен у бактерий (Chenetal., 1999).
Активация и десенситизация глутаматных рецепторов
Обнаружено, что N-концевой домен имеет гомологию с бактериальным Leu/Ile/Val-связываюшим белком ЛИВСБ (O Hara et al., 1993). Установлено, что данный участок субъединиц НР-2 определяет свойства глицин-независимой десенситизации НМДА рецепторов (Krupp et al., 1998), а также определяет связывание множества модуляторов НМДА рецепторов, таких как Zn2+, ифенпродил (Choi & Lipton, 1999; Perin-Dureau et al., 2002). Как было сказано выше, в случае АМПА и каинатных рецепторов, данный домен является одним из определяющих при сборке функциональных рецепторов. Данный домен не обнаружен в составе каинат-связывающих белков карпа, лягушки, цыпленка (Wada et al., 1989; Gregor et al., 1989; Wo & Oswaki, 1994).
Агонист-связывающий домен состоит из 2 частей (см. рис. 2). Показано, что он гомологичен глутамин-связывающему белку бактерий ГСБ (Nakanishi et al., 1990; Hsiao, et al., 1996). Прорывом на пути изучения активации глутаматных рецепторов было создание химерных конструкций, в которых агонист-связывающий участок отрезан от остальной части рецептора (Kuusinen et al., 1995; Chen & Gouaux, 1997). Данный белок утрачивает связь с мембраной, но при этом связывает глутамат с высоким сродством и селективностью. Следствием растворимости химерного белка является возможность его кристаллизации и проведения ренгеноструктурного анализа. Знание молекулярных основ избирательности и механизмов активации глутаматных рецепторов стало возможно именно после получения кристаллов химерных белков. Так было показано, что для связывания агониста глутаматным рецепторам достаточно одной субъединицы, в отличие от н-холинорецепторов, где агонист-распознающий домен формируется аминокислотным последовательностями разных субъединиц. Из аналогии с семейством бактериальных белков, связывающих пептиды периплазматической жидкости (куда относятся ГСБ и ЛИВСБ) а также из сопоставления структур кристаллов, связавщих разные агонисты и антагонисты стали ясны молекулярные механизмы активации глутаматных рецепторов (Armstrong & Gouaux, 2000). Оказалось, что связывание молекулы агониста с химерами АМПА рецепторов приводит к уменьшению просвета между участками SI HS2(PHC. 3).
Более того, было показано (Armstrong & Gouaux, 2000), что степень схлопывания участков S1 и S2 сильнее для полных агонистов, например, глутамата, чем для частичных агонистов, таких как каинат или АМПА. Наконец, было показано, что связывание конкурентного антагониста АМПА рецепторов CNQX стабилизировало конформацию, при которой участки S1 и S2 максимально разделены, как в случае нативной конформации рецептора, не связавщего агониста.
В дальнейшем были выявлены конкретные аминокислотные остатки, ответственные за связывание агонистов. Изменяя некоторые из них, можно изменить направление действия препарата, и конкурентный антагонист становится агонистом (Taverna et al., 2000).
Механизм, сопрягающий связывание агониста и открытие ионного канала до сих пор остается слабо изученым. Механистическая модель, объясняющая подобное сопряжение основана на сопоставлении данных, полученных с помощью ренгеноструктурного анализа открытого и закрытого калиевых каналов (Armet al., 1998; Arm & Gouaux, 2000; Sun et al., 2002). При открытии ионного канала происходит излом альфа спирали в участке, прилежащем с внеклеточной стороны к сегменту ТМЗ. Глутаматные рецепторы в этом месте имеют очень консервативный домен, состоящий из 9 аминокислотных остатков SYTANLAAF. Замена аланина в 8 положении на треонин обнаружена в 8г глутаматных рецепторах так называемых «люршеровских мышей» (Zhou et al., 1997). В то время как 2 субъединица у мышей дикого типа не образует функционирующих глутаматных рецепторов при экспрессии в гетерологических системах, &2 субъединица «люршеровских мышей» формирует конститутивно активный канал, что приводит к нейродегенерации. Мутация аланина в 8 положении в НМДА рецепторах уменьшала скорость десенситизации и деактивации мутантных рецепторов (Kohda et al., 2000; Jones et al., 2002). Интересно отметить, что эта мутация в субъединицах ГлуРІ и ГлуРб приводила к тому, что формируемый данной субъединицей ионный канал, становился спонтанно активным. Замена треонина в 3 положении на аланин или серии приводила к конститутивной активации НМДА рецепторов, происходящей даже в отсутствие агониста (Kashivagi et al., 2002).
Сравнение анти-НМДА и анти-АМПА активности моно-и дикатионных соединений
Наличие большого числа каналоблокаторов НМДА рецепторов обусловливает разнообразие механизмов блокады. Действие большинства блокаторов может быть кинетически описано схемами 1 и 2 (см. раздел 1.3.4). Как можно заметить, схема 2 включает в себя схему 1. Согласно данной схеме, блокатор может покидать заблокированный канал по последовательной модели (схема 1), не взаимодействуя с воротным механизмом канала, и накапливаться в закрытых каналах (феномен «ловушки» блокатора). Альтернативные механизмы деблокады каналов обусловливают наличие так называемой «частичной ловушки» блокатора (Blanpied et al., 1997). Соотношение скоростей отмыва по двум альтернативным путям определяет степень ловушки для данного блокатора. Интересным представляется выявление особенностей строения блокаторов, определяющих механизм их действия.
Так в работе Соболевского с соавт. (Sobolevsky et al., 1999) было показано, что увеличение размеров гидрофобной группировки в гомологическом ряду тетраалкиламмониевых соединений приводит к уменьшению выраженности «ловушки». Феномен «ловушки», в данном случае, легко объясним с позиций стерического взаимодействия молекулы блокатора с воротным механизмом канала. Однако, анализ молекулярных моделей значительного числа блокаторов канала НМДА рецептора, проведенный в нашей лаборатории Д.Б.Тихоновым, показал, что на самом деле не существует корреляции между размерами всех известных блокаторов и выраженностью «ловушки». Так сравнимые по величине МК-801 и аминоакридин являются крайними выражениями блокатора с выраженной «ловушкой» и блокатора, для которого «ловушка» отсутствует.
К сожалению, прямые данные, описывающие топологию каналов глутаматных рецепторов, в настоящий момент отсутствуют. Гомология семейства глутаматных рецепторов и калиевых каналов является предпосылкой для гомологического моделирования и перенесения знаний полученных при изучении калиевых каналов. К настоящему времени установлены структуры открытой и закрытой конформаций калиевых каналов, из которых видно положение воротного механизма канала, а также изменения, происходящие при его открытии. Перенос, полученных на калиевых каналах данных на каналы глутаматных рецепторов, позволяет предполагать, что участком связывания каналоблокаторов является достаточно протяженная полость, разделяющая участок селективного фильтра и воротный механизм. В данной полости свободно помещаются большинство известных блокаторов НМДА каналов (рис. 13). et al., 2002), находятся в противоречии с приведенной моделью. По данным Соболевского с соавт., аминокислотные остатки, находящиеся в районе селективного фильтра, оказываются доступными для сульфгидрильных реагентов в равной степени в открытых и закрытых каналах, что может трактоваться как свидетельство более глубокого, чем селективный фильтр расположения воротного механизма. Для разрешения имеющихся противоречий мы провели изучение механизмов «ловушки» в рядах гомологических соединений.
Все изученные производные фенилциклогексила вызывали угнетение активности НМДА рецепторов, зависящее от концентрации блокатора и потенциала фиксации. Самым сильным блокирующим действием обладали ИЭМ=1921 и ИЭМ=1925, IC50 = 0,6 mkM и 0,8 мкМ соответственно, самым слабым - ИЭМ- 2044, IC50 = 143 mkM (рис. 14). Следует отметить, что корреляция между блокирующей активностью и числом метиленовых групп между атомом азота и фенилциклогексильной группировкой в ряду монокатионных соединений отсутствует. В то же время добавление этильных заместителей при концевом атоме азота приводило к сильному падению активности дикатионных производных фенилциклогексила.
Для выяснения причины подобных изменений активности каналоблокаторов мы изучили потенциалозависимость блокады НМДА рецепторов (рис. 14).
Наклон кривых зависимости IC50 от мембранного потенциала не отличается для изученных монокатионных соединений, 8 = 0.3±0.1 (п=7), 0.4±0.1 (п=5) и 0.4+0. (n=6) для ИЭМ-1921, 2014 и 2044 соответственно. 5 для дикатионного производного фенилциклогексила ИЭМ-1925 отличается от таковой для монокатионов, zS = 1.1±0.1 (п=6). (рис. 14). Напомним, что данная величина характеризует долю поля, которую проходит молекула блокатора на пути к сайту связывания. Превышение величины 5 для ИЭМ-1925 по сравнению с его монокатионным аналогом ИЭМ-1921 говорит о преимущественной ориентации блокаторов заряженным заместителем вниз, т.е. ближе к внутриклеточной части канала. По всей видимости, молекула блокатора связывается прилежащим к гидрофобной группировке фенилциклогексила атомом азота с глутамином N/Q/R сайта (Tikhonov et al., 1999; Bolshakov et al, 2000). Практически полное отсутствие зависимости блокирующей активности ИЭМ-2041 от мембранного потенциала (, z8 = 0.2±0.1, п=6) позволяет заключить, что тетраэтильный заместитель является слишком большим для прохождения через N/Q/R сайт. Тетраэтиламмониевый заместитель в данном случае взаимодействует с глутамином N/Q/R сайта, а оставшаяся часть молекулы блокатора направлена в сторону вестибюля ионного канала.
Влияние ионов кальция на активность АМПА рецепторов
Итак, в результате экспериментов, описанных в 1 части работы, нами были установлены детерминанты селективности каналоблокаторов глутаматных рецепторов разных типов и подтипов. Использование данных веществ как инструментов делает возможным изучение субъединичного состава глутаматных рецепторов различных типов нейронов. Наибольшей избирательностью по отношению к субъединичному составу АМПА рецепторов оказались ИЭМ-1460 и ИЭМ-1749. Различие чувствительности АМПА рецепторов, содержащих и несодержащих в своем составе субъединицу ГлуР2, составляет около 3 порядков. С помощью ИЭМ-1460 в работах нашей лаборатории были прокартированы нейроны разных мозговых структур крысы (Buldakova et al., 1999). Было выявлено, что наибольшей чувствительностью к действию ИЭМ-1460 обладают гигантские интернейроны стриатума, популяция интернейронов гиппокампа. Крайне слабой чувствительностью к действию ИЭМ-1460 обладали пирамидные нейроны гиппокампа. Обнаружны также нейроны с промежуточной чувствительностью к блокирующему действию ИЭМ-1460. Ими оказались, например, мотонейроны n.hypoglossum (Essin et al., 2002). Таким образом, АМПА рецепторы разных типов нейронов различаются между собой по количеству рецепторов, в состав которых входит субъединица ГлуР2, а ИЭМ-1460 может быть использован как инструмент для выявления субъединичного состава АМПА рецепторов. Поскольку субъединичный состав АМПА рецепторов разных типов нейронов различен, то избирательные каналоблокаторы могут быть использованы в дополнение к другим критериям как инструменты для выявления разных типов нейронов. Мы использовали ИЭМ-1460 для фармакологической идентификации пирамидных и непирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа, нейронов зубчатой фасции гиппокампа и нейронов других структур мозга с целью дальнейшей характеристики их АМПА рецепторов и выявления различий в экспрессии ионных каналов другой природы разными типами нейронов.
В опытах на изолированных нейронах поля СА1 гиппокампа и зубчатой фасции изучались субъединичный состав и представленность сплайс вариантов субъединиц АМПА рецепторов. Наличие в составе рецепторов субъединицы ГлуР2 проявлялось в резком снижении активности селективного каналоблокатора ИЭМ-1460. Представленность флип версий субъединиц оценивалась с помощью циклотиазида. АМПА рецепторы основных клеток (пирамидных в случае поля СА1 и гранулярных в случае зубчатой фасции) проявляли низкую чувствительность к ИЭМ-1460, в то время как АМПА рецепторы неосновных клеток (интернейронов) - высокую или промежуточную чувствительность (рис. 24). Достоверно больший потенцирующий эффект наблюдался при действии циклотиазида на основные клетки обеих структур по сравнению с интернейронами (рис. 24). Таким образом, существует корреляция между чувствительностью нейронов гиппокампа к ИЭМ-1460 и циклотиазиду. Основные клетки обеих структур экспрессируют в составе своих АМПА рецепторов большее количество субъединицы ГлуР2, в них больше представлены флип версии субъединиц по сравнению с неосновными клетками, в которых субъединица ГлуР2 практически отсутствует и преобладают флоп версии. Очевидно, это отражает особенности функционирования разных типов нейронов.
Кроме блокады ионного канала существует значительное число механизмов модуляции активности глутаматных рецепторов. Например, возможна модуляция десенситизации глутаматных рецепторов. Таким образом можно регулировать соотношение проводящих и непроводящих ионных каналов. Открытым остается вопрос об отличиях путей модуляции АМПА рецепторов нейронов разных типов. Для достоверной идентификации типа нейрона, особенно в структурах, где количество нейрональных типов велико, применения только морфологического критерия для идентификации нейронов оказывается недостаточным. В этом случае каналоблокаторы могут быть применены в качестве дополнительного к морфологическому критерия идентификации. Использование каналоблокаторов
АМПА рецепторов позволяет одноременно ответить на вопрос о зависимости путей и механизмов модуляции АМПА рецепторов от их субъединичного состава.
Известно, что ионная среда во многом определяет активность НМДА рецепторов. Классическим примером является угнетение НМДА рецепторов ионами Mg2+ (Nowak et al., 1984, Mayer et al., 1984). Ионы магния в данном случае действуют по механизму блокады открытого ионного канала, их эффект сильно зависит от потенциала, возрастая при гиперполяризации. Физиологическим последствием чувствительности НМДА рецепторов к ионам Mg2+ является необходимость одновременной деполяризации мембраны и аппликации агониста для активации рецепторов. Это свойство обеспечивает НМДА рецепторам способность эффективного участия в опосредовании процессов синаптической пластичности.
Хорошо изучено модулирующее действие ионов Zn+ и протонов на НМДА рецепторы. Они вызывают непотенциалозависимое угнетение этих рецепторов, связываясь с остатками гистидина в домене, гомологичном ПСБ бактерий.
