Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
1.1 Ионный канал никотинового холинорецептора
1.1.1 Общая структура рецептора 12
1.1.2 Неконкурентные ингибиторы холинорецепторов и строение ионного канала 14
1.1.3 Моделирование связывания блокаторов: излом каналообразующих спиралей 18
1.1.4 Проблема активации канала 20
1.2 Ионотропные рецепторы глутамата
1.2.1 К какому семейству принадлежат ионные каналы рецепторов глутамата? 23
1.2.2 Происхождение и молекулярная эволюция рецепторов глутамата 25
1.2.3 Подтипы и субъединицы глутаматных рецепторов 27
1.2.4 Рецепторы глутамата в норме и патологии 28
1.2.5 Строение узнающего участка глутаматных рецепторов и его лиганды 31
1.2.6 Рентгеновские структуры калиевых каналов 33
1.2.7 Ионные каналы глутаматных рецепторов и их блокаторы 39
Заключение 43
2 Методика
2.1 Расчет энергетически оптимальных конформеров методами молекулярной механики
2.2 Гомологическое моделирование и системы ограничителей 46
2.3 Анализ лиганд-рецепторного взаимодействия 48
2.4 Программное обеспечение 50
2.5 Химико-фармакологический подход 52
2.6 Экспериментальный анализ действия блокаторов 54
3 Результаты и их обсуждение
3.1 Ионный канал никотинового холинорецептора
3.1.1 Активация и блокада никотиновых холинорецепторов дикатионными производными адамантана 58
3.1.2 Блокада открытого и закрытого канала холинорецептора филантотоксинами 63
3.1.3 Пространственное строение филантотоксинов: внутримолекулярные водородные связи 67
3.1.4 Построение модели ионного канала никотинового холинорецептора 71
3.1.5 Моделирование связывания филантотоксинов: блокада открытого канала 75
3.1.6 Моделирование связывания филантотоксинов: блокада закрытого канала 79
3.1.7 Модель активации канала никотинового холинорецептора 82
3.1.8 Заключение 86
3.2 Каналы глутаматных рецепторов
3.2.1 Циклическая организация селективного фильтра 90
3.2.2 Детерминанты блокады AMP А рецепторов 93
3.2.3 Детерминанты блокады глутаматных рецепторов насекомых филантотоксинами 103
3.2.4 Модель вкутримембранной петли ионного канала АМРА рецептора 108
3.2.5 Моделирование связывания блокаторов в ионном канале АМРА рецептора 111
3.2.6 Кинетика блокады АМРА рецепторов дикатионными соединениями 115
3.2.7 Детерминанты блокады каналов NMDA рецепторов - эффект ловушки 120
3.2.8 Исследование детерминант ловушки блокаторов в NMDA канале 125
3.2.9 Применение блокаторов для сравнительного анализа каналов глутаматных рецепторов позвоночных и беспозвоночных 130
3.2.10 Заключение 135
Общее заключение 138
Выводы 141
Список публикаций 143
Литература 145
- Неконкурентные ингибиторы холинорецепторов и строение ионного канала
- Рентгеновские структуры калиевых каналов
- Активация и блокада никотиновых холинорецепторов дикатионными производными адамантана
- Построение модели ионного канала никотинового холинорецептора
Введение к работе
Актуальность проблемы. Каналообразующие белки, обеспечивающие пассивный транспорт ионов, являются важными компонентами клеточных мембран. Активность потенциалуправляемых натриевых и калиевых каналов обуславливает генерацию и распространение потенциала действия в нейронах. Синаптические ионные каналы, активируемые нейромедиаторами, необходимы для передачи возбуждающих и тормозных сигналов между нейронами. Многие модуляторы клеточного метаболизма также оказывают свое действие через ионные каналы. Поскольку каналообразующие белки являются трансмембранными, их внеклеточные участки и сама пора канала доступны для действия внеклеточпых химических агентов, как естественных, так и искусственных. Многие яды и токсины, такие как тетродотоксин, аконитиновые алкалоиды, аргиотоксин и филантотоксин, действуют именно на ионные каналы. С другой стороны, ряд лекарственных препаратов, например местные анестетики, антиаритмические агенты, мемантин и др. также модифицируют работу ионных каналов. Поэтому, исследования, направленные на изучения строения и механизмов модуляции ионных каналов, имеют не только фундаментальное, но и практическое значение.
В то же время, представления о трехмерном строении и механизмах действия ионных каналов продолжают оставаться достаточно фрагментарными, несмотря на большое число исследований. Одна из проблем состоит в том, что, как и большинство мембранных белков, молекулы ионных каналов плохо поддаются кристаллизации. До сих пор было кристаллизовано только несколько структур, в основном калиевых каналов прокариот (Doyle et al., 1998; Jiang et al., 2002; 2003). Эти работы, выполненные в лаборатории Р. МакКиннона в 1998 - 2003 годах, были в 2003 удостоены Нобелевской премии. Однако, получение рентгеноструктурных данных для ионных каналов эукариот, имеющих более сложную трансмембранную топологию и гегеромерное субьединичное строение, остается нерешенной проблемой. Таким образом, развитие методов по анализу строения ионных каналов и действия на них лигандов, представляют значительную ценность.
Цели и задачи исследования. Фундаментальной научной проблемой, решавшейся в рамках данной работы, было создание и применение комплексного подхода к исследованию строения ионных каналов и их взаимодействия с каналоблокагорами. Относительная простота и предсказуемость пространственной структуры
низкомолекулярных лигандов делает их ;-Ч&НВДЕ№9МЯЛ МЙВДЇ5І'ІЯРНЬІМИ пробами
С Петербург OS »0 мт
структуры каналов. Особенно важно то, что структурно-функциональные исследования в рядах блокаторов позволяют получить количественные оценки элементов топографии участков их связывания. Суть разрабатываемого подхода заключается в том, что для изучения-конкретных особенностей строения каналов синтезировались специально разработанные гомологические ряды соединений, и полученные данные использовались для построения молекулярных моделей. Выбор ионотропных рецепторов ацетилхолина и глугамата в качестве объектов исследования был обусловлен тем, что они формируют катион-селективные каналы, которые демонстрируют сходные физиологические и фармакологические характеристики при принципиально разной структурной организации.
В рамках работы решались следующие конкретные задачи:
Исследовать механизмы биологического действия неконкурентных ингибиторов никотиновых холинорецепторов - филангогоксинов и дикатионных соединений.
Рассчитать пространственные структуры филангогоксинов и разработать молекулярную модель ионного канала холинорецептора, способную воспроизводить наблюдаемые в эксперименте закономерности блокирующего действия,
На основании данньж по действию блокаторов на открытое и закрытое состояние холинорецептора разработать модель его активации.
Выявить структурные детерминанты селективного действия блокаторов на глугаматный рецептор NMDA типа и разработать модель селективного фильтра NMDA канала, обясняющую наблюдаемые различия.
С помощью гомологических рядов блокаторов определить основные структурные требования для блокаторов глугаматньж каналов АМРА типа.
Разработать модель канала АМРА рецептора и выявить аминокислотные остатки, определяющие действие блокаторов.
Использовать полученные результаты для анализа строения ионньж каналов беспозвоночных, субъединичное строение которьж неизвестно.
Научная новизна. В результате проведенньж физиологических, фармакологических и модельньж исследований определены места и характер связывания блокаторов ионньж каналов никотинового холинорецептора и ионотропных глугаматньж рецепторов.
Созданы и протестированы молекулярные модели каналов, позволяющие теоретически предсказывать характер действия потенциальных блокаторов.
Впервые показано, что пространственная структура филантогоксинов определяется замыканием внутримолекулярных водородных связей. В зависимости от характера замыкания этих связей сильно меняется пространственная геометрия и, как следствие, биологическое действие токсинов (Tikhonov et al., 200а).
Предложена модель активации канала холинорецептора, в которой копформационный переход между открытым и закрытым состояниями происходит за счет локальной перестройки в гибком участке излома каналообразующих сегментов. При этом полного сгерического перекрывания просвета канала в закрытом состоянии не наблюдается, а энергетический барьер для токонесущих ионов имеет гидрофобную природу (Tikhonov andZhorov, 1998 Tikhonov etal., 2004а).
Впервые было дано объяснение различию диаметров каналов NMDA и АМРА подтипов глутаматных рецепторов, а также слабой чувствительности АМРА каналов к активным блокагорам NMDAканалов (Tikhonovetal., 1999; 2002).
Разработаны принципы теоретического дизайна блокаторов АМРА каналов. Созданы серии соединений, варьирующих по активности и избирательности действия на NMDA и АМРА каналы. Таким образом, решена проблема отсутствия фармакологических препаратов неконкурентного действия для избирательного подавления АМРА рецепторов (Магазаникидр., 2000; 2001; Tikhonov etal, 2000b; BolshakovetaL, 2000).
Впервые было- показано, что эффект «ловушки»' блокаторов в NMDA каналах определяется не их стерическими размерами, а соотношением сродства к двум различным местам связывания (Bolshakov et al.; 2002).
Научно-практическая значимость работы. Ряд патологических состояний ЦНС сопровождается нарушением синаптической передачи. Поскольку большинство возбуждающих синапсов ЦНС позвоночньж являются глутаматергическими, избирательные модуляторы разньж подтипов глутаматных рецепторов являются потенциально ценными терапевтическими агентами. Развитие представлений о
детерминантах селективного действия блокагоров способствует прогрессу в создании новых лекарственных средств. Наличие эффекта «ловушки», т.е. способности блокагора оставаться в канале после его закрытия, определяет кинетику действия. Блокаторы, для которых этот эффект ярко выражен, демонстрируют медленную кинетику, и их использование приводит в ряде случаев к негативным побочным эффектам. Полученные результаты о молекулярном механизме «ловушки» представляются ценными для разработки препаратов антиглутаматного действия, имеющих минимальное побочное действие. Избирательно действующие блокаторы часто применяются в физиологических экспериментах для выделения отдельных компонентов ответов на раздражение. Можно полагать, что разработанные серии блокагоров будут использоваться в новых научных экспериментах. Разработанные структуры блокагоров, а гаже принципы направленного синтеза блокагоров с заданной активностью, селективностью и кинетикой действия, могут оказаться перспективными с точки зрения использования в медицинской практике для терапии патологических состояний ЦНС, связанных с нарушением баланса глугамагергической передачи. Результаты исследований включены в курсы лекций по нейрофизиологии в Санкт-Петербургском Государственном Университете и в Санкт-Петербургском Государственном Техническом Университете.
Положения, выносимые на защиту:
В никотиновом холинорецепторе эффекторная часть воротного механизма) расположена в средней части ионного канала. Управление проницаемостью канала осуществляется за счет гидрофобного, а не сгерического механизма. Сайты связывания блокагоров открытого и закрытого канала расположены в канале по обе стороны воротного механизма.
Пространственная организация ионных каналов NMDA и АМРА подтипов рецепторов глутамата гомологична калиевым каналам. Специфические фармакологические и физиологические характеристики глугаматных рецепторов определяются локальными особенностями строения наиболее узких частей (селективных фильтров) этих каналов.
Ионные каналы глугаматных рецепторов нейронов моллюска и мышцы личинки мухи по строению «селективных фильтров» близки к АМРА, но не к NMDA каналам позвоночных.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на ряде научных конференций, в том числе: ХХХШ международном конгрессе по физиологии (Санкт-Петербург, 1997); съездах международного общества нейрохимии (Санкт-Петербург, 1998; Берлин, 1999; Буэнос-Айрес, 2001); съездах международного общества нейронаук (Новый Орлеан, 2000; Сан-Диего, 2001); симпозиумах Британского общества физиологии (Лондон, 2001; 2002; Кембридж, 2003); II съезде биофизиков России (Москва, 1999); XVIII съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Казань, 2001); XII международном совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2001). В 2003 году по приглашению оргкомитета съезда Британского общества токсикологии был сделан пленарный доклад о моделировании связывания лигандов в ионных каналах. Серии работ по экспериментальному и модельному исследованию строения ионных каналов холинорецепторов и глутаматных рецепторов была присуждена медаль РАН для молодых ученых 2000г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 44 научных работы, в том числе 20 статей (из них 16 в рецензируемых международных журналах) и 24 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 176 стр., состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, двух глав результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 220 источников. Работа иллюстрирована 65 рисунками и 6 таблицами.
Неконкурентные ингибиторы холинорецепторов и строение ионного канала
Треониновое кольцо также влияет на проницаемость канала, однако механизм этого влияния не электростатический, а стерический. Например, при замене остатков треонина на глицин увеличивается относительная проницаемость канала для катионов большего размера. Предполагается поэтому, что треониновое кольцо формирует наиболее узкую часть канала (Hucho and Hilgenfeld, 1989; Imoto et al., 1991; Villarroel et al., 1991; Villarroel and Sakmann, 1992). Сериновое кольцо является центром связывания большинства каналоблокаторов. Наиболее известными являются работы лаборатории Г. Лестера по блокаде канала холинорецептора QX-222 (Leonard et al., 1988; Charnet et al., 1990), лаборатории Шанже по связыванию хлорпромазина (Revah et al., 1990) (рис. 2A) и лаборатории Хухо по связыванию трифенилметилфосфония (Hucho et al., 1986). Экваториальное кольцо также участвует в связывании блокаторов. Однако, в отличие от мутаций в сериновом кольце, уменьшение гидрофобности экваториального кольца приводит к падению блокирующей активности (Charnet et al., 1990). Общепринятой является модель связывания, в которой заряженные группы блокаторов взаимодействуют с полярными боковыми цепями в сериновом кольце, а гидрофобные ядра связываются с экваториальным кольцом.
Данные о взаимодействии каналоблокаторов с никотиновыми холинорецепторами свидетельствуют о воронкообразной структуре канала, сужающейся к врутриклеточной стороне. Наименьшие размеры имеет треониновое кольцо, расположенное глубоко в канале. Исходя из размеров наибольших органических катионов, проникающих через канал холинорецептора, его минимальное сечение было определено как 6.5 х 6.5 A (Dwyer et al., 1980; Nutter and Adams, 1995). Поскольку мутации в треониновом кольце не влияют на связывание QX-222, а мутации в сериновом влияют, молекула QX-222, имеющая размер порядка 8 А, очевидно не может пройти сквозь сериновое кольцо. Все более наружные кольца имеют значительно больший размер, так как молекулы разных блокаторов, в том числе размером порядка 11 А, свободно достигают серинового кольца в открытом канале.
Для обеспечения воронкообразной структуры канала, М2 спирали должны иметь радиальный наклон, то есть расходиться на внеклеточной стороне (Furois-Corbin and Pullman, 1989). Тогда в этой области между М2 спиралями образуется пространство, которое должно быть заполнено другими сегментами рецептора. Действительно, ряд данных свидетельствует о вовлеченности N-концов Ml сегментов во взаимодействие с блокаторами (DiPaola et al., 1990). Кроме того, остатки N-концов Ml сегментов метятся при цистеиновом катрировании (Akabas and Karlin, 1995).
Дикатионные блокаторы, производные пентаметония и гексаметония, являются каналоблокаторами никотиновых холинорецепторов (Ascher et al., 1978; Луко мекая и Гмиро, 1982). Анализ структурно-функциональных отношений в рядах этих блокаторов показал, что активность соединений этого типа зависит от структуры обеих катионных головок и от расстояния между ними (Лукомская и Гмиро, 1982; Zhorov et al., 1991). Наибольшей блокирующей активностью обладают производные пентаметония, у которых размеры катионных головок существенно различаются. Был сделан вывод о том, что дикатионные блокаторы связываются в канале с двумя нукпеофильными кольцами, причем размеры этих сужений различны. Для анализа связи между конформационными характеристиками дикатионных соединений и их блокирующей активностью были использованы методы молекулярной механики. Оказалось, что наилучшее соответствие с экспериментальными данными достигается, если принять размеры сечений канала на уровне серинового и треонинового колец равными 6.1 х 8.3 А и 5.5 х 6.4 A (Zhorovet al, 1991; Brovtsyna et al., 1996).
Следующим логическим шагом было создание молекулярной модели канала холинорецептора. Для этого было необходимо привлечь дополнительные данные, существенно расширить набор блокаторов. Решающее значение для формирования рабочей гипотезы имело сравнение рассчитанных трехмерных структур двух классических блокаторов холинорецепторов - QX-222 и хлорпромазина. Согласно экспериментальным данным, оба соединения эффективно взаимодействуют с сериновым кольцом, и слабо взаимодействуют с лежащим глубже треониновым кольцом (Leonard et al,, 1988; Charnet et al., 1990; Revah et al., 1990). Вероятно, оба они свободно достигают серинового кольца, но на его уровне встречают стерическое препятствие, не позволяющее молекуле проникнуть глубже. Однако размер гидрофобных ядер хлорпромазина и трифенилметилфосфония, который также связывается с сериновым кольцом (Hucho et al., 1986), значительно больше, чем у QX-222. Очевидно, что выше серинового кольца канал должен быть шире, чем молекула хлорпромазина, а ниже - уже, чем QX-222. Это возможно только при очень большом наклоне каналообразующих сегментов.
Попытка собрать модель, удовлетворяющую всем заданным условиям, из линейных М2 спиралей не удалась. В С-концевой части М2 сегментов внутрь поры канала смотрят Экваториальное кольцо, Валиновое кольцо и Внешнее лейциновое кольцо. Находящиеся в этих кольцах остатки значительно крупнее стерически, чем остатки треонина и серина, смотрящие в пору канала в его цитоплазматической части. Поэтому, даже чтобы создать модель с цилиндрической порой, необходимо придать осям спирали наклон. При нужном угле наклона спиралей либо сериновое кольцо оказывается неприемлемо широким, либо треониновое кольцо - неприемлемо узким.
Рентгеновские структуры калиевых каналов
До конца 90х годов о строении узнающего участка имелись только косвенные сведения. Тем не менее, важные структурные детерминанты связывания агонистов глутаматных рецепторов и конкурентных антагонистов были выявлены при использовании химико-фармакологического подхода (Donevan an Rogawski, 1998; Ebert et al., 1994; Johansen et al, 1994; Wahl et al., 1996). Путем направленного мутагенеза были выявлены некоторые аминокислоты, критичные для связывания (Laube et al., 1997; Swanson et al., 1997; Мало et al., 1996). Гомология лиганд-связывающих доменов SI и S2 и бактериальных аминокислот-связывающих белков позволила предположить сходство их трехмерного строения. Поскольку для последних имелись данные рентгеноструктурного анализа (Hsiao et al., 1994), общий механизм связывания тоже был известен. Однако настоящий прорыв оказался связан с возможностью кристаллизации лиганд-связывающего центра АМРА рецептора (Armet al., 1998). Так как полностью кристаллизовать АМРА рецептор в данное время невозможно, жирорастворимый каналообразующий домен был заменен коротким пептидным фрагментом. В этих условиях S1 и S2 домены удалось кристаллизовать. В дальнейшем были получены структуры комплексов с рядом важнейших лигандов, как агонистов, так и антагонистов (Arm and Gouaux, 2000; Mayer et al., 2001; Hogner et al., 2002; 2003) (Рис. 6).
Домены SI и S2 образуют две примерно равные по размеру глобулярные доли. При этом каждый из доменов участвует в формировании обеих долей. Между долями находится щель, в которой собственно и происходит связывание. При этом лиганд образует ряд специфических контактов с обеими долями и стягивает их друг к другу (Рис. 6Ж, 3). Практически все активные группы лигандов играют существенную роль. Стягивание долей лиганд-связывающего центра определяет переход из свободной развернутой конформации в активную свернутую конформацию. В свернутой конформации между долями образуются дополнительные контакты, не опосредованные лигандом, например между остатками Е402 и Т686. Важной структурной характеристикой лиганд-связывающего центра является то, что при переходе к свернутой конформации комплекса конформации самих долей меняются незначительно (Рис. 6А-В). Поскольку доли соединены только двумя цепями, последние служат гибким шарниром между жесткими долями, конформация которых стабилизируется множеством контактов. Такой механизм активации позволяет избежать высокого энергетического барьера между состояниями.
Стягивание долей лиганд-связывающего центра является, по-видимому, ключевым моментом. Анализ комплексов, образуемых полными агонистами, частичными агонистами и конкурентными антагонистами показал корреляцию между действием лиганда и степенью стягивания долей (Hogner et al., 2002; 2003). Наибольшее стягивание наблюдается при связывании полных агонистов, а наименьшее - при связывании антагонистов (Рис. 6Г-Е). То есть вероятность активации рецептора при связывании лиганда пропорциональна стягиванию долей связывающего центра. К сожалению, дальнейшие стадии процесса активации остаются неясными. Каким образом стягивание долей связывающего центра приводит к активации канала -неизвестно,
В ходе всей работы структуры калиевых каналов использовались в качестве шаблонов или приближений первого уровня при исследовании каналов глутаматных рецепторов. Поэтому имеет смысл рассмотреть эти структуры более подробно.
Первая структура калиевого канала в атомарном разрешении была опубликована в работе Doyle et al. (1998). Ионный канал KcsA, активируемый при низких рН, был кристаллизован в закрытом состоянии. Рентгеновская структура собственно каналообразующего домена состоит их четырех идентичных субъединиц по 97 аминокислот, окружающих центральную пору канала (Рис. 7). В каждой субъединице можно выделить «внешнюю спираль» (outer helix), «спираль поры» (pore helix) и «внутреннюю спираль» (inner helix). Наиболее узкую часть поры (селективный фильтр) образует последовательность TVGYG, высоко консервативная в семействе калиевых каналов. Атомы кислорода главной цепи этих остатков обращены непосредственно в пору и образуют кислородные кольца, формирующие правильные координационные связи с атомами калия, расположенными по оси канала между этими кольцами (Рис. 8).
Следует отметить, что атомы калия в селективном фильтре полностью лишены гидратной оболочки и непосредственно взаимодействуют со стенками канала Это сильное взаимодействие и обеспечивает селективную проницаемость канала для ионов калия. Структура селективного фильтра дополнительно стабилизируется водородными связями как внутри отдельной субъединицы, так и между субьединицами
Внутренние спирали, образующие выстилку поры, имеют значительный радиальный наклон. Во внутриклеточной части эти спирали сходятся вместе, образуя связку (bundle) с очень небольшим внутренним диаметром (Рис. 7А и В). В отличие от селективного фильтра, это сужение выстлано гидрофобными группами. В таком сужении дегидратация иона невозможна, так как контакты с молекулами воды не могут быть замещены контактами с полярными группами в стенке канала. Следовательно, сужение, образованное связкой внутренних спиралей, представляет собой закрытые ворота канала. Между воротами и селективным фильтром имеется свободное пространство округлой формы примерно 12 — 15 Ав диаметре. В этой полости может помещаться органический лиганд среднего размера, но при закрытых воротах покинуть канал он не может. Такое положение лиганда, когда он входит в открытый канал, а после его закрытия остается внутри, называется «ловушкой». Эффект ловушки был предсказан Клэем Армстронгом (Armstrong, 1972) на основании электрофизиологических данных.
Активация и блокада никотиновых холинорецепторов дикатионными производными адамантана
Характер водородных связей, найденных при помощи МСМ, сильно зависел от структурных модификаций филантотоксинов, и их замыкание приводило к формированию существенно разных пространственных структур. Вдобавок, у одной и той же молекулы могло, согласно нашим расчетам, существовать несколько схем водородных связей. Например, для PhTX-343 было найдено две примерно равновероятных системы водородных связей, показанные на рис. 24Б. При реализации системы (1) аминогруппа Р остается свободной, и молекула принимает характерный вид «голова+хвост». «Хвост», образованный полиаминной цепочкой, всегда принимает вытянутую конформацию, обусловленную отталкиванием аминогрупп. При образовании двух водородных связей между карбонильными кислородами и протонами ос аминогруппы линейная цепь молекулы пересекает саму себя под прямым углом и образует структуру, напоминающую эфес средневековой шпаги. В этой конформации а аминогруппа и полярные OC-NH группы находятся внутри «головы», поверхность которой становится, таким образом, гидрофобной. В конформации «голова+хвост» молекула PhTX-343 очень похожа на несимметричные дикатионные соединения (Рис. 24В). Это сходство общих форм молекул и расположения функциональных групп объясняет сходство их действия на открытый канал холинорецептора. При системе (2) молекула складывается практически пополам, при этом карбонильные атомы кислорода взаимодействуют с аминогруппой а, а кислород гидроксильной группы - с аминогруппой (5.
Система внутримолекулярных водородных связей (1) характерна практически для всех производных филантотоксина. Ближайшая к «голове» аминогруппа вовлекается в систему водородных связей. Например, у PhTX-83 а аминогруппа заменена на метиленовую группу. В этом случае водородные связи формируются с аминогруппой, соответствующей р аминогруппе PhTX-343. «Голова» становится массивнее, а «хвост» короче. Пространственная структура этой молекулы оказывается похожа на такие классические блокаторы каналов холинорецепторов, как QX-222 и трифенилметилфосфоний, имеющие одну заряженную группу, расположенную близко к гидрофобной голове. Если же а и р аминогруппы в молекуле PhTX-343 заменить метиленовими группами, по получившееся соединение РпТХ-(12) оказывается монокатионом. В этом случае замыкание внутримолекулярных водородных связей с единственной оставшейся терминальной аминогруппой приводит к образованию свернутой структуры, не имеющей свободных аминогрупп для взаимодействия с полярными группами в стенке канала (рис. 24В). Таким образом, замещение аминогрупп в молекуле PhTX-343 на мстиленовые группы не просто приводит к уменьшению заряда и увеличению гидрофобности, но вызывает изменение информационных свойств и общей формы молекулы. Именно такие качественные изменения могут лежать в основе парадоксов структурно-функциональных отношений.
Наличие внутримолекулярных водородных связей в молекулах филантотоксинов было предсказано нами в модельных экспериментах. Прямых доказательств существования этих водородных связей в настоящее время не существует. Расчет структур проводился без учета влияния локального окружения, при диэлектрической постоянной, равной единице. Очевидно, что в полярном растворителе, таком как вода, вероятность замыкания внутримолекулярных водородных связей должна быть существенно ниже. Вообще, конформация, в которой полярные группы спрятаны внутрь головы с гидрофобной поверхностью, в воде не должна быть энергетически оптимальна. Для проверки этого утверждения МСМ расчет был проведен для PhTX-343 с учетом влияния водного окружения. Как и следовало ожидать, вероятность водородных связей в водном окружении оказалось существенно ниже. Однако 89% полученных низкоэнергетических конформеров сохраняют по крайней мере одну водородную связь. То есть результаты расчета с учетом водного окружения не противоречат рабочей гипотезе (Tikhonov et al., 2000).
Другие элементы локального окружения, например находящиеся в растворе ионы, также могут влиять на конформации таких гибких соединений, как филантотоксины. Однако учет влияний подобного рода сложен и неоднозначен. Проведенные расчеты выявили внутренние, свойственные самим молекулам филантотоксинов конформационные характеристики. К тому же, нас интересовали конформации филантотоксинов в порах ионных каналов, где локальное окружение существенно отлично от водного. Все имеющиеся на сегодняшний день данные, в том числе и по каналу никотинового холинорецептора, свидетельствуют, что значительная часть поры выстлана гидрофобными группами. Практически все каналоблокаторы являются «гидрофобными ионами», то есть имеют и заряженные и гидрофобные группы, причем последние не менее важны для связывания в канале, чем первые. Сходство рассчитанных структур филантотоксинов, блокирующих открытый канал холинорецептора (PhTX-343, PhTX-83) с классическими каналоблокаторамн говорит в пользу существования внутримолекулярных водородных связей.
Построение модели ионного канала никотинового холинорецептора Теоретический расчет только тогда имеет ценность, когда позволяет объяснить имеющиеся экспериментальные данные. Если наша гипотеза о внутримолекулярных водородных связях в молекулах филантотоксинов правильна, на ее основе должны получить объяснение парадоксы структурно-функциональных отношений при блокаде филантотоксинами никотинового холинорецептора. Для этого исследования была построена модель канала, аналогичная описанной ранее (Tikhonov and Zhorov, 1998). Поскольку большинство имеющихся экспериментальных данных было получено на холинорецепторах мышечного типа, в новой модели были заложены последовательности агРЗє субъединиц (рис. 25). Второй особенностью модели было включение Ml сегментов. В предыдущей модели, состоящей только из М2 сегментов, эти сегменты расходились между собой в более широкой, обращенной вне клетки, части. Поскольку эти щели в первоначальной модели ничем заполнены не были, модель не могла описывать связывание лигандов в данной области. Во время создания первоначальной модели, имевшиеся вычислительные мощности не позволяли создать более полную модель. Точных данных о вторичной структуре Ml сегментов не имеется. Наиболее вероятно, что подобно большинству трансмембранных сегментов, они имеют спиральное строении. Однако имеются данные (Zhang and Karlin, 1997) что Ml спирали имеют нарушения в N-конце. По причине отсутствия точных данных, Ml сегментам первоначально была придана альфа-спиральная геометрия. Ориентация спиралей была выбрана так, что остатки в положениях 2, 4-6 и 9 были обращены внутрь поры канала. Доступность этих остатков со стороны поры канала была определена методом цистеинового сканирования (Akabasand Karlin, 1995),
Построение модели ионного канала никотинового холинорецептора
Согласно описанной выше модели, блокаторы открытого канала связываются в области между Экваториальным и Сериновым кольцами, а блокаторы закрытого канала — между Валиновым и Внешним Лейциновым кольцами. Из различия механизмов действия лигандов, связывающихся с этими сайтами, следует, что более глубокий сайт доступен только в открытом состоянии канала, а доступность поверхностного сайта не зависит от состояния рецептора. Таким образом, воротный механизм канала должен быть расположен в средней части канала.
Данный вывод, полученный из сопоставления результатов модельных и экспериментальных данных, согласуется с гипотезой Найджела Анвина о том, что остатки лейцина в Экваториальном кольце являются запирающим элементом воротного механизма канала (Unwin, 1995). Мутации этих лейцинов существенно влияют на активацию канала холннорецептора (Filatov and White, 1995; Labarca et al., 1995). Однако эта гипотеза не согласуется с данными, полученными группой Артура Карлина. Методом цистеинового сканирования было показано, что большого изменения ориентации М2 сегментов при активации канала не происходит и что даже заглубленное Треониновое кольцо остается доступным для реагентов в закрытом состоянии канала (Wilson and Karlin, 1998). В основе этого противоречия лежит предположение о стерическом механизме активации канала. Если в закрытом состоянии просвет канала перекрыт, то органические реагенты, так же как неорганические катионы, не должны проходить через него. Однако хотя стерическая гипотеза проста и привлекательна, она не является экспериментально доказанной. Условия прохождения органических и неорганических катионов через узкие части ионных каналов существенно различны. Для реагентов, используемых при цистеиновом сканировании, стерические размеры сужения являются критическими. Для неорганических катионов, имеющих относительно плотную гидратную оболочку, наиболее важными являются условия дегидратации в узкой части канала. Несмотря на маленький размер самого иона, его гидратная оболочка превосходит размеры широко используемого реагента MTSET. Неорганический ион может проходить сквозь гидрофильные сужения, где контакты с молекулами воды могут быть заменены на контакты с нуклеофильными группами в канале. Рентгеноструктурные данные о строении калиевых каналов дают наглядный тому пример. В гидрофобных сужениях «сброс» гидратной оболочки энергетически невыгоден, поэтому органический катион, подобный MTSET, может проникать через гидрофобные сужения, недоступные для неорганического катиона.
Мы предположили, что именно такое гидрофобное сужение формируется боковыми цепями остатков лейцина Экваториального кольца в закрытом канале холинорецептора. Экваториальное кольцо расположено в нашей модели на участке излома М2 спиралей, обладающем повышенной гибкостью вследствие разрыва части спиральных водородных связей. Был проведен специальный МСМ расчет возможных конформаций участка излома. В качестве начальной геометрии была использована модель, описанная в работе (Tikhonov and Zhorov, 1998). При расчете рандомизировались торсионные углы главных и боковых цепей в области между Сериновым и Валиновым кольцами. Стабильность остальной части модели обеспечивалась пространственными ограничителями, приложенными к С-альфа атомам аминокислот. Минимум энергии был достигнут за 22000 минимизаций. В пределах 10 ккал/моль от минимума было найдено 245 конформаций. Вследствие независимого характера рандомизации в каждой из субъединиц, в большинстве этих структур конформаций М2 сегментов в разных субъединицах были различны. Большинство из этих конформаций распадаются на две группы по характеру водородных связей на участке излома. В 77 структурах сохраняются водородные связи, между кислородами главной цепи остатков в положениях 6 и 7 и аминогруппами остатков 10 и 11, характерные для альфа-спирали. В 52 структурах наблюдаются водородные связи 3 ю спирали - между остатками 6, 7 и 8 и остатками 9, 10 и П. В белках спирали Зюменее стабильны и редко включают более двух витков. Однако участки Зю спиралей часто встречаются на концах классических альфа-спиралей. Поскольку число аминокислот на один виток различается в альфа и Зю спирали, ориентация остатков лейцина Экваториального кольца различна: при реализации альфа-спиральных связей боковые цепи этих лейцинов обращены в пространство между спиралями, а при реализации связей Зю спирали они смотрят в пору. В модели открытого канала, описанной выше, были альфа-спиральные связи.
Для создания модели закрытого канала водородные связи Зю спирали на участке излома были закреплены специальными ограничителями, и был проведен еще один МСМ расчет, в котором рандомизировалмсь только боковые цепи остатков участка излома. Полученная модель закрытого канала представлена на рис. 32Б. Видно, что остатки лейцина Экваториального кольца ориентированы внутрь поры, однако не закрывают ее полностью. Для этой модели были рассчитаны энергетические профили этидиума и PhTX-343. Сопоставление профилей данных соединений в моделях открытого и закрытого канала дано на рис. ЗЗА. Для обоих блокаторов профили существенно различаются в области между Экваториальным и Сериновым кольцами. Для этидиума энергетический барьер сдвинут на 12 А во внеклеточную сторону по сравнению с профилем в открытом канале. Профиль в закрытом канале не имеет характерного минимума. Поскольку остатки лейцина Экваториального кольца в модели закрытого канала обращены вовнутрь поры и существенно сужают ее, молекула этидиума не способна проникнуть глубоко в канал и достичь Серинового кольца.
Поскольку полиаминный «хвост» молекулы PhTX-343 имеет небольшое сечение, для него проникновение вглубь канала не меняется значительным образом. Поэтому в закрытом канале, так же как и в открытом, энергетический барьер находится на уровне Треонинового кольца. Однако минимум энергии между Экваториальным и Треониновым кольцами имеет заметно меньшую глубину в модели закрытого канала. Причина этого различия в разной доступности кислородрв главной цепи остатков Серинового кольца. В открытом канале эти атомы не вовлечены в систему водородных связей. Они обращены внутрь поры и образуют нуклеофильное кольцо как раз на входе в узкую часть канала. Электростатическое взаимодействие с этим кольцом вносит существенный вклад в энергию связывания PhTX-343. В модели закрытого канала эти атомы кислорода участвуют в водородных связях спирали Зю и экранированы гидрофобными боковыми цепями лейцинов Экваториального кольца. Они недоступны для взаимодействия, что и объясняет меньшую энергию связывания PhTX-343 в модели закрытого канала. Таким образом, для обоих соединений, блокирующих открытый канал холинорецептора, энергетические профили предсказывают более эффективное связывание в модели открытого канала.
![Строение и изменчивость соединительно-тканного остова передней брюшной стенки людей по данным ультразвукового исследования [Электронный ресурс]](/i/i/4500/211959.png "Строение и изменчивость соединительно-тканного остова передней брюшной стенки людей по данным ультразвукового исследования [Электронный ресурс] Илларионова Анна Вячеславовна")
