Введение к работе
Актуальность проблемы. Глутамат – это наиболее распространенный возбуждающий медиатор в центральной нервной системе позвоночных животных (Curtis et al., 1959). Свое быстрое постсинаптическое действие он опосредует через ионотропные глутаматные рецепторы, принадлежащие к суперсемейству лиганд-управляемых ионных каналов (Dingledine et al., 1999).
Чрезмерная активация ионотропных глутаматных рецепторов вовлечена во многие патологические состояния (Lipton & Rosenberg, 1994). К их числу относятся, например, болезни Паркинсона (Johnson et al., 2009) и Альцгеймера (Koutsilieri & Riederer, 2007), глаукома (Seki & Lipton, 2008). При шизофрении, напротив, наблюдается пониженная активность NMDA рецепторов (Stone, 2009). К настоящему моменту известно множество блокаторов этих ионных каналов, однако их применение в клинической практике затруднено из-за серьезных побочных эффектов у большинства соединений. Действие каналоблокаторов характеризуется не только величиной активности, но и рядом особенностей механизма взаимодействия с каналом-мишенью и внешними условиями, такими как ионный состав, pH среды, потенциал на мембране (Hille, 2001). Соответственно и поиск клинически толерантных препаратов отнюдь не сводится к поиску наиболее активных соединений. Например, единственный используемый в клинике блокатор NMDA рецепторов мемантин наиболее активным не является. Считается, что клиническая толерантность мемантина определяется такими особенностями его механизма действия, как быстрая кинетика и частичная ловушка (Chen & Lipton, 2006).
Известно, что блокада NMDA рецепторов 9-аминоакридином (9АА) осуществляется по механизму «foot-in-the-door». Закрытие ионного канала в этом случае может происходить только после диссоциации блокатора. К настоящему моменту остается до конца не выясненным вопрос о структурных детерминантах, определяющих такой характер взаимодействия 9АА с воротным механизмом NMDA рецепторов. Недавно было показано, что 9AA и его трициклические производные способны блокировать не только NMDA, но и AMPA рецепторы (Ким и др., 2007). При этом не наблюдались структурно-функциональные отношения, характерные для классических блокаторов AMPA рецепторов (Bolshakov et al., 2005). В работе было проведено подробное исследование механизмов действия 9АА и ряда его трициклических производных на AMPA и NMDA рецепторы.
Такое исследование представляется важным сразу с нескольких сторон. Во-первых, блокаторы являются ценным инструментом для исследования структуры и механизмов функционирования каналов-мишеней. Так, из сопоставления структурно-функциональных отношений в рядах блокаторов можно получить детальные сведения о строении участков их связывания в канале. Во-вторых, применение каналоблокаторов позволяет выявить роль конкретных каналов в различных процессах. Если же действие блокатора зависит от внешних условий, то его использование дает возможность определить те физиологические или патологические процессы, при которых эти условия реализуются. И, наконец, выявление фундаментальных связей между молекулярными механизмами блокады каналов и действием блокаторов в физиологических и патологических условиях может позволить предложить соединения-прототипы, которые наиболее перспективны для дальнейшей работы по созданию нейропротекторов.
Цель исследования. Изучить механизм действия трициклических соединений на ионотропные глутаматные рецепторы NMDA и AMPA подтипов.
Конкретные задачи исследования.
-
Разработать набор критериев, позволяющий определить характер взаимодействия блокаторов с воротным механизмом NMDA рецепторов.
-
Выявить структурные детерминанты, определяющие принадлежность 9АА к «foot-in-the-door» блокаторам NMDA рецепторов.
-
Исследовать зависимость блокирующего действия трициклических соединений на Ca2+-проницаемые и Ca2+-непроницаемые AMPA рецепторы от потенциала.
-
Сравнить действие трициклических соединений на АМРА и NMDA рецепторы.
Научная новизна. В работе впервые был подробно проанализирован механизм действия ряда трициклических соединений, производных 9АА, на NMDA рецепторы. Систематический анализ влияния внесенных в структуру исходной молекулы изменений на механизм действия позволил выявить одну из ключевых детерминант, определяющих принадлежность 9АА к группе «foot-in-the-door» блокаторов. Было показано, что трициклические производные с плоской трехмерной структурой сохраняют «foot-in-the-door» механизм действия 9АА, в то время как вещества с «V-образной» структурой начинают проявлять ловушку.
Также в работе было впервые показано, что 9АА и его производные с плоской трехмерной структурой взаимодействуют с особым сайтом в AMPA рецепторах. Блокирующее действие этих соединений носило потенциал-независимый характер и развивалось в отсутствие агониста, что отличает их от классических потециал-зависимых блокаторов открытого канала - дикатионных производных адамантана и фенилциклогексила. Еще одним отличием от классических блокаторов явилось отсутствие выраженной избирательности по отношению к Ca2+-проницаемым AMPA рецепторам.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. При блокаде NMDA рецепторов одной из ключевых детерминант «foot-in-the-door» механизма действия 9АА является его плоская трехмерная структура.
2. Трициклические соединения с плоской структурой связываются с особым сайтом в АМРА рецепторах.
3. Сайт расположен вне поры канала и устроен похожим образом в Са2+-проницаемых и Са2+-непроницаемых AMPA рецепторах. Для связывания антагонистов с этим сайтом открытие канала не требуется.
Теоретическая и практическая значимость. Одним из следствий «foot-in-the-door» механизма действия является то, что активность таких блокаторов усиливается при увеличении концентрации агониста. То есть такие вещества могут более эффективно блокировать синаптическую передачу в патологических условиях, чем в нормальных. К сожалению, этот потенциально интересный эффект не может быть использован, поскольку 9АА обладает анти-холинэстеразным и мутагенным действием. Другие активные блокаторы NMDA рецепторов, действующие подобно 9АА, в настоящее время не известны. Мы показали, что одной из ключевых детерминант «foot-in-the-door» механизма действия этого вещества является его плоская трехмерная структура. В дальнейшем это открытие может позволить направленно синтезировать новые «foot-in-the-door» блокаторы этих ионных каналов.
При исследовании действия 9АА и его производных на AMPA рецепторы было показано, что они связываются со специфическим сайтом. Обнаружение нового класса антагонистов, имеющих механизм действия, отличающийся от описанных ранее, имеет большое значение для физиологических исследований и может способствовать появлению клинически перспективных препаратов. Антагонисты, действие которых не зависит от потенциала на мембране имеют то преимущество для защиты нейронов от повреждающего действия глутамата, что их эффект не ослабляется в том случае, когда нейрон деполяризован.
Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на 11-й и 12-й Всероссийских медико-биологических конференциях молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2008 и 2009), 11-й и 12-й Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология – Наука XXI века» (Пущино, 2007 и 2008), Международной школе «Contemporary problems of neurobiology: molecular mechanisms of synaptic plasticity» (Казань, 2007) и Международной научной конференции «Ионные каналы: структура и функции» (Санкт-Петербург, 2009)
Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи в реферируемых журналах и тезисы 6 докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 130 источников. Работа изложена на 102 страницах машинописного текста, иллюстрирована 4 таблицами и 35 рисунками.
