Введение к работе
Актуальность работы. Изменение интенсивности выделения медиатора из нервного окончания является эффективным способом обеспечения синаптической пластичности [Miller, 1998]. Один из конкретных механизмов, контролирующих нейросекрецию, связан с активацией пресинаптических рецепторов медиаторами и комедиаторами. В нервно-мышечном синапсе медиатор ацетилхолин (АХ), выделившийся в ходе предшествующей активности или в неквантовой форме, активирует пресинаптические холинорецепторы, а освобождающийся совместно с ним комедиатор АТФ - P2Y рецепторы нервной терминали [Giniatullin, Sokolova, 1998]. Известно, что как АХ, так и АТФ угнетают секрецию медиатора из двигательного нервного окончания [Van der Kloot, 1993,1997; Giniatullin, Sokolova, 1998; Sokolova et al., 2003]. Более того, аналогичным эффектом обладает и аденозин, который является продуктом деградации АТФ [Meriney, Grinnell, 1991; Redman, Silinsky, 1994; Sebastiao, Ribeiro, 2000; Silinsky, 2004]. Установление способности этих агонистов угнетать квантовую секрецию поднимает вопрос о том, какое влияние на выделение медиатора они оказывают при их совместном действии. Такая постановка вопроса оправдана тем, что в литературе есть указания на то, что пресинаптические пуриновые рецепторы в нервно-мышечном синапсе функционально связаны с ХР [Hamilton, Smith, 1991; Salgado et al., 2000; Oliveira et al., 2002]. Кроме того, показано, что агонисты холинорецепторов, активируя постсинаптическую мембрану, стимулируют освобождение аденозина из мышечного волокна [Pitchford et al., 1992]. Это дает основание предполагать, что пресинаптический эффект холиномиметиков может быть не прямым, а опосредованным через систему пуринорецепторов. Таким образом, решение вопроса о взаимодействии холинергической и пуринергической систем регуляции позволит, с одной стороны, ближе подойти к пониманию физиологической роли пресинаптических ауторецепторов, а с другой - более детально представить молекулярный механизм модуляции процесса выделения квантов медиатора.
Одним из подходов для решения вопроса о механизмах действия и возможной связи этих рецепторных систем является исследование влияния экзогенных холиномиметиков и пуринов на спонтанное квантовое освобождение медиатора. Спонтанная квантовая секреция АХ, отражающая работу ,нейросекреторного аппарата в покое, является достаточно удобной моделью для изучения регуляции неиросекреции, поскольку она не осложнена последствиями изменения электрогенеза нервной терминали при прохождении нервного импульса. Таким образом, исследование спонтанной квантовой секреции медиатора дает; возможность наблюдать изменение работы нейросекрёторного аппарата в присутствии ХМ и пуринов на практически интактном нервно-мышечном препарате. Это позволяет приблизиться, с одной стороны, к установлению процессов, участвующих в непосредственном осуществлении выброса квантов медиатора, а с другой - к выяснению способов регуляции функционального состояния нервного окончания.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось изучение молекулярного механизма модуляции процесса спонтанной квантовой секреции медиатора из двигательных нервных окончаний агентами, активирующими пресинаптические холино- и пуринорецепторы и исследование возможности взаимодействия этих рецепторных систем.
В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
1. Изучить зависимость степени угнетения спонтанной секреции медиатора
экзогенными пуринами и аналогом ацетилхолина карбахолином от дозы
агонистов.
Для выявления наличия синергизма или антагонизма эффектов карбахолина, АТФ и аденозина исследовать их влияние на спонтанную квантовую секрецию медиатора при их совместном действии.
Установить тип пресинаптических пуриновых и ацетилхолиновых рецепторов, контролирующих частоту МПКП и выяснить роль G-белков в реализации их угнетающих эффектов.
Используя специфические блокаторы пуриновых и холинорецепторов, проверить гипотезу о том, что снижение частоты МПКП под действием холиномиметиков является следствием выделения из мышечных волокон эндогенного аденозина.
5.Исследовать действие карбахолина и пуринов на вход Са в нервное окончание и его внутриклеточный метаболизм.
Положения, выносимые на защиту.
Активация пресинаптических ацетилхолиновых и пуриновых рецепторов угнетает процесс спонтанной квантовой секреции медиатора из двигательных нервных окончаний. Совместное действие агонистов М2 холино- и А1 пуринорецепторов не приводит к развитию аддитивного эффекта. Предварительная активация аденозиновых рецепторов вызывает окклюзию метаболических путей, реализующих пресинаптический эффект холиномиметиков.
Угнетение спонтанной квантовой секреции медиатора в нервно-мышечных синапсах лягушки, реализуемое пресинаптическими А1 и М2 рецепторами, опосредовано активацией G-белков как чувствительных, так и нечувствительных к действию коклюшного токсина, не связано с изменением интенсивности входа кальция в нервное окончание, а является следствием снижения его эффективности в процессе экзоцитоза везикул.
Научная новизна. В работе впервые показана неаддитивность пресинаптического угнетающего действия агонистов пуриновых и АХ рецепторов аденозина и карбахолина на спонтанную секрецию медиатора в нервно-мышечном соединении лягушки. Выявлено, что оно не связано с действием агентов непосредственно на рецепторные структуры друг друга, как это в ряде случаев показано для ионотропных никотиновых холинорецепторов
и рецепторов АТФ [Searl, Silinsky, 1998], а также с активацией карбахолином выброса эндогенного аденозина. Показано, что карбахолин и аденозин оказывают угнетающий эффект, влияя на стадии экзоцитоза медиатора, следующие за входом Са2+ в нервную терминаль.
В экспериментах с подведением холиномиметиков непосредственно к двигательному нервному окончанию показано, что регуляция ими спонтанной квантовой секреции связана с активацией пресинаптических М2 холинорецепторов.
Научно-практическая ценность. Полученные данные позволяют более глубоко понять важную роль холинергической и пуринергической рецепторных систем в модуляции квантовой секреции медиатора из двигательного нервного окончания. Помимо выявления механизмов действия агонистов пресинаптических пуриновых и АХ рецепторов, данная работа свидетельствует об их взаимодействии в процессе регуляции спонтанной секреции. Это взаимодействие необходимо учитывать, при анализе физиологической роли ауторецепторов, поскольку в нервно-мышечном соединении обе исследуемые модуляторные системы функционируют одновременно.
Таким образом, данная работа помогает приблизиться к пониманию внутриклеточных механизмов модуляции квантовой секреции медиатора и расширить представления о функционировании периферического синапса позвоночных, где существует несколько путей регуляции секреции медиатора, что обеспечивает высокую пластичность синаптического аппарата in vivo.
Апробация работы. Основные результаты были доложены и обсуждены на Итоговых научных конференциях КИББ 'КазНЦ РАН (2003, 2004, 2005), Международной летней Школе-семинаре "Pharmacology of Synaptic Transmission in the Nervous System" (Киев, Украина, 2002), 7-й Финско-Российской Зимней Школе "Neuroscience: 3rom molecules to brain functions" (Финляндия, 2003), VII Пущинской Международной Школе-Конференции "Биология - наука 21-го века" (Пущино, Россия, 2003), 10-й Конференции Молодых Нейробиологов (Триест, Италия, 2003), Международном Симпозиуме "Neuron Differenciation and Plasticity-Regulation by Intercellular Signals" (Москва, Россия, 2003)' XI Всероссийской Конференции "Структура и Динамика Молекулярных Систем "Яльчик-2004" (Россия, 2004), 4-м FENS Форуме Европейских Нейронаук (Лиссабон, Португалия, 2004), Международной школе по Нейронаукам IBRO (Ялта, Украина, 2004),. Международной школе по Физиологии Клетки "Transport Mechanisms Across Cell Membranes: Channels and Pumps" (Санкт-Петербург, Россия, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 5 статей в российских и зарубежных изданиях.
Структура и объем диссертации. Диссертация объемом 141 страница состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и указателя цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 351 источник, из них 344 зарубежных автора. Диссертация иллюстрирована 26 рисунками.
