Роль внутриклеточных Ca2+-буферов в регуляции секреции медиатора Скитева, Ольга Игоревна

Введение к работе

Актуальность работы.

Роль кальция как регулятора синаптической передачи в химических синапсах находится в центре внимания современной физиологии (Neher, 2008; Kyoung et al., 2011). Кальций может одновременно поступать в терминаль из разных вне- и внутриклеточных источников во время активности синапса. Параметры возникающих при этом внутриклеточных Са²⁺-сигналов (т.н. Са²⁺-доменов) находятся под контролем специальных молекул – Са²⁺-буферов (, , 2005; Nigli, Shirokova, 2007).

В нервных терминалях описаны эндогенные Са²⁺-связывающие белки, различающиеся Са²⁺-емкостью, афинностью, скоростью связывания и высвобождения ионов кальция (Schwaller, 2010). Их роль заключается в пространственно-временном разграничении Са²⁺-доменов, обеспечении их избирательного действия на множество мишеней. В первую очередь это касается прицельного воздействия различных Са²⁺-доменов на Са²⁺-сенсоры экзоцитоза везикул, Са²⁺-зависимые канальные и ферментные системы, вовлеченные в регуляцию секреции медиатора (Urbano et al., 2001; Rozov et al.,2001; Blatow et al., 2003; D'Angelo et al., 2005; Muller et al., 2007; Eggermann et al., 2012). Реальный спектр функциональных возможностей Са²⁺-буферов как регуляторов Са²⁺-сигналов и секреции медиатора остается малоизученным. В связи с этим, в последние годы широко используется нагрузка терминалей синапсов экзогенными Са²⁺-буферами. Наиболее известны ВАРТА (бис-(о-аминофенокси)этан-N,N,N',N'-тетра-ацетиловая кислота) и EGTA (этиленгликоль бис-(бета-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетраацетиловой кислоты), представляющие собой органические полианионные молекулы, имитирующие работу эндогенных быстрых и медленных Са²⁺-связывающих буферных белков (Tsien, 1980; Bortolozzi et al., 2008). Оба буфера, имея одинаковую емкость и высокое сродство к кальцию, различаются по скорости связывания кальция. Так, ВАРТА, т.н. «быстрый» Са²⁺-буфер, обладает в 100 раз более быстрой, чем EGTA, кинетикой связывания кальция (Rozov et al., 2001). Соответственно, ВАРТА преимущественно редуцирует быстрые локальные подъемы уровня Са²⁺, т.н. «Са²⁺-нанодомены», влиящие на экзоцитоз везикул, расположенных в десятках нанометров от источника Са²⁺. EGTA же, как более медленный буфер, эффективен в редукции «Са²⁺-микродоменов», действующих на везикулы с больших расстояний - порядка долей микрона (Neher, 1998; Augustine et al., 2003). В последние годы, в исследованиях центральных синапсов ВАРТА и EGTA успешно используются как инструмент для выяснения зависимости механизмов выброса медиатора от Са²⁺-сигналов разного типа и генеза (Blatow et al., 2003; Felmy et al., 2003; Scott, 2007).

Такого рода исследования на нервно-мышечных синапсах мыши до сих пор малочисленны и противоречивы (Kijima, Tanabe, 1988; Robitaille et al., 1993; Зефиров, Мухамедьяров, 2004). Остается не ясным, какой тип Са²⁺-сигналов формируется и регулирует секрецию АХ при входе Са²⁺ по Са²⁺-каналам P/Q-типа, L-типа, каналам рианодиновых рецепторов (РиР), а также в какой мере Са²⁺-буферы способны модифицировать эти Са²⁺-сигналы и вносить тем самым свой вклад в регуляцию секреции медиатора. Изучению этих актуальных вопросов и была посвящена данная работа.

Цель и задачи работы.

Целью работы было исследовать способность быстрого и медленного экзогенных Са²⁺-буферов (ВАРТА и EGTA, соответственно) избирательно модифицировать процесс секреции АХ в нервно-мышечных синапсах мыши при вовлечении в работу различных пресинаптических Са²⁺-входов. В связи с поставленной целью, в работе решались следующие конкретные задачи:

1. Охарактеризовать дозо-зависимость действия быстрого и медленного Са²⁺-буферов ВАРТА и EGTA (1-100 мкМ) на параметры вызванного выброса АХ, регистрируемого в виде потенциалов концевой пластинки (ПКП)) при одиночной и ритмической активности синапсов и входе кальция в терминали по потенциал-зависимым Са²⁺-каналам P/Q-типа;

2. Исследовать способность ВАРТА и EGTA влиять на изменения квантового состава (КС) ПКП, вызываемые входом кальция по пресинаптическим потенциал-зависимым Са²⁺- каналам L-типа, расторможенным с помощью S(-) ВAY К 8466;

3. Сопоставить способность ВАРТА и EGTA избирательно модифицировать изменения КС ПКП, вызываемые усилением выброса кальция из Са²⁺-депо терминалей под действием активаторов рианодиновых рецепторов (РиР) – кофеина и рианодина;

4. Исследовать феномен увеличения амплитуды миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПКП) под действием кофеина и рианодина, понять роль ВАРТА, EGTA и определенных Са²⁺-зависимых ферментов в этом процессе.

Положения, выносимые на защиту.

5. В исследованном диапазоне концентраций (10-100 мкМ) EGTA более эффективно, чем ВАРТА, подавляет акты одиночных выбросов медиатора. ВАРТА проявляет аналогичную активность только при сниженном уровне кальция в наружной среде.

6. ВАРТА избирательно и дозо-зависимо предотвращает начальное облегчение передачи в ритмических залпах ПКП с частотой 20-50 Гц, а также – возрастание облегчения при выбросе депонированного кальция под действием кофеина.

7. Возрастание амплитуды МПКП под действием рианодина и кофеина сопряжено с Са²⁺-зависимым увеличением размера кванта медиатора, происходит с участием СаМКII и избирательно редуцируется с помощью EGTA, но не ВАРТА.

Научная новизна полученных результатов

Установлен ранее не известный факт, что EGTA избирательно и эффективно подавляет акты одиночного вызванного выброса медиатора АХ. Впервые показано, что Са²⁺-зависимый процесс начального облегчения при ритмической работе синапсов избирательно чувствителен к действию быстрого буфера ВАРТА. Выявлена ранее не известная способность EGTA разобщать сопряжение между входящим по L-типу Cа²⁺-каналов кальцием и активацией РиР, приводящей к выбросу депонированного кальция и усилению секреции медиатора. Именно это сопряжение - основная причина потенцирования передачи при активации Са²⁺-каналов L-типа. Впервые получены данные о способности агонистов РиР (кофеина и рианодина) вызывать Са²⁺-зависимое увеличение размера кванта АХ, сопряженное с активацией СаМКII. Впервые показана способность EGTA, но не ВАРТА, полностью предотвращать этот Са²⁺-зависимый прирост размера кванта АХ.

Научно-практическая значимость работы

Анализ пресинаптических эффектов ВАРТА и EGTA позволил получить научно значимую информацию о характере Са²⁺-сигналов, формируемых при работе разных Са²⁺-входов в терминали, и специфическом участии этих Са²⁺-сигналов в регуляции разных режимов секреции АХ. Показан индивидуальный вклад в вызванную секрецию квантов АХ разных типов Са²⁺-доменов – узколокальных Са²⁺-нанодоменов (редуцируемых только с помощью ВАРТА), более диффузных Са²⁺-макродоменов (редуцируемых с помощью EGTA) и тонического подъема уровня Са²⁺ (равноэффективно редуцируемого с помощью ВАРТА и EGTA).

Научный интерес представляет впервые обнаруженный факт регуляции размера кванта медиатора кальцием, выбрасываемым из Са²⁺-депо, с участием Са²⁺-зависимого фермента СаМКII.

Полученные данные могут быть использованы и в прикладном аспекте, например, при разработке путей фармакологической коррекции синаптической передачи в моторных синапсах с помощью специфических кальциевых буферных систем, или их ингибиторов.

Апробация диссертации

Результаты исследования были представлены на международной молодежной конференции «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), Всероссийской (XVI) молодежной научной конференции «Молодежь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2008), конференции с международным участием «Механизмы нервных и нейроэндокринных регуляций», посвященной памяти Т.М. Турпаева (Москва, 2009), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009), ежегодном съезде Британского Физиологического Общества «Физиология 2009» (Дублин, Ирландия, 2009). XXI съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), 7-ом Форуме Федерации Европейских Нейронаук (FENS) (Амстердам, Нидерланды, 2010), 8-ом Всемирном конгрессе Международной Организации Изучения Мозга (IBRO) (Флоренция, Италия, 2011).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в их числе 4 статьи, из них 2 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Структура и объем диссертации

Похожие диссертации на Роль внутриклеточных Ca2+-буферов в регуляции секреции медиатора

Участие н-холинорецепторов нейронального типа в регуляции секреции медиатора в нервно-мышечных синапсах мышиФедорин Василий Васильевич

Взаимодействие холинергических и пуринергических механизмов регуляции спонтанной квантовой секреции медиатора в нервно-мышечном соединении лягушкиШакирзянова Анастасия Вячеславовна

Роль холестирина мембраны в секреции медиатора и экзоцитозе синаптических везикул в двигательных нервных окончанияхТараканова, Оксана Ивановна

Роль холестерина мембраны в секреции медиатора и экзоцитозе синаптических везикул в двигательных нервных окончанияхТараканова, Оксана Ивановна

Роль циклических нуклеотидов в реализации эффектов оксида азота (II) на секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания Яковлев Алексей Валерьевич

Механизмы Ca2+-зависимого подавления секреции медиатора в новообразованных нервно-мышечных синапсах мышиБогачева Полина Олеговна

Факторы, определяющие динамику вызванной секреции медиатора в ходе длительной высокочастотной активности нервно-мышечного синапса лягушкиМинлебаев Марат Гусманович

Механизмы действия арахидоновой кислоты на секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания лягушкиЯковлева Ольга Владиславовна

Механизмы действия АТФ на секрецию медиатора из двигательных нервных окончаний холоднокровныхГришин Сергей Николаевич

Разнонаправленное действие кальция, высвобождаемого из Ca2+ -депо, на квантовую секрецию медиатораЛаптева Валентина Ивановна