Разнонаправленное действие кальция, высвобождаемого из Ca2+ -депо, на квантовую секрецию медиатора Лаптева Валентина Ивановна

Содержание к диссертации

ОГЛАВЛЕНИЕ 2

ВВЕДЕНИЕ - 5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

1. Рианодин-чувствительные кальциевые депо нейронов и нервных . _п терминален

2. Рианодиновые рецепторы 12

1. Основные характеристики рианодиновых рецепторов 12

2. Типы рианодиновых рецепторов и их представленность в нейронах и . ~ терминалях

3. Рианодип как модулятор активности рианодиновых рецепторов 15

4. Роль риаподин-чувствительных кальциевых депо в регуляции . _ секреции медиатора

5. Эффекты рианодина в моторных синапсах 17

6. Эффекты рианодина в центральных синапсах 18

3. Механизмы запуска выброса кальция из Са²⁺депо нервных терминален . 19

4. Взаимодействие выброса кальция из внутриклеточных депо с ионными _„

каналами наружной мембраны

5. Функциональные последствия опустошения кальциевых депо 22

6. Характеристика дигоксина и его эффектов 24

7. Спонтанная и вызванная секреция медиатора в нервно-мышечных __ синапсах как функция выброса депонированного кальция

1. Спонтанный выброс медиатора 30

2. Вызванное высвобождение медиатора как многоквантовый выброс ... 33

3. Особенности вызванной ритмической активности синапса 35

4. Депрессия 36

5. Облегчение 37

6. Мобилизация медиатора 40

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 42

1. Приготовление изолированного нервно-мышечного препарата диафрагмы ._

мыши

2. Внутриклеточная регистрация спонтанных и вызванных потенциалов .-
концевой пластинки

7. Метод регистрации спонтанной синаптической активности 44

8. Эксперименты на синапсах в условиях вызванной синаптической .. активности

9. Приготовление рассеченного препарата диафрагмы мыши. 44

10. Эксперименты с частичной блокадой никотиновых .<. холинорецепторов постсинаптическои мембраны d-тубокурарином

3. Статистическая обработка экспериментальных данных 46

4. Используемые в работе вещества , 47

5. Блок-схема экспериментальной установки для регистрации _д_
синаптических потенциалов

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 48

ГЛАВА I. РАЗНОНАПРАВЛЕННОЕ ДЕЙСТВИЕ РИАНОДИНА НА
РЕЖИМ СПОНТАННОЙ СЕКРЕЦИИ МЕДИАТОРА

1. Изменения средней частоты МПКП на фоне рианодина и кофеина в . „

интактных синапсах

1. Эффекты рианодина 49

2. Эффекты кофеина ., 49

2. Действие рианодина на частоту МПКП при изменении кальциевой ^

нагрузки терминален

2.1. Изменения частоты МПКП на фоне повышенной Са²⁺-нагрузки _«
терминален

2.1Л. Эффекты рианодина 52

2.2. Изменения частоты МПКП при действии рианодина на фоне ,,
деполяризации терминалей с помощью 16мМ К _нар ,.

3. Изменение частоты МПКП на фоне 16мМ К⁺_нар в <.. нормокальциевом растворе

4. Эффекты рианодина 54

5. Изменение частоты МПКП на фоне 16мМ 1С_тр в . гипокальциевом растворе

6. Эффекты рианодина 54

3. Анализ причин подавления спонтанной секреции АХ под действием ,^ рианодина

4. Влияние блокады РиР на частоту МПКП в условиях деполяризации ,-терминал и 8мМ наружного калия

5. Анализ роли кальций-активируемых калиевых каналов в реализации ,„ тормозных эффектов рианодина

6. Анализ механизмов действия рианодина на частоту МПКП на фоне 16мМ ,. наружного калия

1. Частота МПКП на фоне 16мМ К⁺_нар и блокаторов Са²⁺-каналов 64

2. Эффекты блокады РиР на фоне 16мМ К⁺,_1ар 65

3. Эффекты рианодина на фоне 16мМ К⁺_шр и блокаторов Са³⁺-каналов. 67

Заключение к главе I 69

ГЛАВА II. РАЗНОНАПРАВЛЕННОЕ ДЕЙСТВИЕ ДИГОКСИНА НА „

РЕЖИМ СПОНТАННОЙ СЕКРЕЦИИ КВАНТОВ АХ

1.Влияние оубаина на частоту МПКП , 72

4. Эффекты 1 ОнМ оубаина 73

5. Эффекты ЮОнМ оубаина 73

2.Влияние дигоксина на частоту МПКП 77

2.1. Эффекты дигоксина на фоне блокады РиР2 78

3. Влияние дигоксина на частоту МПКП при разных кальциевых нагрузках _₀

/о

термииали

6. Эффекты дигоксина при изменении частоты МПКП на фоне „~ кальциевой нагрузки 5мМ Са²⁺_нари 8мМ К⁺_[Шр

7. Влияние дигоксина на изменения частоты МПКП при деполяризации „_ с помощью увеличения наружного калия до 16мМ

Заключение к главе II 85

ГЛАВА III. РОЛЬ ДЕПОНИРОВАННОГО КАЛЬЦИЯ В РЕГУЛЯЦИИ

УРОВНЯ ВЫЗВАННОЙ СЕКРЕРЦИИ МЕДИАТОРА

1. Особенности вызванной активности моторных синапсов 87

8. Регистрация и анализ одиночных ПКП 87

9. Особенности ритмической активности моторных синапсов мыши ... 88

10. Рисунок залповой активности при частоте стимуляции 4Гц 90

11. Рисунок залповой активности при частоте стимуляции 7Гц 91

12. Рисунок залповой активности при частоте стимуляции 50Гц 91

2. Анализ действия рианодина на вызванную активность нервно-мышечных _q~
синапсов

13. Эффекты рианодина на одиночные ПКП 92

14. Эффекты рианодина при частоте залпа 4 Гц 92

15. Эффекты рианодина при частоте залпа 7Гц 94

16. Эффекты рианодина при частоте залпа 50 Гц 94

3. Изменение рисунка залповой активности на фоне предварительной . „„ блокады РиР

4. Анализ рисунков залпов при ритмической активности кураризированного . ~ . препарата

5. Изменения рисунка залпа у кураризированного препарата под действием ₁ „, активатора РиР - рианодина

6. Влияние рианодина на залповую активность на фоне блокады . _п„ низкопроводящих К⁺с_а-каналов

Заключение к главе III 109

ГЛАВА IV. ВЛИЯНИЕ ДИГОКСИНА НА АМПЛИТУДУ ПКП В
УСЛОВИЯХ ВЫЗВАННОЙ АКТИВНОСТИ СИНАПСА

1. Эффекты дигоксина на одиночные ПКП .111

2. Эффекты дигоксина в условиях ритмической залповой активности ₁₁₁ синапсов

1. Эффекты дигоксина при частоте разряда 4Гц 113

2. Эффекты дигоксина при частоте разряда 7Гц 113

3. Действие дигоксина при частоте разряда 50Гц 116

3 Воздействие дигоксина на уровень плато в залпе на фоне блокады РиР .... 118

Заключение к главе IV 123

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 125

ВЫВОДЫ 133

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 134

РАЗНОНАПРАВЛЕННОЕ ДЕЙСТВИЕ КАЛЬЦИЯ,

ВЫСВОБОЖДАЕМОГО ИЗ Са²⁺-ДЕПО,

НА КВАНТОВУЮ СЕКРЕЦИЮ МЕДИАТОРА

Введение к работе

Актуальность проблемы. Рассмотрение роли кальция как триггера и регулятора секреции медиатора является одной из центральных проблем современной синаптологии. Особый интерес вызывает чувствительность процессов секреции медиатора к кальцию, высвобождаемому из внутритерминальных Са²⁺-депо - цистерн гладкого эндоплазматического ретикулума (ГЭР) (Berridge, 1997; Балезина, 2002; Bardo et al., 2003 Verkhratsky, 2005). В терминалях синапсов описаны цистерны ГЭР, способные выбрасывать ионы кальция в аксоплазму через специальные Са²⁺-каиалы -рианодиновые рецепторы (РиР) (Peng, 1996; Narita et al., 2000; Bouchard et al., 2005; Kubota et al., 2005). Выброс депонированного Ca²⁺ через каналы РиР запускается повышением уровня кальция в аксоплазме, а также действием специфических активаторов РиР - кофеина, рианодина, дигоксина и др.. Каким образом активация РиР и выброс депонированного кальция отражается на спонтанной и вызванной секреции медиатора, остается во многом не ясным.

Известно, что наружный кальций, поступающий в терминаль по потенциал активируемым Са²⁺-каналам, усиливает вызванную и спонтанную секреции квантов медиатора (Katz, Miledi, 1970; Zucker, 1996; Neher, 1998). Выброс депонированного кальция из цистерн ГЭР синаптических терминален, также, по данным литературы, может приводить к подъему цито плазматического кальция и увеличению секреции медиатора (Fossier et al, 1999; Emptage et al.,2001). В частности, в нервно-мышечных синапсах скелетных мышц описаны пресинаптические РиР (Narita et al., 2000; Castonguay, Robitaille, 2001; Kubota et al., 2005). Их активация - при определенных условиях — может увеличивать внутриклеточный Са -сигнал, уровень спонтанной и вызванной секреции квантов ацетилхолина (АХ) (Nishimura et al.,1990; Narita et al., 2000; Emptage et al., 2001; Балезина, 2002;

6 Bouchard et al., 2005). Однако во многих возбудимых структурах - в соме нейронов, в гладко мышечных и других клетках выброс Са²⁺ из цистерн ГЭР способен играть двоякую роль: как усилителя внутриклеточного кальциевого сигнала, так и его ограничителя - путем торможения входящего в клетку потока наружного кальция (Nelson et al., 1995; Emptage et al.,2001; Liang et al., 2002; Flink, Atchison, 2003). Тормозный эффект обычно обусловлен вовлечением Са²⁺-зависимых К⁺-каналов либо инактивацией Са²⁺-каналов наружной мембраны за счет прицельного действия на них кальция, высвобождаемого из примембранных цистерн ГЭР (Nelson et al., 1995; Sah,1996; Sham,1997; Schwartz et al., 1999; Urbano et al, 2001). Какой из противоположных эффектов будет преобладать (облегчение либо торможение Са ⁺ сигнала), зависит от числа и типа активируемых РиР, потока входящего кальция и многих других причин (Kuba 1980, 1997; Sah, Mclachlan, 1991; Akita etal.,2000).

В терминалях синапсов возможность разнонаправленных воздействий на Са²⁺-сигнал и процессы секреции медиатора со стороны внутриклеточно высвобождаемого кальция до сих пор не описана. Выявление таких разных по знаку влияний расширило бы современные представления о механизмах Са²⁺-зависимой регуляции синаптической передачи.

Цели и задачи исследования. Основной целью работы было обнаружение и анализ механизмов, обеспечивающих разнонаправленные изменения интенсивности квантовой секреции АХ (ее усиление либо торможение) при выбросе ионов Са²⁺из рианодин-чувствительных Са²⁺-депо в моторных синапсах мыши.

В связи с поставленной целью в работе решались следующие конкретные задачи:

1. Исследовать изменения режима спонтанной секреции АХ путем регистрации МПКП в нервно-мышечных синапсах диафрагмы мыши, в условиях воздействия на терминали рианодииа (стимулятора выброса Са²⁺ из рианодин-чувствительных Са²⁺-депо). Сопоставить эффекты рианодина при разных режимах кальциевой нагрузки терминали, создаваемых путем градуальной калиевой деполяризации терминали и варьирования наружной концентрации кальция.

Исследовать участие разных типов кальциевых и калиевых каналов в реализации облегчающих и тормозных воздействий рианодина на частоту МПКП при разных уровнях деполяризации терминали.

Сопоставить изменения режимов спонтанной секреции квантов АХ, вызываемые разными по механизму и спектру действия активаторами РиР -рианодина (взаимодействующего с I, 2, 3-им типами РиР) и дигоксина (активатора РиР 2-го типа).

Исследовать возможности разнонаправленных изменений амплитуды и квантового состава ПКП в ритмическом залпе на фоне действия рианодина и дигоксина. Сопоставить эффекты рианодина и дигоксина в зависимости от частоты залпа и кальциевой нагрузки терминалей - у кураризированного и у рассеченного нервно-мышечного препарата диафрагмы мыши.

Новизна полученных результатов. В работе экспериментально показан важный новый факт, согласно которому выброс депонированного кальция под действием активаторов пресинаптических РиР может сопровождаться не только усилением, по и снижением уровня спонтанной либо вызванной секреции квантов АХ. Впервые описаны условия и механизмы, при которых преобладают облегчающие, либо тормозные воздействия со стороны внутриклеточно высвобождаемого кальция на выброс квантов АХ.

Показано, что кальций-индуцированный выброс депонированного кальция в терминали может «работать» как система отрицательной обратной связи, притормаживая поток наружного кальция (и прирост уровня квантовой секреции АХ) путем прицельного воздействия на низкопроводящие (чувствительные к апамину) кальций-активируемые калиевые каналы наружной мембраны терминали.

Новыми являются полученные в работе данные об участии Са²⁺-каналов L-типа в кальциевой нагрузке терминали в условиях покоя и при небольших уровнях деполяризации терминали. Впервые установлено, что вход кальция по L-типу Са²⁺ каналов может быть прицельно предназначен для активации выброса депонированного кальция из рианодин-чувствительных Са²⁺-депо.

В моторных синапсах мыши впервые описана способность дигоксина (активатора РиР 2-го типа) вызывать разнонаправленные изменения частоты МПКП, а также модулировать уровень вызванной секреции АХ в залпе. Впервые показано, что эти пресинаптические модуляторные эффекты дигоксина предотвращаются блокадой РиР.

Положения, выносимые на защиту.

В нервно-мышечных синапсах диафрагмы мыши выброс депонированного кальция из рианодин-чувствительных Са -депо может, в зависимости от условий и режима работы синапса, вызывать как облегчение, так и торможение спонтанной и вызванной секреции квантов медиатора АХ.

В реализации облегчающего действия рианодина на секрецию АХ может участвовать вход Са²⁺ по L- и PjQ-типам Са²⁺- каналов; в реализации тормозных эффектов - Са²⁺ каналы L-типа и апамин-чувствительные К⁺_Са каналы нервной терминал и.

В моторных синапсах мыши разнонаправленные изменения спонтанной секреции, сходные по условиям и характеру реализации с эффектами рианодина, могут быть вызваны дигоксином (ЗнМ), избирательным активатором РиР 2-го типа.

4. В условиях ритмической активности синапсов действие дигоксина на уровень вызванного выброса АХ имеет индивидуальный характер, лишь частично совпадающий с эффектами рианодина.

Научно-практическая значимость работы. Полученные в данной работе новые данные о способности депонированного кальция, высвобождаемого из рианодин-чувствительных Са³⁺-депо, разнонаправленно воздействовать на режим спонтанной и вызванной активности моторных синапсов существенно расширяют современные представления о существующих в терминали разных источниках кальция влияющих на выброс медиатора. Проведенная работа позволяет яснее представить место такого феномена как Са²⁺-зависимый выброс кальция в регуляции процессов секреции АХ в моторных синапсах. В результате проведенных исследований получены новые важные сведения о участии РиР разных типов и выбрасываемого через них депонированного кальция не только в контроле секреции АХ, но и активности Са²⁺-зависимых К⁺-каналов наружной мембраны. Научную ценность представляет и обнаруженный у сердечного гликозида дигоксина способность в низких наномолярных концентрациях облегчать вызванный выброс АХ в периферических синапсах мыши за счет избирательной активации пресипаптических РиР 2-го типа. Обнаруженные в работе факты эффективной модуляции режимов секреции медиатора под действием рианодина и дигоксина имеют не только общефизиологическое научное значение, по могут быть использованы и при разработке новых средств фармакологической коррекции нарушений нервно-мышечной передачи.

Похожие диссертации на Разнонаправленное действие кальция, высвобождаемого из Ca2+ -депо, на квантовую секрецию медиатора

Механизмы действия АТФ на секрецию медиатора из двигательных нервных окончаний холоднокровныхГришин Сергей Николаевич

Механизмы действия арахидоновой кислоты на секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания лягушкиЯковлева Ольга Владиславовна

Роль внутриклеточных Ca2+-буферов в регуляции секреции медиатораСкитева, Ольга Игоревна

Механизмы Ca2+-зависимого подавления секреции медиатора в новообразованных нервно-мышечных синапсах мышиБогачева Полина Олеговна

Роль холестирина мембраны в секреции медиатора и экзоцитозе синаптических везикул в двигательных нервных окончанияхТараканова, Оксана Ивановна

Роль циклических нуклеотидов в реализации эффектов оксида азота (II) на секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания Яковлев Алексей Валерьевич

Факторы, определяющие динамику вызванной секреции медиатора в ходе длительной высокочастотной активности нервно-мышечного синапса лягушкиМинлебаев Марат Гусманович

Взаимодействие холинергических и пуринергических механизмов регуляции спонтанной квантовой секреции медиатора в нервно-мышечном соединении лягушкиШакирзянова Анастасия Вячеславовна

Участие н-холинорецепторов нейронального типа в регуляции секреции медиатора в нервно-мышечных синапсах мышиФедорин Василий Васильевич

Анализ кинетики вызванной секреции квантов медиатора и ее вклада в формирование амплитудно-временных характеристик многоквантового тока концевой пластинкиГайнулов Роберт Хакимович